第7章 化学遗传学

小分子加速蛋白质功能的研究
1878年，Langley, 研究猫唾液腺
毛果芸香碱：对腺体有直接兴奋作用。 阿托品：能解除平滑肌的痉挛，抑制腺体分泌。
药物副反应研究
其他的蛋白质靶标受到影响
副反应
负面效应
改进结构
优化成治疗其他疾病的药物
7.3.2 总则 反向化学遗传学 获得可与靶向蛋白质结合并调节该蛋白功能 的小分子。
• 2007年销售额超过40亿美元的“超级重磅炸弹”药物 有16种是生物技术药物。 • 平均一个药物的研发成本为16亿美元。 • 开发成功一种新药，往往其费用的75％以上消耗在前 期研究的失败中。 • 在化合物被作为候选药物进入临床前开发之后，仍有 99％的淘汰率。
7.2 正向化学遗传学 7.2.1 简介 正向遗传学：表型 基因
• 研究基因转录以及解释各种疾病产生的 机理 • 为新药开发提供理论依据
化学遗传学以经典遗传学为模型
基因突变
细胞和个体的变化
遗传学（Genetics）——研究生物的遗传与变异的科学
研究基因的结构、功能及其变异、传递和表达规 律的学科 。
1866年奥地利学者孟德尔根据他的豌豆杂交实 验，揭示了现在称为孟德尔定律，奠定了遗传学 的基础。
组合化学的原理
在同一个化学反应体系中加入不同的结构单 元，利用这些结构单元的排列组合系统的合成大 量的化合物。
1个化学家用组合化学方法2～6周的工作量,就
需要10个化学家用传统化学方法花费一年的时间
来完成。
Combinatorial chemistry helps narrow the search for new drugs
基因产物定位到功能变化
基因产物和表型产生的机理
小分子
与大分子相同点 组成与氨基酸、核酸等生物大分子的化学组成原子相同， 包含C、H、N、O、S、P。 与大分子不同点 通常相对分子量较低，无可重复单元，不形成多聚物。
e.g. 维生素B1，青霉素等
Diagram 左右相互作用
正向遗传学
小分子
正向化学遗传学
筛选效率 1万-------100万
筛选
10------100个
其它：RNAi方法
2. 表型筛选 测试蛋白活性改变是发展小分子探针的一个重 要方面。
小型化实验
减少开销； 空间需求； 试剂消耗； 节省时间和人力。
96孔板
384孔 1536孔
限制因素
培养基消耗
毒素积累
小空间中媒介蒸发
检测设备 • 荧光成像读板器（fluorescence imaging plate reader， FLIPR）
4.进行生物活性测试。
数据库搜寻
基于配体：确定一系列活性分子的药效构象，根 据共有药效基团从数据库中寻找含该 基团的化合物。
基于受体：使用小分子对接到受体的活性位点， 寻找合适的构象，使配体和受体的结 构及作用匹配得当。
数据库搜寻
该方法发现的化合物大多可以直接购买得到；
其合成路线也较为成熟；
或可以从专利或文献中查到。
报告基因
包含一个或多个特定的基因调节元素，与感兴趣 的信号通路中某个重要的因子的基因融合，调控下游 表达，利用报告基因产物标定目标基因的表达调控。
翻译后修饰不能使用FLIPR或报告基因的方法测定
筛选可调节修饰的小分子
研究翻译后修饰
3. 目标识别 正向遗传学依赖于当扰乱产生了一个期望的表 型时，生物系统展现可能靶标的能力。 现在的药物 确认分子靶标 优化小分子 正向化学遗传学 小分子直接处理
细胞周期及细胞代谢过程的分子；
• 找到诱导细胞分化或诱导重生等的化合物，为细胞
重置治疗、组织重生等提供工具；
肌管，边周含有肌原纤维的长条形多核胞，由 成肌细胞融合而成，最后分化成成熟的肌纤维。 两栖类动物将肌管拆解成像个体细胞一样生长、 分化的单核片段，使四肢重生。
脊椎动物肌肉可否重生？
Peter G. Schultz 使用2, 6, 9-三取代嘌呤寻找拆分微管的小分子， 在分子库中筛到一个可促进小鼠多核微管的肌管分 离为个体细胞的化合物。
Diagram 一分为二
遗传学
正向遗传学
反向遗传学
正向遗传学 Diagram 台阶式上升 采用表型筛选的方法
推断基因功能 找到基因 寻找相关的表型或性状变化 通过自发突变或人工诱导突变
Diagram 3步骤 反向遗传学
表型变化
表型改变
基因突变
经典遗传学缺点
控制难
不可逆
突变效应周期长
经典遗传学
第7章 化学遗传学
本章内容
概
述
正向化学遗传学
反向化学遗传学
7.1 概述
7.1 化学遗传学 （化学基因学）
利用遗传学原理，以化学小分子为工具解决生物 的问题，或通过干扰、调节正常生理过程了解蛋白 质的功能。 利用化学工具来探索和研究生生命过程的一门新 兴学科。
应用
• 寻找酶抑制和作用底物 • 研究细胞信号转导
产生有突变细胞或动物
小分子加入细胞或机体中
观察表型变化
观察表型变化
3圆交叉部分
经典遗传学
化学遗传学
蛋白激酶 (蛋白质磷酸化酶) 催化蛋白质磷酸化的酶类，反应中需有高能化 合物(如ATP)参加。
ATP结合位点的序列相似性高，小分子无法实 现特异结合。
蛋白激酶ATP结合位点序列具有相似性
小分子无法特异结合
从成万到上百万的小分子化合物中筛选有效分子
高通量 自动化 微量化 图像处理
COMBINATORIAL CHEMISTRY
Advances in synthesis, purification, and analysis further refine the combinatorial approach, now a mainstream tool in drug discovery .
7.2.4 小结
化学遗传学可对大范围的生物学机理和系统进 行研究分析； 通过小分子在基因产物水平扰乱生物系统，不 干扰基因本身； 为传统遗传学提供补充。
7.3 反向化学遗传学
7.3.1 简介
从基因或蛋白质与小分子化合物的相互作用 出发，研究基因或蛋白质对表型的影响,从而确 定这些生物大分子的功能。
Diagram 表格
正向遗传学 （表型
经典遗传学 任意突变 选择与表型相关的突变
基因/蛋白）
化学遗传学 小分子库加入生物系统 选择与表型相关的小分子 识别小分子与互作的 蛋白和遗传学途径
识别突变基因
Diagram 表格
反向遗传学 （基因/蛋白 化学遗传学
基因突变
表型） 经典遗传学
纯化的蛋白来筛 选小分子库
全新药物设计
根据受体活性部位的形状和性质要求，让
计算机自动构建出形状、性质互补的新分子，
该新分子能与受体活性部位很好地契合。
常用软件：LUDI
药物研发的关键
提高药物创新速度
Diagram 台阶式3栏
人类基因组 提供大量的 靶标
计算机辅助 药物设计
从化合物数 据库中筛选 或设计与靶 标结合的配 体
Y
• 活性化合物调出表型相 关的蛋白质和基因
1. 小分子的性质
a) 具有瞬时控制能力；
b) 作为调试器识别蛋白质的功能，可控和可逆的扰乱 蛋白质间相互作用的能力； c) 引起蛋白质功能失去或获得的能力；
d) 调节多功能蛋白特定功能的能力；
e) 不导致遗传基因的改变；
化学遗传学研究的关键 大量的不同结构的化合物供筛选
Diagram
20世纪70年代300 ul 90年代 10 ul
微量化
近几年
0.1 ul
正向化学遗传学-------基于细胞高通量筛选
以细胞为筛选模型，应用大规模检测技术，分析 小分子化合物对细胞形态的影响。 反向化学遗传学
蛋白植入96孔板中，测定酶反应效率或结合能力, 找到与蛋白作用的化合物。
X X Y Z Z Y
O O
O
识别蛋白质 分离得到蛋白质
筛选化合物 库
配体
决定蛋白质的功能
O
Contents
获得小分子的方法 高通量筛选
1.
2. 计算机辅助的药物设计
（1）高通量筛选
自动化、快速、灵敏；
同时对多个样品进行检测； 计算机分析数据。
以分子水平和细胞水平的实验方法为基础； 以微板形式作为实验工具载体； 以自动化操作系统执行试验过程； 以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据； 以计算机分析处理实验数据。
gene
化学遗传学
protein
化学遗传学优点
即时性：时间短
可逆性：可降解
可调性：改变浓度和分子结构 可操作性：无加入时间限制，可任意阶段加入 通用性：不受物种限制
化学遗传学
• 正向
使用化学小分子处理细胞，诱导表型变化，经 过筛选，找到小分子作用的大分子靶标。
• 反向 从基因或蛋白质与小分子化合物的相互作用出 发，研究基因或蛋白质对表型的影响。
7.3.3 应用举例
DNA合成期 CDK2
细胞周期蛋白依赖性激酶CDK 在细胞周期中控制开关的蛋白质。
寻找能够抑制CDK功能的化合物，可用于癌症研究 。
抑制剂purvalanol 嘌呤类物质通过辅酶与ATP竞争结合位点， 通过筛选嘌呤库，得到能抑制CDK1或2 的 功能化合物 purvalanol
经典突变方法，突变一个AA
筛选结合突变激酶的小分子
目标蛋白被抑制时的生命活动变化
Diagram 7.1.2 化学遗传学的意义
细胞生物学 组合化学
遗传学
• 阐释生理和病理现象的细胞和分子机制
• 使用化学小分子库进行筛选可以提高寻找新药物 靶位点的概率 • 缩短药物研发时间，减少财力投入
• 利奈唑胺 人工合成的唑烷酮类抗生素,用于治疗由特定微 生物敏感株引起的感染，如耐万古霉素肠球菌(VRE) 引起的感染。 世界上唯一可治疗VRE的药物，研发耗时9年， 传统研发需12-15年。
（2）计算机辅助的药物设计
以计算机化学为基础，通过计算机的模拟 药物与受体生物大分子之间的关系，设计和优 化先导化合物的方法。
活性位点分析
数据库搜寻或 全新药物设计
步骤
1. X射线衍射获得生物大分子与药物结合位点 的结构信息； 2.使用分子模拟软件计算和模拟结合位点的各 种理化常数； 3.通过数据库搜寻或全新药物设计寻找与该位 点想匹配的分子；
小分子研究基因产物功能
小分子活性
正向化学遗传学 使用小分子发现和研究新基因产物的功能以及小 分子的生物活性。
失活靶标
小分子的作用
使靶标获得某些活性
• 小分子化合物处理细胞 • 诱导表型变化 • 寻找小分子靶标
7.2.2 总则 正向化学遗传学方法的过程
• 小分子库
X X Z
Y Z
O
O
• 选择表型变化小分子
化合物加入到培养肌肉细胞组织中
myoseverin
能切开肌管，分离每一个细胞；
诱导合成营养辅助增生；
增生细胞开始分化后，能够自己制造肌肉。
（3）检测目标化合物附着位置
找到有作用的化合物 弄清作用的目标蛋白和机理 困难
细胞形状快速改变
推断细胞结构蛋白
加入 myoseverin
微管蛋白断裂
正向化学遗传学优点： 不仅得到控制蛋白的药物； 同时还掌握的目标蛋白。
myoseverin
Title Text
Diagram 顺序3栏 实验步骤
获得化合物
定义目标现象
100个化 合物组成 的嘌呤化 合物库
找到能分 离成熟连 接组织的 化合物
检测目标 化合物附 着的位置
（1）获得化合物 组合化学合成
建化合物库
（2）定义目标现象
• 分化的肌细胞很难继续增生，在受损伤时不能修复。 • 希望通过化合物诱导改变肌细胞分化，使之生长，连 接成管状结构。
• 包含小分子化合物的结构及生物学效应或与蛋白质 作用的信息。 • 通过化学银行系统的寻找和分析能作用于蛋白质Hale Waihona Puke Baidu 细胞的活性化合物。 • http://chembank.broadinstitute.org/
Title Text
化学遗传学获得海量小分子的核心技术
组合化学
近十几年来刚刚兴起的一门新学科 已渗透到药物、有机、材料、分析等化学的诸多领域, 目前化学领域最活跃的领域之一。
寻找表型效应
靶标识别的方法
① 对小分子修饰：使用亲和基质共价修饰小分子的细 胞萃取物来分类靶标。 ② 制备放射性识别的小分子衍生物 ③ 利用活性配体衍生物识别融合到转录区的cDNA库
④ mRNA分析，Real-Time PCR
Real-Time PCR
7.2.3 应用
• 化学小分子库筛选可以查找影响细胞内信号转导、
青蛙卵
有丝分裂易于观察
加入抑制剂purvalanol
G2到M期被破坏，DNA折叠不完全
树脂亲和柱钓出蛋白质为CDK1
反向化学遗传学是确定靶标的最好方法之一
本章掌握内容
化学遗传学
正向化学遗传学 反向化学遗传学 计算机辅助的药物设计的步骤