高效液相色谱分析课件PPT
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3．操作条件Leabharlann Baidu别
GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
三、 HPLC的应用
application of HPLC
1. 环境中有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器
原理-吸附 特点-峰易拖尾 适用-分离极性化合物
2）高分子多孔小球： 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物
3．流动相
除了最基本的要求之外，主要考虑溶剂强 度，溶解度参数及极性参数等。
二、液液分配色谱法（LLC）
1．分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异 2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺
2. 离子色谱法
是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术， 其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换 容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和 电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。
3. 离子对色谱 离子对色谱是一种分离离子型化合物的特殊分
可对水果、蔬菜中的农 药残留量进行分析。
2. 稠环芳烃的分析
稠环芳烃多为致癌物质。
固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水～100%甲醇
线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 ºC 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器
第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
1．分离原理：利用组分分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
2．固定相
<>分为极性和非极性两类 <>极性固定相：
硅胶、氧化铝和氧化镁、硅酸镁分子筛等，其 中极性硅胶应用最普遍。 <>非极性固定相： 多孔微粒活性碳、多孔石墨化炭黑，以及高分 子多孔微球等。
第三章 液相色谱法简介
3.1高效液相色谱分析法的特点
一、高效液相色谱法
1. 高压 采用高压泵使流动液能迅速通过色谱柱， 一般达150×105 ～350 ×105 Pa。 2. 高速 高压带来高速，分析时间一般少于lh。 3. 高效 柱效能约可达3万塔板/米（GC的柱效约为 2000/米）。 4. 高灵敏度 由于采用了高灵敏度的检测器，最小 检测量可达10-9 g，甚至10-11 g。 5. 可用于高沸点的、不能气化的、热不稳定的以及 具有生理活性物质的分析
2．流动相的区别
GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。
HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。
1）硅胶：
<>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低
<>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。
<>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固 定液易流失，从而导致柱效降低，被键 合相填料所取代。 3．正相色谱-固定液极性 > 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱， 适于分离极性组分。 反相色谱-固定液极性 < 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适 于分离非极性组分。
4.化学键合相色谱（CPC）
键合相色谱基本上属于分配色谱，与液液分配色谱 固定相不同的是“固定液”以化学键的形式与载体结合 在一起的。
常规化学键合相
利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础） 2．特点：
不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱
二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）
三、离子色谱法（IC）
1. 离子交换色谱 凡在溶液中能够电离的物质，通常都可以用离子
交换色谱法进行分离，其主要根据固定相对待测离子 对的亲和力的差异来实现分离。 固定相类型：强阳离子交换剂（如磺酸基）
强阴离子交换剂（如季胺基） 弱阳离子交换剂（如羧基） 弱阴离子交换剂（如氨基） 流动相以水相缓冲液为主，有时加少量有机改性剂。
离模式。 采用非极性固定相分离弱酸或弱碱等可离子化
的物质时，因其在固定相上的保留作用很弱，不易 分离。故在流动相中加一种与被分析物极性相反的 离子（离子对试剂），使其与被分析物形成缔合 物，从而增加保留，提高分离度。
四、排阻色谱色谱size- exclusion chromatography
影响分离的主要因素有流动相的流量、 性质和极性。
在高效液相色谱中, 速率方程中的分子 扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两 项，即：
H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不 同，如图所示：
（1）流速：流速大于 0.5 cm/s时, H～u曲线是 一段斜率不大的直线。 降低流速，柱效提高不 是很大。但在实际操作 中，流量仍是一个调整 分离度和出峰时间的重 要可选择参数。
(2) 液体的粘度比气体大一百倍,密度为气体的一千倍, 故降低传质阻力是LC中提高柱效的主要途径。
由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。
•液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 • 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。
第三节 HPLC分离类型与原理 一、液固吸附色谱法（LSC）
GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
三、 HPLC的应用
application of HPLC
1. 环境中有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器
原理-吸附 特点-峰易拖尾 适用-分离极性化合物
2）高分子多孔小球： 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物
3．流动相
除了最基本的要求之外，主要考虑溶剂强 度，溶解度参数及极性参数等。
二、液液分配色谱法（LLC）
1．分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异 2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺
2. 离子色谱法
是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术， 其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换 容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和 电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。
3. 离子对色谱 离子对色谱是一种分离离子型化合物的特殊分
可对水果、蔬菜中的农 药残留量进行分析。
2. 稠环芳烃的分析
稠环芳烃多为致癌物质。
固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水～100%甲醇
线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 ºC 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器
第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
1．分离原理：利用组分分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
2．固定相
<>分为极性和非极性两类 <>极性固定相：
硅胶、氧化铝和氧化镁、硅酸镁分子筛等，其 中极性硅胶应用最普遍。 <>非极性固定相： 多孔微粒活性碳、多孔石墨化炭黑，以及高分 子多孔微球等。
第三章 液相色谱法简介
3.1高效液相色谱分析法的特点
一、高效液相色谱法
1. 高压 采用高压泵使流动液能迅速通过色谱柱， 一般达150×105 ～350 ×105 Pa。 2. 高速 高压带来高速，分析时间一般少于lh。 3. 高效 柱效能约可达3万塔板/米（GC的柱效约为 2000/米）。 4. 高灵敏度 由于采用了高灵敏度的检测器，最小 检测量可达10-9 g，甚至10-11 g。 5. 可用于高沸点的、不能气化的、热不稳定的以及 具有生理活性物质的分析
2．流动相的区别
GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。
HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。
1）硅胶：
<>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低
<>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。
<>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固 定液易流失，从而导致柱效降低，被键 合相填料所取代。 3．正相色谱-固定液极性 > 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱， 适于分离极性组分。 反相色谱-固定液极性 < 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适 于分离非极性组分。
4.化学键合相色谱（CPC）
键合相色谱基本上属于分配色谱，与液液分配色谱 固定相不同的是“固定液”以化学键的形式与载体结合 在一起的。
常规化学键合相
利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础） 2．特点：
不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱
二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）
三、离子色谱法（IC）
1. 离子交换色谱 凡在溶液中能够电离的物质，通常都可以用离子
交换色谱法进行分离，其主要根据固定相对待测离子 对的亲和力的差异来实现分离。 固定相类型：强阳离子交换剂（如磺酸基）
强阴离子交换剂（如季胺基） 弱阳离子交换剂（如羧基） 弱阴离子交换剂（如氨基） 流动相以水相缓冲液为主，有时加少量有机改性剂。
离模式。 采用非极性固定相分离弱酸或弱碱等可离子化
的物质时，因其在固定相上的保留作用很弱，不易 分离。故在流动相中加一种与被分析物极性相反的 离子（离子对试剂），使其与被分析物形成缔合 物，从而增加保留，提高分离度。
四、排阻色谱色谱size- exclusion chromatography
影响分离的主要因素有流动相的流量、 性质和极性。
在高效液相色谱中, 速率方程中的分子 扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两 项，即：
H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不 同，如图所示：
（1）流速：流速大于 0.5 cm/s时, H～u曲线是 一段斜率不大的直线。 降低流速，柱效提高不 是很大。但在实际操作 中，流量仍是一个调整 分离度和出峰时间的重 要可选择参数。
(2) 液体的粘度比气体大一百倍,密度为气体的一千倍, 故降低传质阻力是LC中提高柱效的主要途径。
由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。
•液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 • 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。
第三节 HPLC分离类型与原理 一、液固吸附色谱法（LSC）