细胞免疫荧光步骤
免疫荧光实验步骤大全
免疫荧光实验步骤大全免疫荧光实验是一种常见的实验技术，用于检测特定抗原和抗体的相互作用。
本文将介绍免疫荧光实验的详细步骤，以供参考。
实验材料准备：- 试验样本（包括细胞或组织）- 抗原或抗体- 包含荧光素的二抗- PBS缓冲液- 荧光显微镜- 封片胶实验步骤：1. 样本制备- 如果是细胞样本，在培养皿中培养并观察细胞的形态和生长状态。
- 如果是组织样本，将组织切片并进行固定，然后反复用PBS缓冲液进行洗涤。
2. 抗原或抗体的固定- 将样本固定在载玻片上，可以使用正硫酸盐和乙醇来进行固定。
- 固定后用PBS缓冲液进行洗涤，以去除多余的固定试剂。
3. 孵育抗原或抗体- 在固定后的样本上加入适量的抗原、抗体或荧光素标记的二抗。
- 在室温下或4摄氏度下孵育一定的时间，以实现抗原和抗体的特异结合。
4. 洗涤- 使用PBS缓冲液洗涤固定后的样本，可多次洗涤以去除非特异性结合。
5. 荧光显微镜观察- 将载玻片放置在荧光显微镜上，调整荧光滤镜组合以观察荧光信号。
- 使用合适的放大倍率观察细胞或组织中特定的抗原或抗体信号。
6. 影像采集与分析- 使用相机或图像采集系统记录荧光显微镜观察到的图像。
- 使用图像分析软件对图像进行处理和分析，如测量荧光强度、定量特定抗原或抗体的表达水平等。
7. 结果和讨论- 分析实验结果，比较不同样本之间的差异。
- 讨论实验结果与研究假设的一致性，并可进行进一步的实验验证。
8. 结论- 总结实验结果，并得出相应的结论。
- 可以进一步讨论实验结果在相关领域的应用和意义。
9. 实验清理- 定期清洗和消毒实验室工作区域和仪器设备，以确保实验环境的卫生和安全。
以上是免疫荧光实验的基本步骤，每一步都需要仔细操作和控制实验条件。
在实验过程中，要注意遵守实验室安全操作规范，确保自己和他人的安全。
希望本文对您的科研工作有所帮助！。
细胞免疫荧光标记实验步骤
细胞免疫荧光标记实验步骤细胞免疫荧光标记实验是用来观察和分析细胞中的特定分子或结构的一种常用方法。
下面是一些常见的细胞免疫荧光标记实验步骤：1. 细胞培养准备:- 在无菌条件下准备所需培养基和培养器具。
- 将待标记细胞接种在培养皿中，以适当的细胞密度使其在培养基中生长。
2. 固定细胞:- 将细胞培养皿中的培养基倒掉。
- 用生理盐水或磷酸缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除未附着的细胞和培养基残留。
- 加入适当的固定液，例如4%的乙醛，固定细胞并封存其内部结构。
3. 渗透化处理:- 使用适当的渗透剂，如0.1%的Triton X-100，以打破细胞膜，使抗体能够渗透到细胞内部。
- 进行渗透化处理的时间应根据实验要求而定。
4. 抗体标记:- 制备适当的抗体和荧光染料稀释液。
- 将抗体稀释液加入到细胞上，使其与目标分子结合。
- 按照实验要求，在适当的温度和时长下孵育细胞，促使抗体与目标分子充分结合。
5. 洗涤和染色:- 用洗涤缓冲液充分洗涤细胞，以去除未结合的抗体和荧光染料。
- 使用适当的荧光染料对细胞进行染色。
如需防褪色，可以添加适当的抑制剂。
6. 显微镜观察和图像捕获:- 用适当的显微镜观察细胞，并捕获荧光图像。
- 根据需要，使用图像处理软件对图像进行分析和量化。
注意事项：- 实验前确保实验室和设备都是清洁的，并遵守实验安全操作规范。
- 涉及有害物质时，戴好个人防护用品，如实验手套和护目镜。
- 每个实验步骤的时间和条件可能因实验要求而异，需根据具体实验方案进行调整。
这些步骤提供了一般的细胞免疫荧光标记实验的大致流程，但具体实验方法还需根据实验目的和材料的特性进行优化和调整。
参考资料：[1] Smith, C. et al. ___. Cold Spring Harb. Protoc. 7, 1052–1055 (2013).[2] Manders, E. M. M. et al. FISH: ___. Cold Spring Harb. Protoc. 2006, db.rot4111 (2006).。
细胞免疫荧光步骤
方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上〔悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片〕2. 然后在 4％ PFA里面室温下固定30 分钟， PBS洗两次， 0.1%TX-100 室温下作用1－ 2 分钟使细胞膜通透。
3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器〔面积大，扁平状的，比方大的培养皿〕里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4.剪一片适宜大小的 parafilm ，在上面滴上稀释在 1％ BSA/TBS中的一抗〔稀释倍数依具体抗体而定〕，每个玻璃片 30ul 足够，把玻璃片盖在上面〔细胞面朝下〕，室温下孵育30 分钟，然后在PBS里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.最后，在载玻片加上 mountingmedium 〔大约每个玻璃片加 10ul 〕，把玻璃片放上去〔细胞面朝下〕，37度 30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7.抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。
8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次〔可以都试一下看看那种方法适宜〕。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于 rabbit 和 rat 的抗体，二抗那么是不同荧光信号标记的，我用的是 donkeyanti-rabbit-FITC〔绿〕和 donkeyanti-rat-Tex-Red〔红〕。
2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗 4 度孵育过夜比拟好，背景比拟清晰。
3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照那么分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常 donkey 血清。
5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
方法三：1. 片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购置公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤
1. 细胞一定要贴在玻片上（最好可以放入24孔板），为后面照像打基础。
细胞密度适中，大约60-75%满片即
可，否则容易脱片。
2. 取出细胞后用4%多聚甲醛固定15分钟，现用现配。
（以下各步骤切毋使玻片干燥）
3. PBS冲洗
4. 0.1%Triton作用20分钟
5. PBS冲洗
6. 10%正常血清封闭10分钟
7. 加入一抗，4度孵育过夜（找个小瓶盖将小玻片支起来，抗体就不容易溢出），还要记住“砸片”，就是抗
体从较高处落到片子上，以分布均匀。
抗体稀释度1：60，较常用！
8. PBS冲洗4次，各5分钟
9加入荧光二抗，室温30分钟。
抗体稀释度1：400，较常用！
10. 同8。
11. 90%甘油封片。
也很关键阿，多封几次才有体会。
12. 避光保存，或到显微镜下观察。
0.1%Triton和山羊血清。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光1、吸干十二孔板中每孔中的培养基，用PBS洗三次，5min/次，注意摇床要缓慢。
2、吸干PBS，每孔加200~300μl固定液，室温固定20分钟。
3、若暂时不做荧光，吸干固定液，不洗，放-30℃保存。
4、需要做时，将十二孔板取出，稍微解冻之后，加适量的PBS，用钩针抠出要PBS洗三次，5min/次。
5、吸干PBS后，每孔加1ml的5‰Triton破膜液，室温下破膜15~20分钟。
6、吸干破膜液，室温下PBS洗3次，5min/次。
7、加BSA封闭液，30~50μl/爬片，室温下封闭30min。
8、吸干BSA封闭液，不洗，加一抗（一抗用PBS稀释比例为：1：50~1:100，浓度视具体情况而定，30~50μl/爬片）4℃过夜。
注意十二孔板保持平整，以免一抗流到爬片外。
9、第二天从4℃冰箱中取出十二孔板，PBST洗3次，3min/次，然后每孔加1:50稀释的FITC，室温下避光孵育1h。
10、PBST洗3次后，DAPI染核6分钟，30μl/爬片。
染核后PBST洗3次，5min/次。
11、载玻片上滴一滴GL YCEROL封片液，即可镜下观察。
说明：①5‰Triton破膜液：例如配20μl的Triton原液用4000μlPBS稀释。
②FTIC现配现用，用PBS稀释，比例为1：50~1:75，具体浓度依据荧光亮度来调整。
耗材：1、十二孔板2块，一块要求无菌（种细胞），另一块洁净（外用漂洗爬片）。
2、外用PBS3、固定液4、细胞爬片5、避光盒6、钩针7、5‰Triton破膜液8、BSA封闭液9、一抗10、PBST11、FITC12、DAPI13、GL YCEROL封片液。
细胞免疫荧光的流程
细胞免疫荧光的流程
一、样本制备
1. 将细胞制成单细胞悬液,调整到适当的密度。
2. 将细胞悬液移到聚赖氨酸预处理的载玻片上,室温自然干燥。
二、固定
1. 用预冷的乙醇固定5分钟,去除固定液。
2. 用洗涤2次,每次5分钟。
三、孵育
1. 加入适量一抗溶液,覆盖样本,避光孵育过夜(4°或者室温)。
2. 洗涤3次,每次5分钟。
3. 加入二抗溶液,避光孵育1小时。
4. 洗涤3次,每次5分钟。
四、封片
1. 在载玻片上滴加少量抗荧光淬灭封装液。
2. 盖上盖玻片,尽量避免生成气泡。
3. 荧光显微镜下观察结果。
以上是细胞免疫荧光的基本流程。
需要根据不同的抗体和样本进行适当调整。
细胞免疫荧光的方法
细胞免疫荧光I、步骤：一、固定：PBS 5min×3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。
固定液覆盖细胞，RT 静置15min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
二、通透化：通透液覆盖细胞，RT 静置30min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
三、封闭：封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。
四、一抗孵育：一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。
4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
五、二抗孵育：FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。
37℃避光孵育<60min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
六、染核：新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
七、封片：在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。
八、镜检，4℃避光保存。
II、注：1、细胞密度要合适，状态较好。
2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。
3、完成后最好及时镜检，照相；分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。
III、试剂配制：1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，（通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。
2、通透液：0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS3、封闭液：正常山羊血清稀释于PBS；或商品化封闭液成品。
4、Hoechst：Hoechst33258即可。
5、封片剂：50%(v/v)甘油/PBS。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤第一步：样本准备1.根据实验需要，选择并培养适当的细胞系或组织样本。
2.将细胞或组织培养在适当的载玻片、孔板或离心管中。
3.使细胞或组织粘附在载玻片等表面上。
第二步：固定和渗透化处理1.使用适当的缓冲液（如甲醛）或有机溶剂（如甲醇）将细胞/组织进行固定处理。
2.在室温或低温下，将缓冲液中的固定液置于载玻片或孔板中，进行固定处理。
3.固定后，用洗涤缓冲液（如PBS）洗涤细胞/组织，去除多余的固定液。
4.在细胞内透明化的同时，保持细胞结构完整。
第三步：抗体染色1.准备合适的一抗和二抗。
一抗是特异性与待检测蛋白结合的抗体，二抗是带有荧光染料的抗体。
2.将一抗稀释到适当的浓度，并加入到载玻片或孔板中，与细胞孵育。
3.将载玻片或孔板中的一抗与细胞孵育30-60分钟，使抗体与待检测的蛋白相结合。
4.在恰当的洗涤缓冲液中洗涤载玻片或孔板，去除多余的一抗。
5.同样的方法，添加二抗到载玻片或孔板中，并孵育30-60分钟，使二抗与一抗结合。
6.再次使用洗涤缓冲液洗涤载玻片或孔板，去除多余的二抗。
第四步：显微镜观察1.利用适当的显微镜镜头，观察载玻片或孔板上的细胞，并选取合适的区域进行观察。
2.使用适当的荧光滤波片，观察细胞中的荧光信号。
3.根据实验设计的需要，进行图像记录和分析。
细胞免疫荧光实验是一种常见的实验技术，可以用于研究细胞中的蛋白质表达和定位，提供有关蛋白质在细胞内的空间分布和功能的信息。
不同的实验目的和需求可能会有一些细微的差异，因此可以根据具体的实验目的进行相应的调整或优化步骤。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光步骤细胞免疫荧光技术是一种能够检测活细胞内特定蛋白质分布的技术，常用于免疫组化分析中。
该技术重点在于使用特定抗体与荧光染料结合，达到明显的荧光信号来检测活细胞内某些蛋白质标识。
以下是细胞免疫荧光技术的主要步骤：1、培养或固定活细胞首先需要对活体细胞培养或固定。
一般选择在培养皿或载玻片上将密集的细胞生长于培养液基质中，可以在日后的荧光显微镜下更加清晰的观察细胞结构及变化。
2、组织切片或钝化在一些研究工作中，如动物实验或组织切片中，可能需要先进行组织切片或尸解固定。
组织切片需要先进行固定处理，如使用琼脂糖进行完整的埋嵌固化，然后进行蜡加热染色处理，裁切成薄片。
或者可以做成冰冻切片，操作上更为简单。
另外，钝化细胞可以使用不优化溶液，其中的表面抗原质已经被消除。
这不仅可以减少非特异性信号，而且可以提高特异性状态的细胞荧光信号。
3、细胞膜的处理在进行免疫染色之前，还需要对细胞膜进行处理。
例如，可以使用牛血清蛋白或非离子界面活性剂来堵塞非特异性的结合位点。
这可以减少非特异性抗体与未知结合物的竞争，提高特异性免疫染色的精度。
4、初级抗体与荧光染料的结合细胞内需要检测的蛋白质必须有一个感兴趣的特定蛋白质抗体。
该抗体允许特定的蛋白质标记。
将特定抗体与荧光染料结合后，允许可见光下的荧光染色信号。
此类荧光染料通常具有比较好的耐用性和较高的量子产率，如荧光色素FITC和荧光色素PE等。
5、清洗和固定将免疫荧光的样品进行严格的洗涤，以去除非特异性的结合物。
洗涤过程可以在紫外光下观察到荧光信号的信噪比。
最终用4%多面固聚醛溶液对洗涤后的样品进行固定处理，以确保样品的可保存性，并且可以长时间保存参考质量以后的荧光染色结果。
6、镜下观察荧光染色的样品在显微镜下观察，可以更加清楚的去判断每个活体细胞的染色情况。
结果分为阳性（显示为荧光亮点或分布）、阴性（显示为黑色或无明显荧光）和疑似阳性（显示为劣质荧光或其他滞留现象）。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光
1. 细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃PBS重悬细胞。
2. 离心吸去PBS，以1~2 ml 2%PFA固定液，或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重悬细胞，置冰上固定30 min。
3. 离心、吸去固定液，用15 ml 4℃PBS重悬细胞，放5 min 后，用PBS 再次洗涤细胞。
4. 稀释的第一抗体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min，250 μl 抗体足够用于5×106细胞。
5. 离心细胞，吸去PBS，重悬细胞于第一抗体中，置4℃温育1 h。
6. 用4℃PBS稀释细胞和抗体至15 ml。
7. 离心，吸去PBS，以4℃PBS重悬细胞，重复1次。
8. 第二抗体4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min，5×106细胞用250 μl 抗体足够。
9. 吸去PBS，以第二抗体重悬细胞，4℃温育1 h，重复步骤6及步骤7。
10. 除非立即观察细胞，否则在进行细胞浓缩的下一步操作之前应以铝萡包裹离心管并冷藏。
11. 离心细胞并以少量PBS重悬（勿用水），将细胞悬液滴于多聚-L-赖氨酸覆层的载玻片上，加上盖玻片，尽可能马上观察结果。
细胞免疫荧光步骤
要领一：之阳早格格创做1.最先需要把细胞养正在玻璃片上（悬浮细胞需要用多散好氨酸包被过的玻璃片）2.而后正在4％PFA内里室温下牢固30分钟，PBS洗二次，0.1% TX-100室温下效率1－2分钟使细胞膜通透.3.接下去举止荧光标记表记标帜，需要正在一个大的容器（里积大，扁仄状的，比圆大的培植皿）内里，搁一弛用火挨干的滤纸，以脆持干度.4.剪一片符合大小的parafilm，正在上头滴上稀释正在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依简曲抗体而定），每个玻璃片30ul脚够，把玻璃片盖正在上头（细胞里往下），室温下孵育30分钟，而后正在PBS里洗三次.5.接下去二抗孵育步调共上.6.末尾，正在载玻片加上mounting medium（约莫每个玻璃片加10ul），把玻璃片搁上去（细胞里往下），37度30分钟，而后便不妨正在荧光隐微镜下瞅察了.7.抗体很要害，不克不迭有非特同性分离.您不妨先搞WB检测一下您的抗体，瞅瞅有不纯戴.8.单目标话，不妨把二个一抗所有加大概者分别标记表记标帜二次（不妨皆试一下瞅瞅那种要领符合）.如果一个抗体需要二抗，一个是间接荧光标记表记标帜的，不妨把荧光标记表记标帜的那个战其余一个的二抗所有加.要领二：1.采用一抗时要根源于二种分歧的动物，尔用的是根源于rabbit战rat的抗体，二抗则是分歧荧光旗号标记表记标帜的，尔用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）战donkey anti-rat-Tex-Red（黑）.2.尔的搞法是二种一抗共时孵育，而后二种二抗共时孵育.抗体浓度、孵育时间要留神摸索，尔感觉一抗4度孵育过夜比较佳，背景比较浑晰.3.尔的阳性对付照用的是阳性构造切片，阳性对付照则分别是家兔战大鼠的IgG，荧光标记表记标帜物对付照是PBS+荧光标记表记标帜物.4.启关血浑与二抗根源动物普遍，尔用的是10%的仄常donkey血浑.5.其余步调共普遍免疫荧光单标支配.要领三：1.片子的创造：不妨搞细胞爬片，细胞甩片，另有间接正在24well/12well/96well中间接染色2.细胞爬片的创造：间接买买公司的已经处理过的细胞爬片，假如自己创造的话，便用无菌的盖玻片用多散好氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液匀称甩到玻片上.4.本去小的well的话，不妨间接拿去染色，出问题的.5.牢固：用PBS洗去培植液，用牢固液（如甲醇战丙酮；4%多散甲醛；酒粗...）牢固细胞.6.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选做，二抗连HRP得必搞，其余的如搞免疫荧光染色不必搞）.7.通透（胞浆蛋黑战细胞核蛋黑需要搞；细胞膜蛋黑不需要搞），普遍采用Triton-X100去搞细胞通透，浓度战时间需要摸索，普遍是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级各别需要到1-2小时.8.启关：洗去通透液，用二抗共源的血浑约10%的浓度inPBS中启关半小时，也不妨采用5-10%脱脂奶粉.启关中断后千万不要洗，间接上一抗.9.一抗：简曲您念搞什么样的蛋黑，接洽抗体公司如santacruze,Abcam,sigma.....采用简曲的抗体，然而是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液不妨买买抗体公司现成的，对付于新脚仍旧挺佳的.时间普遍是4度过夜大概者37度1小时.一抗最佳仍旧采用中国抗体公司的抗体.10.洗去一抗.11.上二抗，二抗普遍抗体公司会给您推荐的，您正在其中选上一个便止了，自己选国产的也止，便是选正在哪个动物体内搞的一抗，二抗便选抗那个动物的便止了.二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液战一抗相共便止了.二抗的时间普遍是37度半小时.12.底物隐色（选做，二抗连得是酶的必搞，按试剂盒的证明书籍增加便止了，隐色时间大概需要摸索，免得隐色过分引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不必搞）13.洗去二抗，染核14.DAPI大概者Hoechst染核15.洗去染核液，加PBS，上镜瞅察.要领四：(1)细胞准备.对付单层死少细胞，正在传代培植时，将细胞接种到预先搁置有处理过的盖玻片的培植皿中，待细胞靠近少成单层后与出盖玻片，PBS洗二次；对付悬浮死少细胞，与对付数死少细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm，5min)2次，用细胞离心甩片体造备细胞片大概间接造备细胞涂片.(2)牢固.根据需要采用适合的牢固剂牢固细胞.牢固完成后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月.PBS洗涤3×5 min.(3)通透.使用接联剂(如多散甲醛)牢固后的细胞，普遍需要正在加进抗体孵育前，对付细胞举止通透处理，以包管抗体不妨到达抗本部位.采用通透剂应充分思量抗本蛋黑的本量.通透的时间普遍正在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.(4)启关.使用启关液对付细胞举止启关，时间普遍为30min.(5)一抗分离.室温孵育1h大概者4℃过夜.PBST漂洗3次，屡屡浑洗5min.(6)二抗分离.间接免疫荧光需要使用二抗.室温躲光孵育1h.PBST漂洗3次，屡屡浑洗5min后，再用蒸馏火漂洗一次.(7)启片及检测.滴加启片剂一滴，启片，荧光隐微镜查看.要领五：1．漂洗血浑蛋黑P，37度 PBS 2小时.2．-20度甲醇牢固20分钟后，自然、搞燥 10分钟3．PBS洗洁：3min＊34．1%Triton：25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5．PBS洗洁：2＊5min6．羊血浑启关：37度，20分钟7．一抗，4度过夜，普遍要大于18小时大概者37度1-2小时8．4度PBS洗洁，３min＊5次9．二抗37度小于一小时10．37度PBS洗洁，3＊3min11．凉搞启片（启关液）细胞免疫荧光步调：1.细胞爬片；最先是玻片的处理，一般的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小圆块，先用洗衣粉洗搞洁，用火冲静烤搞，而后泡酸过夜，捞酸后流火洗洁，烤搞，置于器皿中下压灭菌，而后再烤箱中约莫8小时烤搞备用.爬片不妨正在培植皿六孔板大概24孔板中皆可，尔采用正在培植皿中爬.一为俭朴经费（培植皿不妨沉复利用）二去感触培植皿心大，支配比较便当.培植皿消毒共上，消毒时记得消二把镊子简曲支配是：用胰酶消化佳细胞，充分吹挨，使之成单细胞悬液（注意：那一面很要害，关系到将去爬出去片子的品量）与出消毒的培植皿，不妨先加少量培植基（以使玻片与培植皿稀切交战），将玻片留神搁进晃搁其中，而后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上.末尾盖上培植皿置于37度5％CO2的温箱中培植，根据细胞死少情景，24小时大概更万古间适时与出爬片.爬片置于37度PBS中洗三次，屡屡3到5秒钟，而后正在4％多散甲醛中牢固15分钟，而后再用37度去离子火将甲醛冲搞洁，注意脚法沉柔，要可则掉片很锋利.共时支配历程中注意玻片的正反里，要可则果然是前功尽弃.将搞佳的爬片置于滤纸上晾搞，而后用中性树胶粘正在载玻片上.注意一定要等中性树胶真足搞了之后才搞搞后绝真验，要可则玻片会掉下去的，便又是前功尽弃了搞佳的细胞爬片不妨搁正在－20保存备用，简曲能保存多万古间不太领会，天然尽管早用.2.4%多散甲醛牢固10min(牢固细胞器用预热的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 脱孔15min(丙酮牢固法不必透化处理)；5.PBS漂洗2次，屡屡5min；6.1%BSA启关30min；7.加进1%BSA稀释的一抗，于37℃纯接2h；8.PBS漂洗2次，屡屡5min；9.加进1%BSA稀释的二抗，于37℃纯接1h；10.PBS漂洗2次，屡屡5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬灭启片剂启片.抗淬灭启片剂:2.5% DABCO (w/v) 50mM Tris(pH8.0) 90%苦油细胞免疫荧光细胞爬片4%多散甲醛牢固10min(牢固细胞器用预热的70%甲醇+30%丙酮)PBS漂洗5min0.5% Triton 脱孔15min(丙酮牢固法不必透化处理)PBS漂洗2次，屡屡5min1%BSA启关30min加进1%BSA稀释的一抗，于37℃纯接2hPBS漂洗2次，屡屡5min加进1%BSA稀释的二抗，于37℃纯接1hPBS漂洗2次，屡屡5min5ug/ml DAPI染色2min抗淬灭启片剂启片2.5% DABCO (w/v)抗淬灭启片剂 50mM Tris(pH8.0)90%苦油0.25g DABCO9ml苦油0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解，-20℃保存0.5ml ddH2O。
细胞免疫荧光 详细步骤
细胞免疫荧光步骤：1、细胞在盖片上生长融合到95％－100％时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4％的甲醛室温固定20－30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2％Triton X－100透化2－5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗（用1％BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗（用1％BSA稀释）30分钟，闭光！！！11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95％甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!!11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色实验步骤1.细胞处理：将需要进行染色的细胞培养于培养皿中，通常使用生理盐水或PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞，以去除培养基或其它细胞残留物。
2.固定：使用适当的固定剂，如甲醛或乙醛，固定住细胞。
通常在室温下固定细胞10-30分钟，然后用PBS洗涤。
3.渗透化处理：为了增强抗原与抗体的结合，需要使用渗透化剂如BSA（牛血清白蛋白）或胎牛血清等，封闭其它非特异结合位点。
浓度通常为1-5%的BSA，可以根据实验需要调整。
4.预处理：通过预处理，可以增强抗原的可见性。
预处理方法包括煮沸、酶解或蛋白酶处理等。
具体方法应根据需要选择。
5.抗原特异性溶液：将具有特异性的抗体溶液加入到含有细胞的培养皿中，使其与抗原结合。
抗体通常与标记物如荧光染料共价结合，使得标记的抗原能够被荧光显微镜观察。
6.清洗：将细胞用PBS洗涤，以去除未与抗体结合的游离抗体。
7.荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察染色后细胞中的抗原。
荧光显微镜具有特殊的光学透镜和滤光片，可以选择和激发不同荧光染料的发光。
根据需要，可以选择合适的滤光片来检测多个染色的细胞。
8.影像分析：通过图像处理软件对荧光显微镜下观察到的细胞图像进行分析和量化。
常见的分析内容包括抗原的位置、表达强度和相对数量等。
9.结果解读：根据荧光染色的结果来解读细胞中其中一抗原的表达情况。
可以通过比较实验组和对照组的亮度或表达分子的定量来确定差异。
补充说明：2.正、阴对照：在进行抗原染色前，应设置正、阴对照实验。
正对照是指使用已知表达目标抗原的样本，而阴对照是指使用未表达目标抗原的样本。
通过对照实验可以判断染色结果是否可靠。
3.染色条件优化：染色条件如温度、时间、抗体的浓度等都可能影响染色效果。
因此，需要对染色条件进行优化，以确保得到准确的结果。
4.扩展检测：除了直接染色，还可以使用间接染色方法来增强信号。
通过使用辅助抗体，可以将多个标记物同时进行检测，提供更多的信息。
总结起来，免疫荧光染色实验步骤是：细胞处理→固定→渗透化处理→预处理→抗原特异性溶液→清洗→荧光显微镜观察→影像分析→结果解读。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天：1.在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；2.用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；3.0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；4.PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；5.吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；第二天：6.加荧光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7.复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8.用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
细胞免疫荧光步调1.在24孔板里加500微升造就基，放爬片，接种细胞（做尝试以30-50%集合度较好。
-摆布2.给药处置惩罚24h。
3.PBS洗三遍。
4.4％冷的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗三遍，每次5min，摇床。
（避光）5.0.5％Triton X－100（PBS配）破膜15min，PBS洗三遍，每次5min，摇床。
6.5%BSA（牛血清白蛋白，PBS配）封闭60分钟,不用洗。
7.加一抗孵育（5%BSA配），4℃摇床过夜。
8.收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。
孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000）,室温60min（避光）9.回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。
10.0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。
（避光）11.PBS洗三遍，每次5min，摇床。
细胞免疫荧光实验原理
细胞免疫荧光实验原理
细胞免疫荧光实验是一种常用的技术手段，用于研究特定分子在细胞中的位置和分布情况。
该实验基于免疫荧光染色原理，利用荧光标记的抗体或其它特异性标记物，绑定到目标分子上，并利用荧光显微镜观察荧光信号的分布情况。
细胞免疫荧光实验的基本步骤包括：
1. 固定细胞：将要研究的细胞进行固定处理，常用的固定剂包括甲醛、乙醛等。
固定细胞的目的是保持细胞形态和防止细胞膜的破裂。
2. 渗透处理：细胞具有完整的细胞膜，为了使抗体或标记物能够穿透细胞膜与目标分子结合，需要进行渗透处理。
常用的渗透处理方法包括使用洗涤剂（如0.1% Triton X-100）或酶（如胰蛋白酶）等。
3. 阻断非特异结合：为了避免非特异性结合，需要使用一定的阻断剂。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）等。
4. 抗体处理：将特异性抗体或标记物加入到样品中，使其与目标分子发生特异性结合。
抗体可以选择荧光标记的一抗或二抗，也可以选择其他特定标记的抗体，如荧光素酶（HRP）标记的抗体。
5. 洗涤：为了去除未结合的抗体或标记物，需要进行多次洗涤步骤。
洗涤的目的是减少非特异性结合，提高信号与噪音比。
6. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察荧光信号的分布情况。
荧光显微镜具有高度灵敏度和分辨率，能够观察到细胞内特定分子的位置和分布情况。
细胞免疫荧光实验的原理是基于特异性抗体与目标分子的结合，并利用荧光标记物的荧光信号来检测目标分子的位置和分布。
通过该实验，可以了解细胞内特定分子的表达情况、定位以及相互作用等重要信息。
细胞免疫荧光的操作流程
细胞免疫荧光的操作流程一、准备实验材料1、抗体：根据需要使用的抗體，可以选择合适的抗體。
2、细胞：根据实验需要，选择合适的细胞进行实验，并在37℃5%CO2的培养箱条件下保持培养，直到实验需要。
3、用于洗涤细胞的生理盐水或PBS缓冲液：使用无菌的生理盐水或PBS缓冲液洗涤细胞，可以保护细胞免受外界环境影响。
4、收集细胞：如酶标记或其他标记，获得细胞膜丰度，收集细胞进行数目统计，以确定最终实验细胞数量。
5、荧光染料：根据需要，选择合适的荧光染料，按指定的比例混合，配制成荧光染料溶液备用。
二、实验流程1、制备抗体溶液或小分子染料溶液：将所需抗体或小分子染料放入适当的溶剂中，搅拌均匀，配制成抗体溶液或小分子染料溶液备用。
2、洗涤细胞：在冷藏室中，将培养好的细胞离心至10000g，去除培养液，改用生理盐水或PBS缓冲液洗涤2次，以去除残留在细胞表面的培养液及细胞垢。
3、添加抗体溶液：在离心完的洗涤细胞的PBS缓冲液中添加抗体溶液，搅拌均分，放入37℃5%CO2条件的培养箱中掺匀体外培养2小时。
4、添加荧光染料溶液：将荧光染料溶液添加到毒化细胞中，在培养箱中持续掺匀体外培养1小时。
5、收集细胞：收集培养的细胞，用荧光酶标尿素酸染色法检测细胞内蛋白质的表达，用流式细胞术检测细胞的荧光强度，并分析各个细胞株。
6、数据处理：将实验数据存储，进行数据处理，绘制各细胞株荧光强度分布图，统计出各细胞株的平均荧光强度，便于评价实验效果和分析。
7、分析评价实验效果：对实验效果进行评价，进行分析，根据数据比较，判断实验结果及影响因素的影响，从而探讨获得的可靠结论。
细胞免疫荧光详细步骤
细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。
爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。
一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。
培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。
最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。
爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。
同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。
将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。
注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。
2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片。
抗淬灭封片剂:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)PBS漂洗5min0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)PBS漂洗2次，每次5min1%BSA封闭30min加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1hPBS漂洗2次，每次5min5ug/ml DAPI染色2min抗淬灭封片剂封片2.5% DABCO (w/v)抗淬灭封片剂50mM Tris(pH8.0)90%甘油0.25g DABCO9ml甘油0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解，-20℃保存0.5ml ddH2O。
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方法一：1. 首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2. 然后在 4％PFA 里面室温下固定 30 分钟， PBS 洗两次， 0.1% TX-100 室温下作用 1－2 分钟使细胞膜通透。
3. 接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4. 剪一片合适大小的parafilm ，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS 中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片 30ul 足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育 30 分钟，然后在 PBS 里洗三次。
5. 接下来二抗孵育步骤同上。
6. 最后，在载玻片加上mounting medium （大约每个玻璃片加10ul）,把玻璃片放上去（细胞面朝下）， 37 度 30 分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7. 抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做 WB 检测一下你的抗体，看看有没有杂带。
8. 双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit 和 rat 的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC （绿）和donkey anti-rat-Tex-Red （红）。
2. 我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗 4 度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4. 封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常 donkey 血清。
5. 其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
方法三：1. 片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well 中直接染色2. 细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3. 细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
4. 其实小的 well 的话，可以直接拿来染色，没问题的。
5•固定：用PBS洗去培养液，用固定液(如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。
)固定细胞。
6. 内源性过氧化物酶处理， 3%过氧化氢处理细胞(选作，二抗连HRP 得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做) 。
7 •通透(胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做) ，一般选用 Triton-X100 来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到 1-2 小时。
8. 封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。
封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。
9. 一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma 。
选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。
时间一般是 4度过夜或者 37度 1小时。
一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。
10. 洗去一抗。
11. 上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。
二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。
二抗的时间一般是37 度半小时。
12. 底物显色(选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做)13. 洗去二抗，染核14. DAPI 或者 Hoechst 染核15. 洗去染核液，加 PBS，上镜观察。
方法四：(1) 细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用 PBS 离心洗涤 (1000rpm， 5min)2 次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
(2) 固定。
根据需要选择适当的固定剂固定细胞。
固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4C保存3个月。
PBS洗涤3X5 min。
(3) 通透。
使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。
选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。
通透的时间一般在5-15min。
通透后用PBS洗涤3X5 min。
(4) 封闭。
使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为 30min。
(5) 一抗结合。
室温孵育 1h或者4C过夜。
PBST漂洗3次，每次冲洗5min。
（6）二抗结合。
间接免疫荧光需要使用二抗。
室温避光孵育1h°PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
（7）封片及检测。
滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
方法五：1．漂洗血清蛋白 PH7.2-7.4 ， 37度 PBS 2小时.2． -20 度甲醇固定 20 分钟后，自然、干燥 10 分钟3． PBS 洗净： 3min＊34． 1%Triton ：25min-30min. 配成 50ultriton+5mlpBS5． PBS 洗净： 2＊5min6．羊血清封闭： 37 度， 20分钟7．一抗， 4度过夜，一般要大于 1 8小时或者 37度 1-2小时8. 4 度 PBS 洗净，3 min * 5次9．二抗 37 度小于一小时10. 37 度 PBS 洗净， 3* 3min11. 凉干封片（封闭液 PH8.5）细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8 小时烤干备用。
爬片可以在培养皿六孔板或 24 孔板中都可，我选择在培养皿中爬。
一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。
培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。
最后盖上培养皿置于37 度 5％ CO2 的暖箱中培养，根据细胞生长状况， 24小时或更长时间适时取出爬片。
爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4%多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37 度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。
同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。
将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。
注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－ 20 保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。
2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮);3.PBS 漂洗 5min；4.0.5% Trit on穿孔15mi n(丙酮固定法不用透化处理 );5. PBS漂洗2次，每次5min ；6.1%BSA 封闭 30min；7•加入1%BSA稀释的一抗，于 37C杂交2h;8.PBS漂洗2次，每次5min ;9•加入1%BSA稀释的二抗，于 37C杂交1h;10.PBS 漂洗 2 次，每次 5min ；11.5ug/ml DAPI 染色 2min；12. 抗淬灭封片剂封片。
抗淬灭封片剂 :2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10mi n（固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮）]PBS漂洗5min0.5% Triton 穿孔15mi n（丙酮固定法不用透化处理）PBS漂洗2次，每次5min1%BSA 封闭30minJ加入1%BSA稀释的一抗，于37C杂交2hJPBS漂洗2次，每次5minJ加入1%BSA稀释的二抗，于37E杂交1hJPBS漂洗2次，每次5min5ug/ml DAPI 染色2minJ抗淬灭圭寸片剂圭寸片「2.5% DABCO (w/v)抗淬灭封片剂- 50mM Tris(pH8.0)I 90%甘油0.25g DABCO [9ml甘油0.5ml 1M Tris(Ph8.0) f 70C 溶解，-20C 保存0.5ml ddH2O。