流式细胞技术PPT课件
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液流系统 光学系统 数据处理系统
（1）液流系统
• 由样本和鞘液组成 • 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染
色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 • 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样
本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其 靠近孔壁而阻塞喷孔。
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以 90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
测得的FS与SS信号通过 计算机处理，可得到FS-SS 图，由此可仅用散射光信 号对未染色的活细胞进行 分析或分选。 此为血细胞分类的基本原 理，但不能分析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
For Pure FITC+ cells, = PE signal - % FITC signal
For Pure PE+ cells, = FITC signal - % PE signal
FITC
After compensation
PE+ cells
GOOD compensation: Y-mean of the FITC cell = the Ymean of -/- cells
X-mean of the PE cell = the X-
PE
mean of -/- cells
FITC + cells
PE+ cells
OVER compensation
PE FITC + cells
FITC
FITC
细胞分选
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液 中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的 百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测 量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞 的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
第15章 流式细胞技术的原理和应用
流式细胞技术（Flow cytometry, FCM) 是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速对单个细胞或其 他生物微粒（如细菌）的理化特性进行多参数定 量分析和分选的技术。
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细 胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展 起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部 结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速 测量并可分类收集的高技术。
部结构）、化学特性（如DNA、RNA）的多参数测量，并具有明 显的统计学意义； 是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、 显微荧光光度技术、分子生物学技术、免疫学技术、流体力学、 细胞化学、图像技术等众多领域的知识和成果； 既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
BD公司流式细胞仪
FACSCalibur
FACSAria
FACSCount
LSRII
FACSCanto
FACSVantage
Beckman公司流式细胞仪
Gallios流式细胞仪
Navios流式细胞分析系统
MoFlo Astrios EQ 超高速流式分选系统
流ห้องสมุดไป่ตู้细胞术的特点
测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞； 可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理（如大小、内
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
荧光测定
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射 的荧光波长与激发光波长不同。
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性 滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电 倍增管。
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 • 线性放大器和对数放大器
荧光补偿
每一种荧光分子都发射某一特定波长范围内的光，然而这些荧光的发 射光谱会发生重叠，有时这种重叠现象非常显著。荧光补偿是指修正 荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。
FITC APC
PE
PerCP/Cy5.5
荧光补偿
PE+ cells
PE
FITC + cells
To do colour compensation:
液流系统示意图
Injector Tip Shealth Fluid
Fluorescence Signal Focused Laser Beam
样本管
鞘液管
（2）光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光），FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞仪的发展史
30年代：设想使细胞检测自动化 50- 60年代：分层鞘流原理、分光光度计定量细胞
成分及结合测量值对细胞分类，提出细胞分选 70年代：单克隆抗体技术和荧光标记技术 1973年：第一台商用流式细胞仪FACS I 发展方向：荧光染料的开发、细胞的制备方法、提
高电子信号的处理能力等
光学系统示意图
光信号的测定
• 散射光的测定 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向
散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗 粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°~10°)向前方散射的讯号用于检测 细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
应用：细胞生物学，肿瘤学，血液学，免疫学，药 理学，遗传学及临床检验学等
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞功能
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性
胞内细胞因子 激素结合位点
酶活性
一、流式细胞技术原理
1、流式细胞仪的基本结构：
（1）液流系统
• 由样本和鞘液组成 • 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染
色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 • 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样
本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其 靠近孔壁而阻塞喷孔。
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以 90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
测得的FS与SS信号通过 计算机处理，可得到FS-SS 图，由此可仅用散射光信 号对未染色的活细胞进行 分析或分选。 此为血细胞分类的基本原 理，但不能分析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
For Pure FITC+ cells, = PE signal - % FITC signal
For Pure PE+ cells, = FITC signal - % PE signal
FITC
After compensation
PE+ cells
GOOD compensation: Y-mean of the FITC cell = the Ymean of -/- cells
X-mean of the PE cell = the X-
PE
mean of -/- cells
FITC + cells
PE+ cells
OVER compensation
PE FITC + cells
FITC
FITC
细胞分选
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液 中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的 百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测 量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
• 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞 的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
第15章 流式细胞技术的原理和应用
流式细胞技术（Flow cytometry, FCM) 是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速对单个细胞或其 他生物微粒（如细菌）的理化特性进行多参数定 量分析和分选的技术。
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细 胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展 起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部 结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速 测量并可分类收集的高技术。
部结构）、化学特性（如DNA、RNA）的多参数测量，并具有明 显的统计学意义； 是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、 显微荧光光度技术、分子生物学技术、免疫学技术、流体力学、 细胞化学、图像技术等众多领域的知识和成果； 既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
BD公司流式细胞仪
FACSCalibur
FACSAria
FACSCount
LSRII
FACSCanto
FACSVantage
Beckman公司流式细胞仪
Gallios流式细胞仪
Navios流式细胞分析系统
MoFlo Astrios EQ 超高速流式分选系统
流ห้องสมุดไป่ตู้细胞术的特点
测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞； 可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理（如大小、内
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
荧光测定
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射 的荧光波长与激发光波长不同。
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性 滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电 倍增管。
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 • 线性放大器和对数放大器
荧光补偿
每一种荧光分子都发射某一特定波长范围内的光，然而这些荧光的发 射光谱会发生重叠，有时这种重叠现象非常显著。荧光补偿是指修正 荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。
FITC APC
PE
PerCP/Cy5.5
荧光补偿
PE+ cells
PE
FITC + cells
To do colour compensation:
液流系统示意图
Injector Tip Shealth Fluid
Fluorescence Signal Focused Laser Beam
样本管
鞘液管
（2）光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光），FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞仪的发展史
30年代：设想使细胞检测自动化 50- 60年代：分层鞘流原理、分光光度计定量细胞
成分及结合测量值对细胞分类，提出细胞分选 70年代：单克隆抗体技术和荧光标记技术 1973年：第一台商用流式细胞仪FACS I 发展方向：荧光染料的开发、细胞的制备方法、提
高电子信号的处理能力等
光学系统示意图
光信号的测定
• 散射光的测定 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向
散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗 粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°~10°)向前方散射的讯号用于检测 细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
应用：细胞生物学，肿瘤学，血液学，免疫学，药 理学，遗传学及临床检验学等
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞功能
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性
胞内细胞因子 激素结合位点
酶活性
一、流式细胞技术原理
1、流式细胞仪的基本结构：