腐烂苹果中的细菌分离以及理化性质的检测

关键词： 腐烂苹果、 细菌、 平板直线划线法、 革兰氏染色、 水解淀粉、 分光光度法
Study the Bacteria of Rotten Applesin the Separation and Physical & Chemical Properties Lin jia-wan (College of life science,South China Normal University, Guangzhou 510631,China )
合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、 外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂 为主的外膜迅速溶解， 薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合 物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红复染，就使革兰 氏阴性菌呈红色。 2.2 细菌水解淀粉实验原理 某些细菌可以产生水解淀粉的淀粉酶，它能把淀粉水解为糊精、 麦芽糖、葡萄糖，再被细菌所利用。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色、 产生透明圈。菌体培养后，平板上加上卢戈氏碘液，在淀粉发生水解 的地方，淀粉-碘复合物的蓝色特征就会消失。淀粉的水解发生在离 开菌落的一段距离， 这是因为产生的胞外淀粉酶渗入到周围的培养基 中所致。若无透明圈，表明该细菌无淀粉酶。 2.3 pH 影响细菌生长实验的原理 不同微生物对 pH 条件的要求各不相同，它们只能在一定的 pH 范 围内生长，可分为生长最低 pH，生长最适 pH，生长最高 pH。 细菌一般在 pH4-9 范围内生长，生长最适 pH 一般为 6.5-7.5；在 实验条件下，人们常将培养基 pH 调至接近中性，而微生物在生长过 程中常由于糖的酵解产酸或蛋白质降解产碱而使环境的 pH 发生变化， 从而影响微生物的生长。 3 实验步骤 3.1 配制培养基 3.1.1 配制牛肉膏蛋白胨固体培养基
划成“+”字形，培养基的一边接一个种。在培养基底部做好记号， 盖上盖，倒置于 37℃下培养 24 小时； 将平皿盖打开，滴入适量卢戈氏碘液于接种处，轻轻旋转平板， 使碘液均匀铺满平板。 3.8 pH 对细菌生长的影响实验 在超净工作台内，将纯种菌接到之前做好的装有牛肉膏蛋白胨液 体培养基的三角瓶里，将已接种的 5 个三角瓶置于 37℃、200r/min 震荡培养 48 小时；将上述三角瓶取出，在分光光度计（600nm）上分 别测定培养物的 OD 值，记录好结果。
1 材料与方法 1.1 材料以及试剂
腐烂苹果 2 个、牛肉膏、蛋白胨、无菌水、结晶紫、碘液、95%乙醇、 番红、 NaCl、 可溶性淀粉、 琼脂、 卢戈氏碘液、 1mol/L HCL 以及 1mol/L NaCl(用于调节 pH) 1.2 实验用具 接种铲、接种环、超净工作台、平板培养皿、试管、酒精灯、酒精棉 球、硅胶塞、显微镜、擦镜纸、载玻片、盖玻片、吸水纸、小滴管、 牛皮纸、报纸、火柴、吹风筒、三角瓶、pH 计、分光光度计、恒温 摇床、手提式灭菌锅、移液枪、托盘天平 1.3 实验方法 平板直线划线法、镜检法、革兰氏染色法、分光光度法
表一 细菌不同 pH 的������������������������������ 值
OD600
pH影响微生物生长 2 1.5 1 0.5 0 0 2 4 6 8 10 12 pH OD600
图八 细菌不同 pH 的生长曲线
5 分析与讨论 5.1 腐烂苹果中的腐烂果肉以及完好果肉都含有细菌、霉菌 综合腐烂苹果 A 和 B 的实验现象得：完好果肉也含有细菌。只要水果 发生霉变腐烂， 各种微生物特别是各种真菌都会在腐烂水果中不断加 快繁殖，并在繁殖过程中产生大量有毒物质。这些有毒物质又不断从 腐烂部分，通过水果汁液向未腐烂部分渗透、扩散，导致未腐烂部分 同样含有微生物的代谢物。 腐烂苹果 B 的腐烂部分不长细菌的原因可能是在用酒精擦拭苹 果表面时把细菌杀死，但 2-3 天后长出了霉菌，表示酒精没有杀死霉 菌。 无论是腐烂果肉还是完好的果肉都有细菌、真菌，所以，腐烂的 水果不能吃。 5.2 平板直线划线法不能分离出单菌落 原因：在划线前，培养基放在冰箱中冷藏，划线后，在室温下的 培养基的盖皿液化形成许多小水珠，水珠掉落到划线处，造成划线失 败。 解决方法：重新配培养基，倒平板冷却后不放冰箱冷藏，直接划 线接种。 5.3 分离出的细菌是革兰氏阳性菌 镜检和革兰氏染色的图片看不清单个细菌。 原因一是挑取镜检的细 菌较多，二是该细菌非常小。该细菌有臭味这一特性，跟腐烂的水果 有臭味是相吻合。分理出的细菌是革兰氏阳性菌，阳性菌的磷壁酸抗
Abstract:Sample training bacteria from the rotten apples, and purify bacteria with flat linear crossed method; Afterexpanding the bacteria, they are tested by Microscopic examinationandGram staining, and finally,test physical and chemical properties oftheisolatedpure bacteria with Bacteria
Key
words:rotten
apples;bacteria;Flat
linear
crossed
method;Gram faerbung;hydrolyze amylum;Spectrophotometry
引言：现今，市场的水果摊位仍会出售腐烂的水果，而有些人不清楚 腐烂水果会滋生很多细菌，即使把腐烂的部分挖去，细菌也会蔓延到 其它部分。例如苹果只要烂了一个小洞，其 பைடு நூலகம் 厘米厚的果肉都已相应 变质。食用后，轻则容易引起肠道不适、腹泻呕吐等，重则会患上痢 疾或肠胃炎，甚至可能造成脱水休克。 因此，检测腐烂水果中腐烂果肉以及完好果肉的细菌性质的实 验具有重要意义。
图二 左为腐烂苹果 B 中的完好果肉，右为腐烂苹果 B 中的腐烂果肉 图二表明该腐烂苹果完好部分的细菌疯狂地长满整个培养基， 说明完 好的果肉也有细菌，腐烂果肉反而不长细菌。
图三 腐烂苹果 B 中的腐烂果肉 图三显示虽然腐烂苹果 B 中的腐烂果肉不长细菌，但 3-4 天之后，长 出了白色的霉菌。 4.2 细菌的单个菌落特征以及革兰氏染色特征
2 染色以及理化性质实验原理 2.1 细菌的革兰氏染色实验原理 先将细菌标本用结晶紫染色，再加媒染剂碘液（增加染料和细菌 细胞的亲和力） ，使它和结晶紫在菌体细胞中形成分子量较大的紫碘 复合物，然后用酒精进行脱色，最后用复染剂复红染色。假使细菌细 胞不被脱色而保留初染紫颜色者，称为革兰氏阳性菌；若被脱色，而 染上复染剂的红颜色者，称为革兰氏阴性菌。 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结 晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次 较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再 加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复
腐烂苹果中的细菌分离以及理化性质的检测
摘要： 从腐烂苹果中取样培养细菌， 用平板直线划线法分离纯化细菌， 经扩大培养后进行镜检和革兰氏染色实验， 最后对分离出的纯种细菌 进行理化性质检测：细菌水解淀粉实验以及探究 pH 对细菌生长的影 响实验。实验结果显示，腐烂苹果中的细菌形状小而圆，是革兰氏阳 性菌；水解淀粉实验说明该细菌中没有水解淀粉的酶；分光光度法所 得的数据显示该细菌的生长环境偏中碱性。
4 实验结果 4.1 腐烂苹果中的腐烂果肉以及完好果肉都含有细菌、霉菌 实验结果显示，腐烂果肉一定含有细菌和真菌，而完好果肉中可 能有细菌和真菌。果肉培养 1 天后，长出细菌，3-5 天之后长出了白 色霉菌，细菌 2-3 天之后死亡。
图一 左为腐烂苹果 A 中的腐烂果肉，右为腐烂苹果 A 中的完好果肉 图一说明该腐烂苹果的腐烂部分含有细菌，而该完好部分不含细菌。
hydrolysis starch experiment and exploring the pH of the growth of the bacteria influence experiment.The experimental results show that the bacteriain rotten applesare small, round in shape,and are gram-positive;The experiment of the bacteria hydrolysis starch indicated that those bacteria don’t have enzyme that can hydrolyze amylum;Spectrophotometry income datas showed that those bacterialike to grow in the environment of alkaline slant.
图六 保存单个菌落于试管中 4.3 细菌无水解淀粉的酶
图七 细菌水解淀粉实验图 图七 在细菌水解淀粉的测定中，滴加卢戈氏碘液的后观察到菌苔周 围没有出现透明圈，表明该细菌不含水解淀粉的酶。 4.4 不同 pH 对细菌的影响不同 经分光光度法的测定，得到不同 pH 下液体培养基的 OD 值不同， 列表如下： pH 值 ������������600 3 0.011 5 1.611 7 1.500 9 1.432 11 1.390
按比例称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂，将以上药品溶解于水 中，待药品完全溶解后再补充水分至 500ml。用 pH 试纸检测培养基 的 pH，直至达到 pH 7-7.6，将配制好的培养基分装于三角瓶中，放 在灭菌锅中 121℃灭菌 30 分钟。将灭菌的培养基倒平板和倒斜面， 做好标记放在冰箱中保存。 3.1.2 配制牛肉膏蛋白胨液体培养基 按比例称取牛肉膏、 蛋白胨、 NaCl， 将以上三样药品溶解于水中， 待药品完全溶解后再补充水分至 150ml。 用 pH 试纸检测培养基的 pH， 直至达到 pH 7-7.6，把其中的 100ml 的培养基倒入 5 个三角瓶,调节 pH 分别为 3,5,7,9,11，用作细菌悬液，把剩下的培养基分别装在 5 支试管中（用于 pH 对细菌生长影响实验的空白对照） ，调节 pH 分别 为 3,5,7,9,11,做好标记封口，放进高压灭菌锅 121 灭菌 30min，待 用。 3．1.3 配制淀粉培养基 称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl，可溶性淀粉，琼脂，并溶解在沸水 中，倒入三角瓶，封口，放进高压灭菌锅 112℃灭菌 30min。灭菌后 在无菌条件倒平板，待用。 3.2 取样培养 在超净工作台上用酒精擦拭腐烂苹果的表皮，然后用接种铲挖取 腐烂果肉以及完好的果肉，分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上， 做好标签标记，放在 37℃培养箱中培养 24 小时。 3.3 分离纯化
上述细菌经 24 小时后长出细菌，在超净工作台上用接种环挑取该细 菌，然后用平板直线划线法在牛肉膏蛋白胨划线，进行分离纯化，做 好标记并放在 37℃恒温培养箱培养 24 小时。划线分离纯化后得到纯 种单个细菌菌落。 3.4 镜检 在载玻片上滴一滴无菌水， 用无菌操作方法从培养皿单菌落中挑取 少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜；将涂片用吹风筒吹干；将载片 通过微火 2-3 次固定； 将涂片置于水平位置， 滴加染液覆盖于涂菌处， 染色 2 分钟；用自来水的细水流由载片上端流下，冲去染液；干燥水 分之后用低倍镜和高倍镜观察细菌的形态和大小， 确定该菌落是否是 单菌落。 3.5 保种 把分离纯化得到的单个菌落接在斜面培养基上，放在冰箱存放待用。 3.6 革兰氏染色 用无菌操作方法从试管斜面中沾取菌液 1 环， 用接种环在洁净的载 玻片上涂一薄而均匀的菌膜，涂菌后将接种环在火焰上灭菌；用吹风 筒吹干；将细菌涂片膜向上，通过火焰 3 次来固定细菌于玻片上；用 结晶紫初染涂片 1 分钟；水洗稍干之后，加入碘液媒染 1 分钟；水洗 稍干之后，用 95%乙醇脱色 5-20 秒；水洗稍干之后，用复红复染 1 分钟。 3.7 细菌水解淀粉酶实验 在超净工作台上，以无菌操作技术，把菌种接种在淀粉培养基上，可
图四 平板直线划线分离单菌落 图四划线材料是腐烂苹果 A 腐烂果肉中的细菌， 肉眼可见分离纯化出 了单个菌落。分离纯化得到的单个菌落湿润，正反面颜色一致，呈白
色，菌落小而微隆起，菌落与配养基结合不紧密，有臭味。
图五 细菌的革兰氏染色 图五显示，通过革兰氏染色，在显微镜下观察该细菌呈紫色，是革兰 氏阳性菌，细胞小而圆。