细菌标本片的制备及染色方法PPT精选文档
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技能训练2 细菌标本片的制备和染色法
技能训练2 细菌标本片的制备和染色法一、目的要求：正确掌握细菌培养物涂片的制作和常用染色法二、设备材料病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。
三、操作方法细菌标本片制作的基本步骤为：涂片或触片→干燥→固定→染色→镜检。
(一)细菌涂片的制备1．液体培养物及液体病料(1)涂片用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。
(2)干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30～40cm处适当加热干燥。
(3)固定分为火焰固定和化学固定两种。
火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度；化学固定时，可将干燥好的玻片浸入甲醇中2～3min后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min后自然挥发干燥。
此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。
(4)染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。
2．固体培养物用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央→用接种环挑取一个菌落于生理盐水中混合→均匀地涂布成适当大小的薄层→干燥→固定→染色。
(二)细菌触片的制备将固体病料(病变组织)作无菌切开→用切面在玻片的中央接触一下或稍用力印压成一薄层→干燥→固定→染色。
(三)细菌的染色法1．单染色法又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。
(1)美蓝染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液1—2min后，水洗，干燥(吸水纸吸干或自然干燥)，镜检。
(2)瑞特氏染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥，可适当多加一些，或视情况补充滴加，1—3min后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3—5min后，直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。
也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3—5min后直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。
(完整)实验细菌的简单染色和革兰氏染色精品PPT资料精品PPT资料
1
阳性菌
2
3
阴性菌
4
六 实验报告
1 写出实验目的 2 写出简单染色、革兰氏染色的基本原理 3 根据实验结果绘出简单染色和革兰氏染色的结果图。
菌名： 放大倍数： 细菌简单染色结果图
放大倍数： 细菌革兰氏染色结果图 要求： 标出菌名、颜色、阳性或阴性菌
七 思考题
1 细菌简单染色操作过程中应注意哪些事项？ 2 如果对一未知菌进行革兰氏染色，如何能确证染色 结果正确可靠？ 3 为什么说95%酒精脱色是革兰氏染色的关键步骤？
1 涂片：方法同单染色，然后干燥、固定。
2 初染：滴加结晶紫染色1min，后用水冲洗。 3 媒染：滴加碘液染色1---2min，后用水冲洗，甩尽残余水 4 脱色：用95%乙醇冲洗30秒（需要严格控制时间和浓度），
然后立即用水冲洗。 5 复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染，蕃红染
2---3min，如果石炭酸复红染1min。水洗，晾干。 6 镜检：先用低倍镜观察，后用油镜观察
占细胞壁的10%
革兰氏阳性细菌的细胞壁
1、细胞壁
成 分
肽 聚 糖 磷 壁 酸 类 脂 质 蛋 白 质
革兰氏阳革性兰\氏阴染性色细与菌细的胞细壁胞：壁对比
占 细 胞 壁 干 重 的 %
革 兰 氏 阳 性 细 菌
革 兰 氏 阴 性 细 菌
含 量 很 高 （ 50~90）
含 量 很 低 （ ~10）
1
2
？
3
4
三 实验材料
大肠杆菌（24 h 培养）斜面菌种 枯草杆菌（16 h 培养）斜面菌种
四 无菌操作过程
无菌操作：不让除我们接种的微生物以外
其它微生物侵入的技术。
（一）细菌的简单染色原理 2 如果对一未知菌进行革兰氏染色，如何能确证染色结果正确可靠？ 五 操作步骤 ◆用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 （二）革兰氏染色基本原理 然后立即用水冲洗。 （二）革兰氏染色基本原理 2---3min，如果石炭酸复红染1min。 最终被染成红色的是革兰氏阴性细菌； 兰氏阳性细菌继续保持深紫色 细菌细胞微小，且含水量较多，在普通光镜下表现为无色透明，不易观察，所以必须进行染色处理，使细胞着色，便于观察。 4 染色：结晶紫染1min或蕃红染2-3min或石炭酸复红染1min。 2 写出简单染色、革兰氏染色的基本原理 4 巩固显微镜油镜的使用方法。 1 学习制染色片技术，学习简单染色\革兰氏染色原理，理解着色机理。 一 目的要求 放大倍数： 五 操作步骤
细菌标本片的制备及染色法.
细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 镊子、剪刀在酒精灯火焰上烧灼灭菌，用镊子夹持、剪刀剪取小块 病料组织，以其新鲜切面在玻片上轻触3~5个压迹。
细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 室温下自然干燥或将标本片 的涂面向上，置酒及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
• 滴加瑞氏染色液于涂片上 以固定标本，1～3min后， 再滴加与染色液等量的磷 酸缓冲液或中性蒸馏水于 玻片上，轻轻摇晃使与染 色液混和均匀，5min左右 水洗，干后镜检
• 注：瑞氏染液含甲醇，无需另 行固定
瑞氏染色镜检结果
细菌（蓝色） 细胞
(2)液体培养物 可直接用灭菌接种环钩
取细菌培养液1～2环，在玻片上作 直径1cm的涂面
细菌培养物涂片及革兰氏染色
1 涂片 2 干燥 3 固定 4 革兰氏染色
• 室温下自然干燥或 将标本片的涂面向 上，置酒精灯火焰 高处微烤加热干燥。
细菌培养物涂片及革兰氏染色
1 涂片 2 干燥 3 固定 4 革兰氏染色
水洗 水洗 水洗
革兰氏染色镜检结果
葡萄球菌（G+菌，蓝紫色）
大肠杆菌（G-菌，红色）
血涂片及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
45°
• 取一张边缘整齐的载玻片，用其一端醮取血 液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上， 以45°角均匀推成一薄层的涂面。
血涂片及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
– 组织病料（肝脏）：触片及美兰染色 – 固体细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌）：涂片及革
兰氏染色 – 液体病料：血涂片及瑞士染色
3. 镜检结果 4. 注意事项
实验 细菌的染色.ppt
复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有：
革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 荚膜染色法等。
2019-9-15
感谢你的欣赏
13
革兰氏染色（Gram stain） 1984年，丹麦医生Gram采用革兰氏染色法细 菌细胞壁区分为两种类型：革兰氏阴性（G+） 和革兰氏阳性（G-）
2) 油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净， 否则可能损害镜头
3）擦油镜镜头方法：分三步 A）先用擦镜纸揩去 镜头上的香柏油 B）从双层瓶的下层沾少许二 甲苯滴在另一片擦镜纸上 ，擦拭镜头； C）再用 一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯。
2019-9-15
感谢你的欣赏
12
2、革兰氏染色
单染色法：只能观察微生物的大小、形状、 和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及 它的特殊构造等。
23
思考题
简单染色:
(1) 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节? (2) 如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、
时间太长，又会怎样呢？
革兰氏染色: (1) 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?其中最关键的环节
是什么? (2) 现有一株细菌宽度明显大于大肠杆茵的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰
8
2、干燥 室温自然干燥
操作步骤（continued）
3、固定
固定的目的： 1）使细胞质凝固，以固定细胞形态； 2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。
固定方法： 热固定：涂面朝上，通过火焰数次 注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜， 否则会改变甚至破坏细胞形态
2019-9-15
感谢你的欣赏
细菌标本片的制备及染色方法
细菌标本片的制备及染色方法
目录
• 引言 • 细菌标本片的制备 • 染色方法 • 染色步骤 • 结果观察与解读 • 注意事项与局限性 • 展望与未来研究方向
01 引言
目的和背景
01
细菌标本片的制备及染色是微生 物学实验中的基础操作，旨在通 过观察细菌的形态、染色特性等 ，对细菌进行鉴别和分类。
02
02 细菌标本片的制备
涂片制备
选择适当的涂片材料
常用的涂片材料包括载玻片、盖玻片 和胶片，根据不同的需求选择合适的 涂片材料。
制备涂片
涂片厚度控制
涂片的厚度会影响染色效果和显微镜 观察效果，因此需要控制涂片的厚度， 使其符合实验要求。
将细菌样本均匀涂布在涂片材料上， 确保涂层薄而均匀，无气泡或杂质。
方法进行染色的方法。
步骤
特殊染色法的步骤因不同的染色对 象而异，一般包括涂片、固定、染 色和复染等步骤。
结果
通过特殊染色法可以显示细菌的特 殊结构和成分，有助于细菌的分类 和鉴别。
04 染色步骤
初染
使用结晶紫进行初染，将结晶紫染液滴加在细菌标本片上， 确保覆盖整个菌落。
静置片刻，让结晶紫充分染色，然后用清水冲洗，去除多余 的染料。
06 注意事项与局限性
实验操作注意事项
确保实验室环境清洁
在制备细菌标本片时，应确保 实验室环境的清洁，避免污染
。
严格无菌操作
在操作过程中，应遵循无菌原 则，使用无菌器材和试剂，以 避免交叉污染。
选择适当的染色方法
根据实验目的和要求，选择适 当的染色方法，以确保结果的 准确性和可靠性。
控制染色时间
染色时间对染色效果有很大影 响，应严格控制染色时间，避
免染色过度或不足。
目录
• 引言 • 细菌标本片的制备 • 染色方法 • 染色步骤 • 结果观察与解读 • 注意事项与局限性 • 展望与未来研究方向
01 引言
目的和背景
01
细菌标本片的制备及染色是微生 物学实验中的基础操作，旨在通 过观察细菌的形态、染色特性等 ，对细菌进行鉴别和分类。
02
02 细菌标本片的制备
涂片制备
选择适当的涂片材料
常用的涂片材料包括载玻片、盖玻片 和胶片，根据不同的需求选择合适的 涂片材料。
制备涂片
涂片厚度控制
涂片的厚度会影响染色效果和显微镜 观察效果，因此需要控制涂片的厚度， 使其符合实验要求。
将细菌样本均匀涂布在涂片材料上， 确保涂层薄而均匀，无气泡或杂质。
方法进行染色的方法。
步骤
特殊染色法的步骤因不同的染色对 象而异，一般包括涂片、固定、染 色和复染等步骤。
结果
通过特殊染色法可以显示细菌的特 殊结构和成分，有助于细菌的分类 和鉴别。
04 染色步骤
初染
使用结晶紫进行初染，将结晶紫染液滴加在细菌标本片上， 确保覆盖整个菌落。
静置片刻，让结晶紫充分染色，然后用清水冲洗，去除多余 的染料。
06 注意事项与局限性
实验操作注意事项
确保实验室环境清洁
在制备细菌标本片时，应确保 实验室环境的清洁，避免污染
。
严格无菌操作
在操作过程中，应遵循无菌原 则，使用无菌器材和试剂，以 避免交叉污染。
选择适当的染色方法
根据实验目的和要求，选择适 当的染色方法，以确保结果的 准确性和可靠性。
控制染色时间
染色时间对染色效果有很大影 响，应严格控制染色时间，避
免染色过度或不足。
微生物制片与染色方法-简单染色法优质课件
载玻片滴水→拿试管、松棉塞
简染色法
— 1—
谢谢
简单染色法
主讲：王娟
目录页
食品营养与检测专业教学资源库
简单染色目的 操作要点及注意事项
— 1—
过渡页
食品营养与检测专业教学资源库
操作要点及注意事项
1.涂片 2.干燥、固定 3.染色 4.干燥、镜检
— 2—
• 二、操作要点及注意事项
简
1.涂片
单 染
载玻片滴水→拿试管、松棉塞
色 法
→灼烧接种环→拔棉塞→取菌
→塞棉塞→涂布→灼烧接种环
食品营养与检测专业教学资源库
— 1—
食品营养与检测专业教学资源库
• 二、操作要点及注意事项
简
2.干燥、固定
单
染
干燥：自然干燥或在酒精灯火焰上方较远处微微加热干燥；
色
法
固定：涂面朝上，通过火焰2~3次。目的是使细胞质凝固，以固定细胞形
态，并使之牢固附着在载玻片上。固定温度不宜过高（以载玻片背面不
烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形状。
— 1—
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• 二、操作要点及注意事项
简
4.水洗
单
染 食品营养与检测专业教学资源库 倾去染液，斜拿载玻片，用细小的水流把标本背面多余的染料冲洗掉， 色 二因、此操 ，作常要用点碱及性注染意料事进项行单染色，如被美兰菌、体孔雀吸绿、附碱的性复染红、料结则晶紫保和中留性。红等。 法 目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
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技能训练5 细菌标本片的制备及染色方法
1
实训目标
能利用不同的材料进行细菌标本片的制备 掌握常规的染色方法，并认识细菌的不同染色特性
2
仪器材料
酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美 蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、 染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜 纸、细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌等）、细菌 病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等
10
（2）组织抹片的制作 待检尸体经无菌手术切开胸腹腔后，用经火焰灭菌的 镊子夹起组织，用灭菌剪刀剪下小块组织，将组织切 面在载玻片上等距离轻压几下，使其留有组织切面的 压迹。
11
（二）常用的细菌染色方法
1．美蓝染色法 2．革兰氏染色法 3．瑞氏染色法
12
1．美蓝染色法
在已固定好的抹片 上，滴加适量美蓝染色 液覆盖涂面，染色2～ 3 min， 水 洗 ， 吸 水 纸 轻压吸干或晾干和镜检， 结果菌体呈蓝色。
（2）卢戈氏碘液 碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml。将碘化钾放入研钵 中，加入少量蒸馏水，使其溶解，再放入已磨散的碘片，徐徐加 水，同时充分磨匀，待碘片完全溶解后，把余下的蒸馏水倒入， 再装入瓶中。
（3）石炭酸复红稀释液 取碱性复红酒精饱和溶液（碱性复红10g溶于 95%酒精100ml中）1ml和5%石炭酸水溶液9ml混合，即为石炭酸 复红原液。再取原液10ml和90ml蒸馏水混合，即成石炭复红稀释 液。
14
3．瑞氏染色法
细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片 上以固定标本，1～3min后，再滴加与染色液 等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻 轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗， 干后镜检，结果菌体呈蓝色，组织细胞等物呈 其他颜色。
15
（三）常用染色液的配制
1．碱性美蓝染色液 2．革兰氏染色液 3．瑞氏染色液
7
（2）干燥涂片 在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置火焰上来回微 烤使其干燥。
8
（3）固定涂片 干燥后，将涂面向上，在火焰上快速来回通过2～3次，其 温度以手背接触玻片底面感觉微烫手为宜。
9
2．血液推片和组织抹片的制作
（1）血液推片的制作 取一张边缘整齐的载玻片，用其一端蘸取少许血液， 在另一张干净无油脂的载玻片上，以45°角度均匀地 推成一薄血涂片，以红细胞不重叠为宜。
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1．碱性美蓝染色液
甲液：美蓝0.3g、95%酒精30mL； 乙液：0.01%苛性钾溶液100mL 先配甲液，将美蓝放入研钵中，徐徐加入酒精 研磨均匀后，把甲、乙两液混合，过夜后用滤 纸过滤即成。新鲜配制的美蓝液染色不好，陈 旧的染色好。
17
2．革兰氏染色液
（1）草酸铵结晶紫溶液 甲液：结晶紫2g、95%酒精20ml； 乙液：草酸铵0.8g、蒸馏水80ml 将结晶紫放入研钵中，加酒精研磨均匀制成甲液，然后将完全溶 解的乙液与甲液混合即成。
13
2．革兰氏染色法
（1）在固定好的抹片上，滴加草酸 铵结晶紫染色液，作用1～ 3min，水洗。
（2）加革兰氏碘液，作用1～2min， 水洗。
（3）加95％酒精脱色约30s至1min， 水洗。
（4）加稀释石炭酸复红，复染30s左 右，水洗，吸干后镜检。
结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰 氏阴性菌呈红色。
18
3．瑞氏染色液
取瑞氏染料0.1g，纯中性甘油1ml，在研钵中 混合研磨，再加入甲醇60越久，染色越好。
19
课后作业
1.写出实习报告； 2.掌握美兰染色的方法； 3.掌握革兰氏染色的方法
20
3
方法步骤
（一）细菌标本片的制作 （二）常用的细菌染色方法 （三）常用染色液的配制
4
（一）细菌标本片的制作
1．涂片标本的制作 （1）涂片 （2）干燥涂片 （3）固定涂片
2．血液推片和组织抹片的制作 （1）血液推片的制作 （2）组织抹片的制作
5
6
1．涂片标本的制作
（1）涂片 取清洁载玻片一块，用吸管吸取生理盐水1滴置于玻片中 央，再将接种环在火焰上灭菌，待冷后从固体培养基上挑 取少许菌落，置于玻片上的生理盐水中混均匀，并在玻片 上涂成直径约为1cm的涂面，要求薄而均匀。
1
实训目标
能利用不同的材料进行细菌标本片的制备 掌握常规的染色方法，并认识细菌的不同染色特性
2
仪器材料
酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美 蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、 染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜 纸、细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌等）、细菌 病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等
10
（2）组织抹片的制作 待检尸体经无菌手术切开胸腹腔后，用经火焰灭菌的 镊子夹起组织，用灭菌剪刀剪下小块组织，将组织切 面在载玻片上等距离轻压几下，使其留有组织切面的 压迹。
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（二）常用的细菌染色方法
1．美蓝染色法 2．革兰氏染色法 3．瑞氏染色法
12
1．美蓝染色法
在已固定好的抹片 上，滴加适量美蓝染色 液覆盖涂面，染色2～ 3 min， 水 洗 ， 吸 水 纸 轻压吸干或晾干和镜检， 结果菌体呈蓝色。
（2）卢戈氏碘液 碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml。将碘化钾放入研钵 中，加入少量蒸馏水，使其溶解，再放入已磨散的碘片，徐徐加 水，同时充分磨匀，待碘片完全溶解后，把余下的蒸馏水倒入， 再装入瓶中。
（3）石炭酸复红稀释液 取碱性复红酒精饱和溶液（碱性复红10g溶于 95%酒精100ml中）1ml和5%石炭酸水溶液9ml混合，即为石炭酸 复红原液。再取原液10ml和90ml蒸馏水混合，即成石炭复红稀释 液。
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3．瑞氏染色法
细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片 上以固定标本，1～3min后，再滴加与染色液 等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻 轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗， 干后镜检，结果菌体呈蓝色，组织细胞等物呈 其他颜色。
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（三）常用染色液的配制
1．碱性美蓝染色液 2．革兰氏染色液 3．瑞氏染色液
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（2）干燥涂片 在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置火焰上来回微 烤使其干燥。
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（3）固定涂片 干燥后，将涂面向上，在火焰上快速来回通过2～3次，其 温度以手背接触玻片底面感觉微烫手为宜。
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2．血液推片和组织抹片的制作
（1）血液推片的制作 取一张边缘整齐的载玻片，用其一端蘸取少许血液， 在另一张干净无油脂的载玻片上，以45°角度均匀地 推成一薄血涂片，以红细胞不重叠为宜。
16
1．碱性美蓝染色液
甲液：美蓝0.3g、95%酒精30mL； 乙液：0.01%苛性钾溶液100mL 先配甲液，将美蓝放入研钵中，徐徐加入酒精 研磨均匀后，把甲、乙两液混合，过夜后用滤 纸过滤即成。新鲜配制的美蓝液染色不好，陈 旧的染色好。
17
2．革兰氏染色液
（1）草酸铵结晶紫溶液 甲液：结晶紫2g、95%酒精20ml； 乙液：草酸铵0.8g、蒸馏水80ml 将结晶紫放入研钵中，加酒精研磨均匀制成甲液，然后将完全溶 解的乙液与甲液混合即成。
13
2．革兰氏染色法
（1）在固定好的抹片上，滴加草酸 铵结晶紫染色液，作用1～ 3min，水洗。
（2）加革兰氏碘液，作用1～2min， 水洗。
（3）加95％酒精脱色约30s至1min， 水洗。
（4）加稀释石炭酸复红，复染30s左 右，水洗，吸干后镜检。
结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰 氏阴性菌呈红色。
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3．瑞氏染色液
取瑞氏染料0.1g，纯中性甘油1ml，在研钵中 混合研磨，再加入甲醇60越久，染色越好。
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课后作业
1.写出实习报告； 2.掌握美兰染色的方法； 3.掌握革兰氏染色的方法
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3
方法步骤
（一）细菌标本片的制作 （二）常用的细菌染色方法 （三）常用染色液的配制
4
（一）细菌标本片的制作
1．涂片标本的制作 （1）涂片 （2）干燥涂片 （3）固定涂片
2．血液推片和组织抹片的制作 （1）血液推片的制作 （2）组织抹片的制作
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1．涂片标本的制作
（1）涂片 取清洁载玻片一块，用吸管吸取生理盐水1滴置于玻片中 央，再将接种环在火焰上灭菌，待冷后从固体培养基上挑 取少许菌落，置于玻片上的生理盐水中混均匀，并在玻片 上涂成直径约为1cm的涂面，要求薄而均匀。