血管内皮抑制素

血管内皮抑制素(Endostatin)和衍生物(中国商品名:恩度)

(一)血管内皮抑制素的发现

1997年，Folkman等首先报道从小鼠血管内皮细胞瘤中得到一种具有抑制血管生成的因子，经N端氨基酸序列测定表明，该物质为ⅩⅧ型胶原C-末端的184个氨基酸片段，被命名为血管内皮抑制素(Endostatin，ES)。人体血液循环中有极微量Endostatin存在。O’Reilly等(1997年)利用重组后并纯化的Endostatin进行体外试验，证明Endostatin对牛毛细血管内皮细胞、牛肺主动脉内皮细胞有特异的抑制增殖作用，而对非血管内皮细胞系细胞、平滑肌细胞等则无增殖抑制作用。随后又进行了体内药效学试验，证明Endostatin 可抑制鸡胚绒毛尿囊膜毛细血管的生长，对接种Lewis肺癌、T 241纤维肉瘤和B16F10黑素瘤的小鼠具有明显的肿瘤抑制作用。免疫组化的实践表明，Endostatin能阻断血管生成。Michael等(1997年)实验显示，血管内皮抑制素是通过抑制肿瘤新生血管的形成从而对原发和转移瘤均表现极强的特异的抑瘤活性;并且动物实验中发现反复使用内皮抑制素也不会产生耐药性。

Entre Med公司于1998年10月至2000年7月在美国的3个癌症中心进行了重组人血管内皮抑制素的Ⅰ期临床试验。我国山东先声麦得津生物工程有限公司首家开发了Endostatin(Jia等，2006年)，商品名为“恩度”。与国外产品不同的是，Entre Med公司采用的是酵母菌作为表达载体，而恩度是采用大肠埃希菌，且在ES母体上添加了9个氨基酸的新型Endostatin，不仅使ES稳定性提高，半衰期延长，而且生物活性增加，纯度> 99.9%，蛋白性质稳定，可以在室温放置1年仍然保持活性，而国外的同类产品则需-80℃冷冻保存。

(二)血管内皮抑制素的作用原理

Hajitou等(2002年)研究显示，Endostatin能下调VEGF mRNA和蛋白表达，作用于VEGF的受体KDR/Flk-1，从而抑制VEGF介导的内皮细胞迁移和血管生成。Endostatin还与bFGF竞争结合，干扰其信号传导通路。

基质金属蛋白酶MMP-2在血管生成中发挥重要作用，Endostatin能结合MMP-2 的催化活性区，阻断其作用。

Endostatin能结合于Tropomyosin，破坏微丝的完整性，抑制内皮细胞的迁移，诱导其凋亡，发挥抗肿瘤作用。

Endostatin能抑制Wnt信号通路，促进α-catenin的降解，抑制内皮细胞移动，导致内皮细胞停滞在G1期，减少内皮细胞在S期的比例，从而引起细胞周期停滞。

Endostatin对于血管内皮细胞凋亡的影响可能与诱导酪氨酸激酶活性，抑制bcl-2、bcl-xl和bad表达有关，而没有改变bax、p53、cdc-5A、p38 MAPK等的基因表达。

Endostatin能下调体内的促血管生成因子，上调体内的血管生成抑制因子，通过改变血管生成调节因子的平衡关系，发挥抗血管生成作用。根据Folkman等(2006年)的研究结果，Endostatin可抑制65种肿瘤生长，影响占人类基因组12%的与血管生成相关的基因发挥抗血管生成作用。

国内学者如Ling Y等(2007年)通过动物体外和体内实验，对恩度的抗血管生成作用机制进行了研究，结果显示恩度在体内外均有明显的抑制血管生成作用，机制可能在于阻断了血管内皮生长因子(VEGF)介导的促血管生成信号转导通路(VEGFR2)。罗永章等2007年在《Blood》网络电子版文章“核仁蛋白是介导血管内皮抑制素抗血管生成以及抗肿瘤活性的受体”中指出，核仁蛋白(Nucleolin)是血管内皮抑制素的新型功能性膜受体。他的研究首次证实血管内皮抑制素与新生血管的内皮细胞膜上的核仁蛋白高亲和性结合后内化，并转运入核，抑制核仁蛋白的磷酸化，从而抑制血管内皮细胞增殖的过程。这可能是Endostatin发挥特异性抗血管生成以及抗肿瘤活性的细胞内分子通路之一。

综上所述，血管内皮抑制素有以下潜在优势：①由于血管内皮细胞的基因组较为稳定，针对血管内皮细胞的治疗不易获得耐药

性;②正常成熟组织毛细血管内皮细胞处于静止状态，而肿瘤血管内皮细胞增殖活跃，出现许多相对特异的标记分子，如VEGF受体、E-selectin、Tie受体等，它们的表达较正常静止内皮细胞可高达50倍以上，是潜在的抗肿瘤血管靶向分子;③由于肿瘤血管本身是药物的靶部位，因此，药物易于到达并在局部形成较高浓度;④从理论上推算，一个内皮细胞要饲养50～100个肿瘤细胞。因此，针对血管内皮细胞比直接针对肿瘤细胞更为有效;⑤肿瘤生长的血管依赖性为所有肿瘤共性，即使血液系统的非实体性肿瘤，如急性淋巴细胞性白血病等，在骨髓中也有大量新生血管的形成。

需要指出的是，血管内皮抑制素是一个广谱的血管生成抑制剂，能阻断多种血管生长因子诱导的血管生成。它有多个靶点，如VEGF、bFGF、bFGF受体、HIF1、EGF受体、ID-1、Neuropilin、Thrombos、pondin-1、Maspin、HIF1α、inhibitor、TIMP-2等。因此，针对肿瘤血管治疗策略具有抗瘤的“广谱性”，在理论上适合对不同肿瘤的治疗。

(三)Endostatin和恩度的应用及疗效

1. Ⅰ期临床研究

在美国多中心医院所进行的Ⅰ期临床试验中，初步观察了美国Entre Med公司研制的rh-Endostatin的疗效。其中MD Anderson 癌症中心报道了1例恶性上颌骨瘤患者接受300 mg/(m2·日)治疗2个月后，经磁共振成像(MRI)扫描，测量肿瘤萎缩了50%以上。

Dana-Farber医院1例神经内分泌瘤患者接受1年治疗后，肿瘤萎缩了约20%。另外，还有12例患者接受了4～12个月的rh-Endostatin治疗。其中至少有5例患者经4 个月短期治疗、2例患者经1年治疗后病情得到稳定。MD Anderson癌症中心通过正电子发射断层成像系统(PET)扫描肿瘤血流速度及代谢的方法观察到在一些患者体内肿瘤周围血流速度及代谢减慢。此外，该中心使用015PET摄影发现，随着药物剂量的增加，血流速度明显减慢。Wisconsin大学(Thomas等，2003年)用rh-Endostatin治疗21例患者56日后，发现流经心脏的血量没有改变，而流经肿瘤的血流量减少。Dana Farber医院发现药物的剂量与血清中促血管生成的生长因子(尿中的bFGF、VEGF)的含量有一定关系。随着rh-Endostatin剂量的增加，许多患者尿中的bFGF、VEGF含量降低。常见的不良反应有贫血、深静脉血栓、呼吸困难、发热和胃肠反应。

国内杨林等于2001年8月至2002年3月对恩度进行了Ⅰ期临床试验。结果显示，人体对恩度耐受性良好，在210 mg/m2最大耐受剂量下未出现严重不良反应;而7.5 mg/m2剂量组除1例出现轻度胸闷外，其余未出现不良反应，且初步观察治疗肿瘤疗效较好。在连续给药耐受性试验中，10例肿瘤患者于治疗结束时和治疗结束2周后，观察X线片、CT、MRI、B超、骨扫描等指标，与治疗前比较，在30 mg/m2剂量组的3例肿瘤患者中，2 例乳腺癌患者病情稳定(SD)，1例胃癌患者病情进展(PD);在15 mg/m2剂量组的3例肿瘤患者中，1例黑色素瘤患者病情好转(MR)，1例肝癌患者病情稳定