茶树多酚氧化酶研究进展

PPO 是一种质体酶，存在于光合植物叶绿体类 囊体以及非光合植物的质体类囊体中，如根细胞质 体、表皮细胞质体、胚轴细胞质体、顶端组织细胞质 体等。 在光合组织部位中，PPO 定位于叶绿体类囊 体膜上； 在非光合组织部位中，PPO 定位于各种质 体的囊泡中[17]。 但具有质体的组织细胞也可能不存 在 PPO，或者无 PPO 活性，例如在 C4 植物叶中，只 在叶肉组织中探测到 PPO 活性，维管束鞘细胞尽管 叶绿体丰富，却检测不到 PPO 活性[18，19]。 3 多酚氧化酶酶源及其同工酶
收稿日期：2012 - 03 - 14 基金项目：国家自然科学基金(30901161)。 作者简介：陈东生（1985- ），男，河南郑州人，在读硕士研究生，研究方向：茶及植物功能成分化学。 鄢通讯作者：larkin-liu@
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茶叶通讯
第 39 卷
酶和漆酶主要存在于微生物中，儿茶酚氧化酶则主 要分布在植物中。酪氨酸酶活性中心有 2 个 Cu2+，与 周围 N 原子和 O 原子形成 3 种不同的状态[10]，催化 氧化过程分两步：首先使单酚及其衍生物邻位羟基 化，生成邻二酚及其衍生物；二是氧化邻二酚及其 衍生物生成相应的醌。 漆酶的催化氧化作用主要表 现在使底物生成自由基和酶分子中 Cu2+的协同传递 电子和价态变化[7～11]。 漆酶的催化底物范围很广，可 以催化单酚、三酚、邻酚和对位二酚。 此外，漆酶还 可催化氧化维生素 C、对苯二胺等[12，13]。 酪氨酸酶和 漆酶工程菌已得到成功构建并表达[14，15]。
Abstract: Polyphenol oxidase (PPO) is prevalent in tea plants(camellia sinensis), especially as the key enzyme during the black tea production. PPO oxidizes catechins into theaflavins, which are the essensial quality components of black tea and have a decisive effect on the color, aroma and flavor of black tea. Key words: Black Tea，Theaflavins，Polyphenol Oxidase
多酚氧化酶是一类末端氧化酶，酶分子由主酶 和金属辅基组成[1]。 多酚氧化酶在自然界中分布极 广，广泛存在于植物体内，能够催化氧化多酚类物 质生成醌，在茶树生理代谢及茶叶加工等过程中对 产品品质形成有极为重要的作用， 也是植物叶子、 果实等褐变的主要作用酶类 。 [2～4] 茶树多酚氧化酶 (Polyphenol Oxidase, PPO)的研究始于 19 世纪末 20 世纪初[5]。 茶树 PPO 分子量大小为 144000±16000， 最佳底物为邻苯二酚，适宜的 pH 范围为 5～7，最适 pH 值为 5.7(以邻苯二酚为底物)[6]。 多酚氧化酶以其 在红茶加工中的重要作用受到广泛关注和研究。 本
竹尾忠一研究红茶制造中 PPO 的活性变化后 发现鲜叶中 PPO 活性在茶叶萎凋过程中逐渐增加， 酶活性随萎凋温度提高而有较快增长。 不论轻萎凋 或重萎凋，PPO 活性均有快速增加[16]。 但另有研究表 明 PPO 活性随茶鲜叶的失水而活性降低，适当补充 水分后，PPO 活性又得到恢复。 刘仲华等研究发现， PPO 活性随萎凋过程中茶叶失水而提高，含水量为 65%左右时活性达到顶峰， 但进一步过度萎凋使 PPO 活性降低。 总之，萎凋过程中 PPO 活性的提高 有重要的意义，是红茶制作工序中的关键步骤[4０]。
Tanaka T. 等研究多种供试材料后发现这些材 料匀浆液均可氧化 EC 和 EGC 形成茶黄素，其中枇 杷、日本梨和蓝梅合成茶黄素的能力比茶叶强[20]。 吴 红梅用不同材料和不同方法提取 PPO 并制取茶色 素发现，茶、苹果、梨的 PPO 制取茶色素效果为佳[21]。 李适用毛栓菌 PPO 氧化儿茶素，产物中酯型茶黄素 比例较高[22]。 赵淑娟进行微生物菌种筛选后得到一 株产 PPO 菌株， 对其进行发酵试验测得其酶活为 256U/mL[23遍分布于植物体各器官和组织内。 其含量和活性随 植物体的生长而不断变化，分子量大小也因植物种 类不同，同一种植物的部位不同、同一部位的多基 因家族的控制成员不同而不同，且受植物生长条件 的影响，具有空间和时间特异性。
按溶解状态茶叶 PPO 分为游离态和束缚态两 大类。 前者主要存在于细胞液中，为可溶态；后者较 前者多而且主要存在于叶绿体、 线粒体等细胞器 中，并与这些细胞器膜特异结合，为不溶态[16]。 2 多酚氧化酶的细胞学定位
PPO 作为红茶发酵中的关键酶，对茶叶品质的 形成至关重要，对茶叶适制性有很大的影响。 茶叶 中 PPO 含量高、活性大，有利于红茶品质形成与积 累，适制红茶；反之则适制绿茶。 红茶在发酵过程中 利用茶叶自身酶系发生一系列化学反应，形成红茶 特有的色、香、味。 绿茶加工需要杀青，要高温使 PPO 迅速失活， 失去酶促氧化功能以生产优质绿 茶；而在红茶加工中则需要 PPO 充分发挥其酶促氧 化功能， 催化儿茶素类物质氧化形成茶色素类物 质。 儿茶素类底物氧化触发了一些香气前体物质的 偶联氧化，生成各种各样的香气成分，从而形成红 茶特有的品质。
Research Progress on Polyphenol Oxidase of Tea Plant
CHEN Dong-sheng, WANG Kun-bo, HUANG Jian-an, LIU Zhong-hua*
（National Research Center of Engineering Technology For Utilization of Functional Ingredients From Botanicals, Key Laboratory of Ministry of Education for Tea Science, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China）
第 39 卷第 2 期 第2021期2 年 6 月
茶叶通讯
TEA COMMUNICATION
Vol.39，No.2 June，2012
茶树多酚氧化酶研究进展
陈东生 王坤波 黄建安 刘仲华 *
（国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南农业大学茶学教育部重点实验室·长沙·410128）
摘 要：多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)是茶树(camellia sinensis)中普遍存在的一种酶，是红茶制作中品质形成的关键酶类。 多酚氧化酶可催化氧化儿茶素类物质形成茶黄素类(TFs)色素，而后者对红茶色、香、味等品质形成具有关键作用。 关键词：红茶；茶黄素；多酚氧化酶
与其他真核基因不同，已克隆的番茄、蚕豆、烟 草、甘蔗、杏、美洲商陆、葡萄、日本梨、桃等的 PPO 基因均不含内含子[3２]。 陈忠正等以英红 9 号茶叶为 材料，克隆得到 PPO 基因全长序列，发现茶树 PPO 基因也没有内含子[3６]。 郝欣以福鼎大白等茶叶为材 料， 分别从基因组 DNA 和 RNA 入手， 克隆得到 PPO 基因全长序列， 两种产物的核酸序列一致，同 样说明茶树 PPO 基因不含内含子[3７]。 但研究发现香 蕉、菠萝等 PPO 基因中有小片段内含子[3８,３９]。 6 多酚氧化酶的生理功能 6.1 多酚氧化酶与红茶品质的关系
茶叶 PPO 同工酶的研究始于 20 世纪六七十年
代。 Buzun 等通过聚丙烯酸胺凝胶电泳分离出了 6 种 PPO 组分，并测算出其分子量[24]。 安徽农学院从 福鼎大白茶等材料中分离出 PPO 同工酶 6～7 条，它 们均可促进邻苯二酚氧化，对表没食子儿茶素没食 子酸酯、邻苯二酚氧化最为显著[25]。 刘仲华等从茶鲜 叶中分离得到六条同工酶带，按照迁移率由小到大 排列依次为 PPO1～PPO6，其中 PPO2、PPO4、PPO6 对多 酚类敏感性较强， 而 PPO1、PPO3、PPO5 对多酚类敏 感性不强。 在催化儿茶素氧化聚合形成茶黄素(TFs) 的过程中， 各同工酶所起作用由大到小依次为： PPO1、PPO3、PPO5、PPO2、PPO4、PPO6。 PPO1 不仅热稳 定性好，也成为最终唯一残留的 PPO 组分 。 [26] 葛超 等研究发现不同品种梨的 PPO 同工酶的带数、迁移 率和区带染色情况也存在差异[27]。 王坤波研究发现 不同来源 PPO 同工酶的酶带相似， 但酶带数目、Rf 值及分子量均有差异：梨有 11 条同工酶带，苹果 4 条，茶叶 5 条，蘑菇 5 条，而漆酶只有 1 条。 酶带 Rf 值集中在 0.40～0.70； 茶叶 PPO 同工酶的相对分子 量大于 94kDa。 并分析比较得出不同来源 PPO 合成 茶黄素能力由大到小为：梨 PPO，茶叶 PPO，微生物 PPO，苹果 PPO，漆酶 PPO，蘑菇 PPO。 在所有供试梨 品种中，丰水梨 PPO 同工酶谱带最多，酶活性最大， 合成茶黄素的能力最强[28]。 4 多酚氧化酶的蛋白质结构
现有研究表明 PPO 定位于质体膜上。 PPO 首先 在细胞质中合成含有转运肽(导肽)的前体肽，导肽 引导 PPO 进入质体后被切除，PPO 成为有活性的成 熟蛋白[2]。 导肽通常位于 N 末端，含有 80～90 个氨基 酸， 蛋白酶切割的位点一般是丙氨酸-丝氨酸或丙 氨酸-丙氨酸之间[２９]。 导肽 N 端含大量的亲水性氨 基酸残基，C 端约有 50%疏水氨基酸残基[3０]。 在 PPO 的 C 端非编码区还含有一些糖类，可能对维持 PPO 的正确构象起作用。 植物 PPO 具有高度的同源性， 功能活性部位都有两个富含组氨酸(His)的铜离子结 合区 (CuA 和 CuB)，CuA 区和 CuB 区各有 3 个保守 的 His， 通过配位键形成特定的空间三维结构 。 [15] Klabunde 对成熟 PPO 进行晶体衍射研究印证了铜 离子与组氨酸共价结合， 其中 H88、H109、H218 与 CuA 共价结合，CuB 与 H240、H244、H274 共价结合[3１]。 5 多酚氧化酶的基因结构