第三章 细胞生物学研究方法 ppt课件
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第3章 细胞生物学的研究方法1(显微镜技术)
显微镜技术
显微镜的成像原理
无论是何种显微镜，镜像的形成都需要3个基本要素：照 明系统；被观察的样品；聚焦和成像的透镜系统。
光源 聚光镜 样品 物镜
光源 透镜
射线扫描器
聚 光 镜
样品
目镜
电视屏观 察图像
直接成像
荧光屏观察 图像
光学显微技术
在细胞生物学的领域中，光学显微镜作为研究细胞显微
结构的重要工具和手段是应用最早也是最广的一种。光学显 微镜是利用可见光作光源，通过一组玻璃透镜包括目镜、物 镜、聚光镜放大被观察物体，提高分辨率的仪器。分辨率指： 人眼在25厘米的明视距离处分辨物体结构最小间距的能力。
载物台的上方：
光源
长焦距聚光器 载物台的下方： 物镜 应用：直接对培养的 细胞进行观察
荧光显微镜
原理:
荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的短波光线， 并发射出比原来吸收波长更长的光。
紫外光 可见光 红外光
λ short
long
基本构造：
A 光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 一组滤光片：得到纯的激发光和发射光
透射电镜生物标本制备过程 (自学）
(1)取材
(2)固定:防止产生结构改变。 戊二醛：在蛋白质分子之间形成共价键, 将它们交联在一起。 四氧化锇：除与蛋白共价结合外,还对脂类有良好的固定效果。 (3)脱水：标本必须置于高真空中进行电镜观察,所以电镜生物标本 不能含水。梯度乙醇。 (4)包埋:为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、 电子轰击，应在切片前将标本进行包埋,常用环氧树脂。 (5)切片:电子穿透力很弱,需将样品制成50～100nm厚薄片。约为细 胞的1/200厚度。 (6)染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成，它们散射电子能力 弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,需加大生物样品反差,进行染 色。重金属浸染。
细胞生物学实验PPT课件
细胞生物学实验ppt课件
目录
• 引言 • 细胞生物学基础知识 • 实验操作流程 • 实验结果分析 • 结论
01 引言
实验目的
01
02
03
04
掌握细胞生物学的基本 实验技能
了解细胞的结构和功能
学习细胞培养和细胞转 染技术
探究细胞信号转导的机 制
实验背景
细胞是生命的基本单位，是生物体结 构和功能的基础
能量转换
细胞中的线粒体和叶绿体 可以将光能或化学能转换 为细胞可利用的ATP等能 量形式。
信息传递
细胞通过分泌化学信号和 电信号传递信息，协调各 种生理活动。
细胞的生命活动
细胞分裂
通过有丝分裂和减数分裂，细胞 可以复制自身并产生新的子细胞。
细胞分化
在发育过程中，细胞会逐渐失去其 全能性，并获得特定的功能和形态。
定性分析
根据实验结果，对实验现象进行解释 和推理，探究可能的机制和影响因素 。
结果解读与讨论
结果解读
根据实验结果，结合理论知识，对实验结果进行解释和解读，明确实验目的和 结论。
结果讨论
对实验结果进行深入讨论，探讨实验的局限性和改进方向，提出可能的假设和 研究方向。
05 结论
实验总结
实验目的
通过实验，学生能够掌握细胞生物学的基本实验技能，了 解细胞的结构和功能，以及细胞的生命活动规律。
实验步骤
实验包括细胞培养、显微观察、细胞计数等步骤，每个步 骤都有详细的操作说明和注意事项。
实验原理
实验涉及细胞培养、显微观察、细胞计数等技术，通过这 些技术，学生可以深入了解细胞的结构和功能，以及细胞 分裂、分化等生命活动过程。
实验结果
实验结果清晰，学生能够观察到细胞的形态、结构和功能 ，并得出准确的实验结论。
目录
• 引言 • 细胞生物学基础知识 • 实验操作流程 • 实验结果分析 • 结论
01 引言
实验目的
01
02
03
04
掌握细胞生物学的基本 实验技能
了解细胞的结构和功能
学习细胞培养和细胞转 染技术
探究细胞信号转导的机 制
实验背景
细胞是生命的基本单位，是生物体结 构和功能的基础
能量转换
细胞中的线粒体和叶绿体 可以将光能或化学能转换 为细胞可利用的ATP等能 量形式。
信息传递
细胞通过分泌化学信号和 电信号传递信息，协调各 种生理活动。
细胞的生命活动
细胞分裂
通过有丝分裂和减数分裂，细胞 可以复制自身并产生新的子细胞。
细胞分化
在发育过程中，细胞会逐渐失去其 全能性，并获得特定的功能和形态。
定性分析
根据实验结果，对实验现象进行解释 和推理，探究可能的机制和影响因素 。
结果解读与讨论
结果解读
根据实验结果，结合理论知识，对实验结果进行解释和解读，明确实验目的和 结论。
结果讨论
对实验结果进行深入讨论，探讨实验的局限性和改进方向，提出可能的假设和 研究方向。
05 结论
实验总结
实验目的
通过实验，学生能够掌握细胞生物学的基本实验技能，了 解细胞的结构和功能，以及细胞的生命活动规律。
实验步骤
实验包括细胞培养、显微观察、细胞计数等步骤，每个步 骤都有详细的操作说明和注意事项。
实验原理
实验涉及细胞培养、显微观察、细胞计数等技术，通过这 些技术，学生可以深入了解细胞的结构和功能，以及细胞 分裂、分化等生命活动过程。
实验结果
实验结果清晰，学生能够观察到细胞的形态、结构和功能 ，并得出准确的实验结论。
细胞生物学细胞生物学研究方法
第三章 细胞生物学研究方法
Methodology of Cell Biology
Cells are (relatively) small and complex. How do we study them?
第三章 细胞生物学研究方法
第一节 显微技术 • 一、光学显微镜
• 二、电子显微镜
• 三、显微操作技术 第二节 细胞分离与细胞培养 第三节 细胞及其组分的分析方法 第四节 细胞生物学研究常用的模式生物
antibodies for immunocytochemistry
Immunofluorescence staining for Golgi (blue) actin (green) histones (red)
颜色†
吸收 光谱 (nm)
发射 光谱 (nm)
Alexa Fluor 蓝色 350 — 405 紫色 — 430 绿色 — 488 蓝绿色 — 500 绿色 — 514 绿色 — 532 绿色 — 546 黄色 — 555 黄绿色 — 568 橙色 — 594 橙红色 — 610 红色 — 633 红色 — 647 红色 — 660 红色 — 680 红色 — 700 红色 — 750 红色
4. 绿色荧光蛋白
Fluorescence microscopy exploits special molecules called fluorophores（荧光团）
Fluorescent dyes/fluorophores absorb light (energy) of a specific color (wavelength)
收特定波长的短波光线，并发射 出比原来吸收波长更长的光。
照明方式通常为落射式
Methodology of Cell Biology
Cells are (relatively) small and complex. How do we study them?
第三章 细胞生物学研究方法
第一节 显微技术 • 一、光学显微镜
• 二、电子显微镜
• 三、显微操作技术 第二节 细胞分离与细胞培养 第三节 细胞及其组分的分析方法 第四节 细胞生物学研究常用的模式生物
antibodies for immunocytochemistry
Immunofluorescence staining for Golgi (blue) actin (green) histones (red)
颜色†
吸收 光谱 (nm)
发射 光谱 (nm)
Alexa Fluor 蓝色 350 — 405 紫色 — 430 绿色 — 488 蓝绿色 — 500 绿色 — 514 绿色 — 532 绿色 — 546 黄色 — 555 黄绿色 — 568 橙色 — 594 橙红色 — 610 红色 — 633 红色 — 647 红色 — 660 红色 — 680 红色 — 700 红色 — 750 红色
4. 绿色荧光蛋白
Fluorescence microscopy exploits special molecules called fluorophores（荧光团）
Fluorescent dyes/fluorophores absorb light (energy) of a specific color (wavelength)
收特定波长的短波光线，并发射 出比原来吸收波长更长的光。
照明方式通常为落射式
《细胞生物学》ppt课件(2024)
叶绿体
主要功能是进行光合作用，将光能转化为化学能储存在有 机物中。其结构包括外膜、内膜和类囊体，类囊体上附有 大量与光合作用有关的色素和酶。
高尔基体
主要功能是参与蛋白质的加工、分类和包装，形成分泌泡 或分泌颗粒，将其运输到细胞表面或分泌到细胞外。其结 构包括扁平囊泡、大泡和小泡。
2024/1/30
核糖体
2024/1/30
01 02 03 04
推动医学发展
细胞生物学在医学领域有着广泛 的应用，如研究疾病的发病机理 、开发新的治疗方法和药物等。
探索生命起源与进化
通过研究细胞的起源、进化和多 样性，可以深入了解生命的起源 和进化过程，探索生命科学的奥 秘。
6
02
细胞的基本结构与功能
Chapter
2024/1/30
能量代谢的调节机制
受到细胞内能量状态、激素水平、神经调节等多 种因素的影响。
2024/1/30
14
细胞的信号传导与调控
信号传导的基本概念
信号传导的主要途径
信号传导是指细胞通过特定的信号分子和 信号通路，将外界刺激转化为细胞内生物 化学反应的过程。
包括G蛋白偶联受体信号通路、酶联受体信 号通路、离子通道受体信号通路等。
7
细胞膜的结构与功能
2024/1/30
细胞膜的主要成分
01
脂质、蛋白质和糖类
细胞膜的结构特点
02
流动性、选择透过性
细胞膜的功能
03
物质运输、信息传递、能量转换、细胞识别等
8
细胞质的结构与功能
2024/1/30
细胞质的主要成分
水、无机盐、脂质、蛋白质、糖类等
细胞质的结构特点
胶态、不均一性
主要功能是进行光合作用，将光能转化为化学能储存在有 机物中。其结构包括外膜、内膜和类囊体，类囊体上附有 大量与光合作用有关的色素和酶。
高尔基体
主要功能是参与蛋白质的加工、分类和包装，形成分泌泡 或分泌颗粒，将其运输到细胞表面或分泌到细胞外。其结 构包括扁平囊泡、大泡和小泡。
2024/1/30
核糖体
2024/1/30
01 02 03 04
推动医学发展
细胞生物学在医学领域有着广泛 的应用，如研究疾病的发病机理 、开发新的治疗方法和药物等。
探索生命起源与进化
通过研究细胞的起源、进化和多 样性，可以深入了解生命的起源 和进化过程，探索生命科学的奥 秘。
6
02
细胞的基本结构与功能
Chapter
2024/1/30
能量代谢的调节机制
受到细胞内能量状态、激素水平、神经调节等多 种因素的影响。
2024/1/30
14
细胞的信号传导与调控
信号传导的基本概念
信号传导的主要途径
信号传导是指细胞通过特定的信号分子和 信号通路，将外界刺激转化为细胞内生物 化学反应的过程。
包括G蛋白偶联受体信号通路、酶联受体信 号通路、离子通道受体信号通路等。
7
细胞膜的结构与功能
2024/1/30
细胞膜的主要成分
01
脂质、蛋白质和糖类
细胞膜的结构特点
02
流动性、选择透过性
细胞膜的功能
03
物质运输、信息传递、能量转换、细胞识别等
8
细胞质的结构与功能
2024/1/30
细胞质的主要成分
水、无机盐、脂质、蛋白质、糖类等
细胞质的结构特点
胶态、不均一性
细胞生物学全套ppt课件(共277张PPT)
激光共聚焦显微镜
结合激光扫描和共聚焦技术，实现三 维重建和动态观察，用于研究细胞内 分子定位和相互作用。
电子显微镜
利用电子束代替光束，通过电磁透镜 成像，可观察细胞的超微结构，如透 射电子显微镜和扫描电子显微镜。
分子生物学技术在细胞生物学中应用
DNA重组技术
通过体外操作DNA片段，实现基因克隆、表达和调控研究，用于 解析基因功能和调控网络。
细胞周期调控异常可能导致细胞增殖失控和肿瘤发生。因此，深入研究 细胞周期调控因子和机制对于理解细胞增殖、分化和癌变等生物学过程 具有重要意义。
06
细胞分化、衰老与凋亡
细胞分化类型和影响因素
细胞分化类型 多能干细胞分化
专能干细胞分化
细胞分化类型和影响因素
01
终末分化细胞
02
影响因素
基因表达调控
03
系。
蛋白质组学技术
利用质谱技术、蛋白质芯片等方 法，研究细胞内蛋白质组成、相 互作用和修饰等，揭示蛋白质在
细胞生命活动中的作用。
生物信息学分析
运用生物信息学方法对基因组学 和蛋白质组学数据进行挖掘和分 析，发现新的基因、蛋白质和调 控网络及其与细胞生物学过程的
关系。
THANKS
胞内外环境的稳定。
物质跨膜运输方式及机制
被动运输
01
包括简单扩散和易化扩散两种方式，不需要消耗能量，物质顺
浓度梯度进行运输。
主动运输
02
包括原发性主动转运和继发性主动转运两种方式，需要消耗能
量，物质逆浓度梯度进行运输。
膜泡运输
03
包括出胞和入胞两种方式，通过膜泡的形成和移动来实现物质
的跨膜运输。
膜蛋白功能及其调控
细胞生物学第四版(1-7)PPT课件
1. 电子显微镜与光学显微镜的基本区别 2. 电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数 3. 电子显微镜的基本构造
2021
电子显微镜的基本结构（A）和成像原 理（B）（图3-10）
2021
电子显微镜与普通光学显微镜的基本区 别（表3-1）
2021
（二）、主要电镜制样技术
1. 超薄切片技术：切片厚度一般仅为40~50nm 2. 负染色技术：用重金属盐对电镜样品进行染色的技术，使
普通光学显微镜成像示意图（图3-2 ）
2021
决定光学显微镜的分辨率的要素（图3-3 ）
D ＝ 0.61 λ∕［N ·sin(α/2)］ • D: 分辨率 • λ：入射光的波长 • N：介质的折射率（1或1.5） • α：物镜的镜口角
2021
石蜡切片的制备程序（图3-4）
2021
（二）、相差显微镜和微分干涉显微镜
2021
第二节 细胞学与细胞生物学发展简史
一、细胞的发现 二、细胞学的建立及其意义 三、细胞学的经典时期 四、实验细胞学与细胞学的分支及其发展 五、细胞生物学学科的形成与发展
2021
重要概念与学说
• 原生质体 （protoplast ）：去掉细胞壁的植物细胞或其他 去壁细胞。
• 细胞学说（cell theory ）：生物科学的重要学说之一，包 括三个基本内容：所有生命体均由单个或多个细胞组成； 细胞是生命的结构基础和功能单位；细胞只能由原有细胞 分裂产生。
2021
病毒的基本类型（图2-14）
2021
病毒结构的示意图（图2-15）
2021
戊型肝炎病毒的冷冻电镜图片（图216）
2021
在细胞核内增殖的腺病毒（图2-17）
2021
2021
电子显微镜的基本结构（A）和成像原 理（B）（图3-10）
2021
电子显微镜与普通光学显微镜的基本区 别（表3-1）
2021
（二）、主要电镜制样技术
1. 超薄切片技术：切片厚度一般仅为40~50nm 2. 负染色技术：用重金属盐对电镜样品进行染色的技术，使
普通光学显微镜成像示意图（图3-2 ）
2021
决定光学显微镜的分辨率的要素（图3-3 ）
D ＝ 0.61 λ∕［N ·sin(α/2)］ • D: 分辨率 • λ：入射光的波长 • N：介质的折射率（1或1.5） • α：物镜的镜口角
2021
石蜡切片的制备程序（图3-4）
2021
（二）、相差显微镜和微分干涉显微镜
2021
第二节 细胞学与细胞生物学发展简史
一、细胞的发现 二、细胞学的建立及其意义 三、细胞学的经典时期 四、实验细胞学与细胞学的分支及其发展 五、细胞生物学学科的形成与发展
2021
重要概念与学说
• 原生质体 （protoplast ）：去掉细胞壁的植物细胞或其他 去壁细胞。
• 细胞学说（cell theory ）：生物科学的重要学说之一，包 括三个基本内容：所有生命体均由单个或多个细胞组成； 细胞是生命的结构基础和功能单位；细胞只能由原有细胞 分裂产生。
2021
病毒的基本类型（图2-14）
2021
病毒结构的示意图（图2-15）
2021
戊型肝炎病毒的冷冻电镜图片（图216）
2021
在细胞核内增殖的腺病毒（图2-17）
2021
细胞生物学研究方法(共165张PPT)
显微镜结构：
① 机械部分：镜座、镜柱、镜臂 镜筒、调焦装置、 载物台（物镜转换器）
② 照明部分：反光镜、聚光镜
③ 光学部分：目镜、物镜
放大倍数(magnification):最终成像的 大小与原物体大小的比值。
总放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大 倍数
光学显微镜的最大放大倍数为1,000倍.
电子显微镜的最大放大倍数为 1,000,000.
荧光漂白恢复技术 在细胞生物学中的应用
分析细胞内蛋白质运输、受 体在细胞膜上的流动和大分 子组装等细胞生物学过程。
是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳 米级距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两 个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。
A)荧光漂白恢复技术 B) 相差显微镜技术 C) 微分干涉显微镜技术
两个特殊构件： 环状光阑（annular diaphragm）：位于光源 与聚光器之间。
相位板（annular phaseplate）：涂有光吸收物质和 相位推迟物质。
用途：能观察无色、透明、活细胞中的结构。
微分干涉显微镜
Human Cheek Epithelial Cells
微分干涉显微镜
•原理：利用两组平面偏 振光的干涉，加强影像 的明暗效果，能显示结 构的三维立体投影。
2 扫描电镜 （Scanning electron Microscope SEM ） 用于观察固体表面的形貌
1 透射电镜
超薄切片样品制备
电镜技术
超薄切片技术 电镜负染色技术 冷冻蚀刻电镜技术 电镜三维重构技术
超薄切片(uitrathin section) 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须 制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片 机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱 水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的 方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。
① 机械部分：镜座、镜柱、镜臂 镜筒、调焦装置、 载物台（物镜转换器）
② 照明部分：反光镜、聚光镜
③ 光学部分：目镜、物镜
放大倍数(magnification):最终成像的 大小与原物体大小的比值。
总放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大 倍数
光学显微镜的最大放大倍数为1,000倍.
电子显微镜的最大放大倍数为 1,000,000.
荧光漂白恢复技术 在细胞生物学中的应用
分析细胞内蛋白质运输、受 体在细胞膜上的流动和大分 子组装等细胞生物学过程。
是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳 米级距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两 个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。
A)荧光漂白恢复技术 B) 相差显微镜技术 C) 微分干涉显微镜技术
两个特殊构件： 环状光阑（annular diaphragm）：位于光源 与聚光器之间。
相位板（annular phaseplate）：涂有光吸收物质和 相位推迟物质。
用途：能观察无色、透明、活细胞中的结构。
微分干涉显微镜
Human Cheek Epithelial Cells
微分干涉显微镜
•原理：利用两组平面偏 振光的干涉，加强影像 的明暗效果，能显示结 构的三维立体投影。
2 扫描电镜 （Scanning electron Microscope SEM ） 用于观察固体表面的形貌
1 透射电镜
超薄切片样品制备
电镜技术
超薄切片技术 电镜负染色技术 冷冻蚀刻电镜技术 电镜三维重构技术
超薄切片(uitrathin section) 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须 制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片 机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱 水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的 方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。
细胞生物学-3细胞生物学研究方法
流式细胞仪（Flow Cytometer)
02
Charged Plates
Fluorescence Activated Cell Sorting
添加标题
1
添加标题
2
+
添加标题
3
Single cells sorted into test tubes
添加标题
4
FALS Sensor
添加标题
5
Fluorescence detector
应用：胶体金粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽聚合物等结合，因而在基础研究和临床试验中成为非常有用的工具。
免疫胶体金标定(Immunogold labeling)
利用了胶体金颗粒具有高电子密度的特性，在蛋白质与金粒子结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。因此，可以观察蛋白质的分布区域。
基本原理： 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶状溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。 胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的过程。
吸附机理：因胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸值被各种不同颜色的胶体金颗粒。
细胞培养
在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改变培养条件(如物理、化学、生物等外界因素的变化)即可进一步观察细胞在单因素或多因素的影响下的生理功能变化。
人的细胞培养
细胞系: 原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，有无限的传代能力。 细胞株: 通过原代培养或经过细胞克隆与选择而建立的、具有特异的性质或标记的细胞系，但是它们具有有限的传代能力。
02
Charged Plates
Fluorescence Activated Cell Sorting
添加标题
1
添加标题
2
+
添加标题
3
Single cells sorted into test tubes
添加标题
4
FALS Sensor
添加标题
5
Fluorescence detector
应用：胶体金粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽聚合物等结合，因而在基础研究和临床试验中成为非常有用的工具。
免疫胶体金标定(Immunogold labeling)
利用了胶体金颗粒具有高电子密度的特性，在蛋白质与金粒子结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。因此，可以观察蛋白质的分布区域。
基本原理： 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶状溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。 胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的过程。
吸附机理：因胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸值被各种不同颜色的胶体金颗粒。
细胞培养
在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改变培养条件(如物理、化学、生物等外界因素的变化)即可进一步观察细胞在单因素或多因素的影响下的生理功能变化。
人的细胞培养
细胞系: 原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，有无限的传代能力。 细胞株: 通过原代培养或经过细胞克隆与选择而建立的、具有特异的性质或标记的细胞系，但是它们具有有限的传代能力。
细胞生物学-第3章-细胞生物学研究方法(翟中和第四版)
• 相差显微镜是在普通光学显微镜的
基础上，添加 “环状光阑”和
“相差板”，将光程差或相位差， 转换成振幅差。 • 这是在构造上，相差显微镜不同于 普通光学显微镜两个特殊之处。
体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A） 和相 差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
（一）普通复式光学显微镜——样品制备
甲醛
石蜡
5μm
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
相差显微镜
发明： 1934~1935 荷兰物理学家Zernike 设计和发明相差显微 镜，并获得诺贝尔奖。
原理：利用光线干涉的原理把透过标本的可见光的光程差变 成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构之间 的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。
（Байду номын сангаас）荧光显微镜——基本原理
特点： 1. 利用汞灯或氙灯作为荧光激 发光源，波长较短，分辨 率高于普通显微镜； 2 . 核心部件是滤光片系统及专 用物镜镜头； 3. 滤光片系统由激发滤光片和 阻断滤光片组成。 应用： 对细胞内生物大分子进行 定性、定位研究。
520~560nm的 绿色荧光透过
阻断滤光片
用超速离心技术分离细胞组分
组织匀浆
差速离心
密度梯度离心
分离出各组分
用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分
密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离
二、细胞成分的细胞化学显示方法
• 显色剂与细胞组分中特殊基团的结合 • 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、 核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量
福尔根反应 Feulgen stain
基础上，添加 “环状光阑”和
“相差板”，将光程差或相位差， 转换成振幅差。 • 这是在构造上，相差显微镜不同于 普通光学显微镜两个特殊之处。
体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A） 和相 差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
（一）普通复式光学显微镜——样品制备
甲醛
石蜡
5μm
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
相差显微镜
发明： 1934~1935 荷兰物理学家Zernike 设计和发明相差显微 镜，并获得诺贝尔奖。
原理：利用光线干涉的原理把透过标本的可见光的光程差变 成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构之间 的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。
（Байду номын сангаас）荧光显微镜——基本原理
特点： 1. 利用汞灯或氙灯作为荧光激 发光源，波长较短，分辨 率高于普通显微镜； 2 . 核心部件是滤光片系统及专 用物镜镜头； 3. 滤光片系统由激发滤光片和 阻断滤光片组成。 应用： 对细胞内生物大分子进行 定性、定位研究。
520~560nm的 绿色荧光透过
阻断滤光片
用超速离心技术分离细胞组分
组织匀浆
差速离心
密度梯度离心
分离出各组分
用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分
密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离
二、细胞成分的细胞化学显示方法
• 显色剂与细胞组分中特殊基团的结合 • 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、 核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量
福尔根反应 Feulgen stain
细胞生物学的研究方法(1)
以电子束为光源
编辑课件 光学显微镜和电子显微镜下的细胞3结构
2、分辨率(resolution)
R = 0.61λ/n Sinα n=介质的折射率 ；空气为1. 油为1.5 α=样品对物镜角孔径的半角；sinα的最大值为1 λ=照明光源的波长 0.61是一个恒定的参数；表示成像的点虽被重叠但仍能 被区别的程度
1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明
DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜（Nomarki contrast microscope）
利用的偏振光 ;标本可略厚，折射率差别更大
基因注入、核移植、转基因等的显微操作
编辑课件
15
（八）、倒置显微镜
倒置显微镜特点: 物镜与照明系统颠倒 观察培养的活细胞 具有相差物镜
1）自发荧光
细胞中有些物质（如叶绿素等）紫外线照射后可 发荧光
2）诱发荧光
一些物质紫外线照射后不能发荧光，但如果用荧 光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发
荧光
编辑课件
8
荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）
编辑课件
9
2、荧光显微镜和普通显微镜的区别
1）照明方式： 通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上
（四）、暗视野显微镜
暗视野显微镜(dark field microscope) 用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大 在黑暗的背景下呈现明亮的像 反差增大，分辨率提高 观察未经染色的活体或胶体粒子
编辑课件
13
（五）、相差显微镜
相差显微镜（phasecontrast microscope）
荷兰人Zernike1932年发明，获1953年诺贝尔物理奖 作用：可观察未经染色的标本和活细胞
编辑课件 光学显微镜和电子显微镜下的细胞3结构
2、分辨率(resolution)
R = 0.61λ/n Sinα n=介质的折射率 ；空气为1. 油为1.5 α=样品对物镜角孔径的半角；sinα的最大值为1 λ=照明光源的波长 0.61是一个恒定的参数；表示成像的点虽被重叠但仍能 被区别的程度
1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明
DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜（Nomarki contrast microscope）
利用的偏振光 ;标本可略厚，折射率差别更大
基因注入、核移植、转基因等的显微操作
编辑课件
15
（八）、倒置显微镜
倒置显微镜特点: 物镜与照明系统颠倒 观察培养的活细胞 具有相差物镜
1）自发荧光
细胞中有些物质（如叶绿素等）紫外线照射后可 发荧光
2）诱发荧光
一些物质紫外线照射后不能发荧光，但如果用荧 光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发
荧光
编辑课件
8
荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）
编辑课件
9
2、荧光显微镜和普通显微镜的区别
1）照明方式： 通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上
（四）、暗视野显微镜
暗视野显微镜(dark field microscope) 用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大 在黑暗的背景下呈现明亮的像 反差增大，分辨率提高 观察未经染色的活体或胶体粒子
编辑课件
13
（五）、相差显微镜
相差显微镜（phasecontrast microscope）
荷兰人Zernike1932年发明，获1953年诺贝尔物理奖 作用：可观察未经染色的标本和活细胞
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第四节 模式生物
五、分子杂交技术
六、流式细胞技术
七、免疫学方法对细胞组分的分析
第一节 形态学研究方法
一、光学显微镜技术
（一）普通光学显微镜及其标本的制备 （二）荧光显微镜及其应用 （三）扫描激光共聚焦显微镜及其应用 （四）相差显微镜 （五）暗视场显微镜 （六）微分干涉显微镜 （七）荧光能量共振转移技术 （八）荧光漂白恢复技术
第三章
细胞生物学研究方法
Chapter 3 Methods and Techniques in Cell Biology
生物学研究一般规律
Preparatory observe put forward theoretics
Refer to knowledge
Design control tests Collect data
（一）普通光学显微镜
1、构成
Olympus显微镜的结构图
①照明系统：光源 ②光学放大系统：
物镜、目镜、聚光器和 光阑
③机械装置：镜筒、
物镜转换器、镜臂镜座、 载物台、调焦螺旋
3、主要的性能参数
（1）分辨率：显微镜能分辨的最小距离，用D表示。显微镜的鉴别距
离越小，分辨率越高。 D=0.61λ/ nsin (/2)
Explain results
Devise conclusion
Outline
第一节 形态学研究方法 一、光学显微镜技术 二、电子显微镜技术 三、扫描隧道显微镜技术
第二节 细胞组分的分析方法 一、细胞组分的分离 二、细胞组分的化学染色 三、放射自显影技术 四、显微分光光度技术
第三节 细胞培养及细胞工程 一、动物细胞的分离及培养 二、植物细胞的培养 三、细胞工程 （一）细胞融合与细胞杂交技术 （二）单克隆抗体技术 （三）细胞显微技术
（三）激光共聚焦扫描显微镜
（Laser confocal scanning microscope, LCSM）
激光作扫描光源 扫描焦平面上样品，得样品切面像 载物台上微量步进马达使载物台上下移动,改变焦平面
得不同层次的切面图像 计算机图像三维重组获样品立体图像
"显微CT"
分辨率：因激光束波长较短，光束很细，所以共 焦激光扫描显微镜有较高的分辨率，约是普通 光镜的3倍。
应用： 观察细胞形态 统计光密度来定量细胞内成分 三维重建
（四）相差显微镜
1. 1953年诺贝尔物理奖 2. 特点:
可用以观察活细胞。 3. 原理:
波长 颜色 振幅 亮度 速度 相位
⑴普通显微镜:
⑵荧光素标记抗体的方法 ①直接法：荧光素直接和第一抗体偶联。 ②间接法：荧光素先和第二抗体(抗第一 抗体的抗体)偶联，再与第一抗体作用。
5. 绿色荧光蛋白
green fluorescent protein GFP
⑴发光原理: 蓝色光 GFP 绿色荧光 ⑵特点: 可在光镜水平，对特异蛋白质等生物大
的荧光染色。 核:blue 线粒体:green 肌动蛋白:red
200ng/ml ADM 处理BNL-CL2后细胞微丝骨架的荧光观察 对照组
4. 免疫荧光显微镜技术
（Immunofluorescence microscopy）
⑴原理: 荧光抗体与标本切片中组织或细胞的 抗原进行反应，在荧光显微镜下观察到明 亮的特异荧光。
分子进行定位及显示一些细胞超微结构。 ⑶应用: a.特异蛋白质等大分子的定位
b.观察过氧化物酶体
特异蛋白质生物大分子定位
载体(GFP基因＋待定位蛋白基因) 导入特定的细胞 荧光显微镜下观察
待定蛋白质在细胞内的位置分布
观察过氧化物酶体
GFP ＋过氧化物体内的酶（有定位信号） 导入不同细胞
荧光显微镜下观察各种细胞的过氧化物酶体
D：分辨率 λ:光波的波长 n:介质折射率 α:物镜镜口角(标本在光轴的一
点对于物镜镜口的张角)
（2）孔径角：由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线L和进入物镜
中心光线OA之间的夹角/2称为孔径角。
（3）数值孔径：令N·A = nsin (/2), 叫物镜的数值孔径。
数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系，越短，NA越大，分辨率 越高。
（二）荧光显微镜 (Fluorescence microscope) 1. 原理:
荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的 短波光线，并发射出比原来吸收波长更长的光。
紫外光
可见光
红外光
short
λ
long
2.基本构造：
A 光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 一组滤光片：得到纯的激发光和发射光
5、观察标本的制备： 取材
↓
固定
↓
脱水
↓
复水
包埋
↓
↓
染色
切片
↓
↓
脱水
脱蜡
↓
透明
↓
封片
↓
观察
第一步. 固定(fixation)
目的：使大分子交联而保持固定，不至在 后面过程中移位或丢失。
试剂：甲醛、戊二醛 机理：可与蛋白质的游离氨基形成共价键， 将邻近蛋白分子交联。
第二步. 脱水
第三步. 包埋（embed）
荧光显微镜光路图
荧光的观察:
1. 自发荧光 某些天然物质本身能发出荧光，如叶绿
素。 2.二次荧光
非荧光性物质用荧光色素染色后，可产 生荧光（二次荧光），以便于进行观察 。
3.抗体荧光技术
带荧光标记的抗体与标本中的抗原结 合，这样就能通过抗体结合的荧光观察到 抗原。
4.绿色荧光蛋白
图示： 鼠主动脉平滑肌
目的：包埋使组织变得坚硬,便于切片。 试剂：蜡、树脂 机理：可进入细胞内，起支持作用。
第四步. 切片（section）
目的：切成薄片，便于切片黏附在载玻片上 进行染色。
仪器：切片机 切片厚度：1～10 m
第五步.染色（staining） 目的：使细胞成为可见. 方法： A.选择性染色 苏木精－细胞内核酸的分布 伊 红－细胞质染色 B.特异性染色 酶 + 底物 抗原 + 抗体
4、显微镜的几个光学特点
——制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65 ～ 1.78，所用 介质的折射率越接近玻璃的越好。
几种介质的折射率
——sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般 为0.05～0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。
——普通光线的波长为400 ～ 700nm，分辨力数值不会小于 0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数 为1000X。
五、分子杂交技术
六、流式细胞技术
七、免疫学方法对细胞组分的分析
第一节 形态学研究方法
一、光学显微镜技术
（一）普通光学显微镜及其标本的制备 （二）荧光显微镜及其应用 （三）扫描激光共聚焦显微镜及其应用 （四）相差显微镜 （五）暗视场显微镜 （六）微分干涉显微镜 （七）荧光能量共振转移技术 （八）荧光漂白恢复技术
第三章
细胞生物学研究方法
Chapter 3 Methods and Techniques in Cell Biology
生物学研究一般规律
Preparatory observe put forward theoretics
Refer to knowledge
Design control tests Collect data
（一）普通光学显微镜
1、构成
Olympus显微镜的结构图
①照明系统：光源 ②光学放大系统：
物镜、目镜、聚光器和 光阑
③机械装置：镜筒、
物镜转换器、镜臂镜座、 载物台、调焦螺旋
3、主要的性能参数
（1）分辨率：显微镜能分辨的最小距离，用D表示。显微镜的鉴别距
离越小，分辨率越高。 D=0.61λ/ nsin (/2)
Explain results
Devise conclusion
Outline
第一节 形态学研究方法 一、光学显微镜技术 二、电子显微镜技术 三、扫描隧道显微镜技术
第二节 细胞组分的分析方法 一、细胞组分的分离 二、细胞组分的化学染色 三、放射自显影技术 四、显微分光光度技术
第三节 细胞培养及细胞工程 一、动物细胞的分离及培养 二、植物细胞的培养 三、细胞工程 （一）细胞融合与细胞杂交技术 （二）单克隆抗体技术 （三）细胞显微技术
（三）激光共聚焦扫描显微镜
（Laser confocal scanning microscope, LCSM）
激光作扫描光源 扫描焦平面上样品，得样品切面像 载物台上微量步进马达使载物台上下移动,改变焦平面
得不同层次的切面图像 计算机图像三维重组获样品立体图像
"显微CT"
分辨率：因激光束波长较短，光束很细，所以共 焦激光扫描显微镜有较高的分辨率，约是普通 光镜的3倍。
应用： 观察细胞形态 统计光密度来定量细胞内成分 三维重建
（四）相差显微镜
1. 1953年诺贝尔物理奖 2. 特点:
可用以观察活细胞。 3. 原理:
波长 颜色 振幅 亮度 速度 相位
⑴普通显微镜:
⑵荧光素标记抗体的方法 ①直接法：荧光素直接和第一抗体偶联。 ②间接法：荧光素先和第二抗体(抗第一 抗体的抗体)偶联，再与第一抗体作用。
5. 绿色荧光蛋白
green fluorescent protein GFP
⑴发光原理: 蓝色光 GFP 绿色荧光 ⑵特点: 可在光镜水平，对特异蛋白质等生物大
的荧光染色。 核:blue 线粒体:green 肌动蛋白:red
200ng/ml ADM 处理BNL-CL2后细胞微丝骨架的荧光观察 对照组
4. 免疫荧光显微镜技术
（Immunofluorescence microscopy）
⑴原理: 荧光抗体与标本切片中组织或细胞的 抗原进行反应，在荧光显微镜下观察到明 亮的特异荧光。
分子进行定位及显示一些细胞超微结构。 ⑶应用: a.特异蛋白质等大分子的定位
b.观察过氧化物酶体
特异蛋白质生物大分子定位
载体(GFP基因＋待定位蛋白基因) 导入特定的细胞 荧光显微镜下观察
待定蛋白质在细胞内的位置分布
观察过氧化物酶体
GFP ＋过氧化物体内的酶（有定位信号） 导入不同细胞
荧光显微镜下观察各种细胞的过氧化物酶体
D：分辨率 λ:光波的波长 n:介质折射率 α:物镜镜口角(标本在光轴的一
点对于物镜镜口的张角)
（2）孔径角：由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线L和进入物镜
中心光线OA之间的夹角/2称为孔径角。
（3）数值孔径：令N·A = nsin (/2), 叫物镜的数值孔径。
数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系，越短，NA越大，分辨率 越高。
（二）荧光显微镜 (Fluorescence microscope) 1. 原理:
荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的 短波光线，并发射出比原来吸收波长更长的光。
紫外光
可见光
红外光
short
λ
long
2.基本构造：
A 光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 一组滤光片：得到纯的激发光和发射光
5、观察标本的制备： 取材
↓
固定
↓
脱水
↓
复水
包埋
↓
↓
染色
切片
↓
↓
脱水
脱蜡
↓
透明
↓
封片
↓
观察
第一步. 固定(fixation)
目的：使大分子交联而保持固定，不至在 后面过程中移位或丢失。
试剂：甲醛、戊二醛 机理：可与蛋白质的游离氨基形成共价键， 将邻近蛋白分子交联。
第二步. 脱水
第三步. 包埋（embed）
荧光显微镜光路图
荧光的观察:
1. 自发荧光 某些天然物质本身能发出荧光，如叶绿
素。 2.二次荧光
非荧光性物质用荧光色素染色后，可产 生荧光（二次荧光），以便于进行观察 。
3.抗体荧光技术
带荧光标记的抗体与标本中的抗原结 合，这样就能通过抗体结合的荧光观察到 抗原。
4.绿色荧光蛋白
图示： 鼠主动脉平滑肌
目的：包埋使组织变得坚硬,便于切片。 试剂：蜡、树脂 机理：可进入细胞内，起支持作用。
第四步. 切片（section）
目的：切成薄片，便于切片黏附在载玻片上 进行染色。
仪器：切片机 切片厚度：1～10 m
第五步.染色（staining） 目的：使细胞成为可见. 方法： A.选择性染色 苏木精－细胞内核酸的分布 伊 红－细胞质染色 B.特异性染色 酶 + 底物 抗原 + 抗体
4、显微镜的几个光学特点
——制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65 ～ 1.78，所用 介质的折射率越接近玻璃的越好。
几种介质的折射率
——sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般 为0.05～0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。
——普通光线的波长为400 ～ 700nm，分辨力数值不会小于 0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数 为1000X。