青霉素

发酵工艺要点及过程
1．种子丝状菌的成产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25℃培养7天，真空干燥并以这种形式保存备用。

生产时它按一定的接种量移植到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内，26℃培养56小时左右，菌丝浓度达6～8%，菌丝形态正常，即按10～15的接种量移入含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内，27℃培养24小时，菌丝体积10～12，形态正常，效价在700u/ml左右便可作为发酵种子。

球状菌的生产种子是由冷冻管孢子经混有0.5～1.0%玉米浆的三角瓶培养原始亲米孢子，然后再移入罗氏培养生产大米孢子（又称生产米）。

亲米和生产米均为25℃静置培养，需经常观察生长发育情况，从培养到三至四天，大米表面长出明显小集落时要振摇均匀，使菌丝在大米表面能均匀生长，待十天左右形成绿色孢子即可收获。

亲米成熟接入成产米也许经过激烈震荡才可放置恒温培养，生产米的孢子量要求每粒300万只以上。

亲米、生产米孢子都需保存在5℃冰箱内
工艺要求将新鲜的生产米（指收获后的孢瓶在十天以内使用）接入含有花生饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主的种子罐内，28℃培养50～60小时。

当PH由6.0～6.5下降至5.5～5.0，菌丝呈菊花团状，平均直径在100～130微米，每毫升的球数为6～8万只，沉降率在85%以上，即可根据发酵罐球数控制800～11000只/毫升范围的要求，计算移种体积，然后接入发酵罐，多余的种子液弃去。

球状菌以新鲜孢子为佳，其生产水平优于真空干燥的孢子，能使青霉素发酵单位的罐批差异减小
2. 培养基
(1) 碳源青霉素能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、天然油脂等。

乳糖由于它能被生产菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，为青霉素发酵最佳碳源。

但因现货源少，价格高普遍使用有困难。

天然油脂如玉米油、豆油等也能为青霉素缓慢利用作为有效碳源，但作为大规模使用，不论在来源和经济上都是不可能的。

目前生产上所用的主要碳源是葡萄糖母液和工业葡萄糖，最为经济合理。

（2）氮源早期青霉素生产由于采用玉米浆使产量有很大提高，至今国外仍为青霉素发酵的主要氮源。

玉米浆是淀粉生产的副产物，含有多种氨基酸如精氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸以及β-苯乙胺等，后者为苄青霉素生物合成提供侧链的前体。

以引进球状菌为例，氮源中玉米浆占一半以上。

现国内玉米浆产量少，且因工艺条件不同使质量亦不够稳定，因此经调整配方，以花生饼粉代替玉米浆，生产水平也可达到引进提供的技术指标，但发酵激烈，装料系数受些影响。

目前生产上所用的氮源主要是花生饼粉、麸制品、玉米胚芽及尿素等。

（3）前体国内外青霉素发酵生产作为苄青霉素生物合成的前体有苯乙酸（或其盐类）、苯乙酰胺等。

它们一部分直接结合到青霉素分子中，另一部分是作为养料和能源被利用，即被氧化成二氧化碳和水。

这些前体物质对青霉菌都有一定的毒性，特别是苯乙酰胺毒性更大。

苯乙酰胺和苯乙酸浓度大于0.1%对青霉素生产菌生长和生物合成均有毒性，用量加到0.3%菌丝基本不长。

前体的毒性取决于培养基的PH。

苯乙酰胺在碱性PH时毒性较大；在中性PH时苯乙酰胺毒性大于苯乙酸；而苯乙酸在酸性PH下毒性较大。

为此，在整个发酵过程中前体在任何时候加入的量都不能大于0.1%。

加入硫代硫酸钠（俗称大苏打）能减少它们的毒性。

国外报道有利用苯乙酸脂类、醇类作为前体以代替苯乙酸，并证实某些脂类是较满意的前体。

国内首先由山东师范学院合成苯乙酸月桂醇脂推广应用于青霉素发酵摇瓶和实验罐，随着用量增加，发酵单位也迅速提高，发酵周期为七天，用量以1.25～1.5%
为宜。

由于苯乙酸月桂醇脂做前体用于青霉素发酵首先分解为苯乙酸，然后才能被产生菌合成青霉素时用，所以在生长旺盛时期需要加入苯乙酰胺作补充前体，若再加0.01%洁尔灭效果更好。

（4）无机盐①硫和磷：青霉素泡液中含有硫和磷，此外青霉素的生物合成也需要硫。

据国发报道，硫浓度降低时青霉素产量减少三倍，磷浓度降低时青霉素产量减少一倍。

②钙、镁和钾青霉素生物合成中合适的阳离子比例以钾30%、钙20%、镁41%为宜。

阳离子总浓度以300毫克当量/升培养液时青霉素产量最高。

如镁离子少，钾离子多时，菌丝细胞将培养基中氮源转化成各种氨基酸的能力强。

钙离子影响细胞的生长和培养基的PH。

③铁离子：铁易渗入菌丝中，在青霉素分泌期铁离子总量的80%是在胞内，它对青霉素有毒害作用。

发酵液中铁含量6微克/毫升时无影响；60微克/毫升时青霉素产量降低30%，300微克/毫升时降低青霉素产量90%。

青霉素发酵工艺控制主要有以下几个方面：
（1）加糖控制
（2）补料及添加前体
（3）pH控制
（4）温度控制
（5）通气与搅拌
（6）泡沫与消沫
（7）球状菌发酵的注意点：
①严格控制孢子培养基中大米的含水量它直接影响孢子的质量和数量
②严格控制孢子的移种令，特别是球态、球数和沉降率。

若超过60小
时还未达到移种标准时要慎重考虑该种子是否能用于生产。

③严格控制发酵液的球数，过多过少均不利。

并要控制球体形态。

球态
过紧说明通气量过大，可适当降低流量或减慢搅拌转速；球态过松说明通气不
足，应增大空气量或加快搅拌转速。

④发酵浓度以50%为宜。

⑤严格控制苯醋酸加入量，其残量以0.1%为宜。

染菌及异常情况处理：
若发酵罐前期染菌或种子带菌，一般可采用重新消毒并补加适量的糖氮成分。

中后期发生染菌若是产气细菌则应及时放罐过滤、提炼，事后彻底消毒处理。

若遇发酵罐前期菌丝生长不良，发酵异常时可采取倒出部分发酵液，补入部分新鲜料液和良好的种子。

遇单位停滞不长可酌情提前放罐。

二、提炼工艺要点
根据青霉素不稳定的性质，整个提炼过程应在低温、快速条件下进行，并严格控制pＨ值，注意对设备清洗消毒减少污染，尽量避免或减少青霉素效价的破坏和损失（一）发酵液的预处理和过滤
发酵液放罐后，首先要冷却。

因青霉素在低温时较稳定，同时细菌繁殖也较慢，可避免青霉素迅速破坏，发酵液除冷却外还需预处理，如果发酵液不经预处理而直接过滤，虽能除去大部分不容性固体杂质，但在滤液中还会剩余一部分微小颗粒和易溶性蛋白质等物质，滤液外观是浑浊的，假若不除去这部分杂质，会给后部提炼带来很大困难。

为了要除去这部分杂质，所以要对发酵液进行预处理。

由于青霉菌菌丝较粗，除出现菌丝自溶和发酵然杂菌的情况外，一般过滤较容易。

目前采用鼓式过滤机及板框过滤机过滤。

为了加快滤速和缩短工时，可利用发酵菌液的菌体作为助滤剂。

由于发酵液中含有过剩的碳酸钙，在酸化时会有部分溶解，使钙离子成游离状态，
在酸化萃取时，遇到大量硫酸根离子（SO 42-）会形成硫酸钙沉淀。

故酸化时pH 应控制略高
些，一般控制在5.4～6.0之间，作为助滤剂的发酵体积一般不超过该发酵液体积的3
1。

（二）影响青霉素提取的主要因素
青霉素提取效果除了已选定适当的有机溶媒，破乳化剂和分离设备外，还与下列主要因素有关：
1. pH 值 结合青霉素在各种pH 下的稳定性（见表5～5）和青霉素在醋酸丁酯及水中的分配系数（见表4～3）以及青霉素的pK 值（25℃时为
2.76）一般从滤液萃取到醋酸丁酯时pH 选择在1.8～2.2范围内，而从丁脂反萃取到水相时,pH 选择在6.8～7.2之间。

从青霉素的化学反应知道，青霉素在酸性条件下极易水解破坏，生成青霉素酸，但根据pK 值要求，有一定要在酸性时才能转移到有机溶媒中去，这是个矛盾，因此选择合适的pH 值非常重要。

目前生产上采用上述pH 值，转移比较安全，而破坏又较少，因此收得率尚高；青霉素从有机溶酶转移到水中时，选择上述pH 值也较适宜。

因为在中性条件下青霉素以盐的形式溶于水中，转移也较安全。

如果碱性过强，则易发生碱性水解，而且杂质也易转移到水相中质量较差。

青霉素转移到水相中，统称为缓冲溶液（一次或二次），这与化学上“缓冲溶液”有所差别。

化学上所指的缓冲溶液有一定的pH 值，当加入少量酸或少量碱时其pH 值只有很小的波动。

生产上所指的缓冲溶液为青霉素溶在水溶液的总称。

2.温度 根据表5—5温度对青霉素稳定性的影响，因此要求提取在低温（一般要求在10℃以下）条件下进行较为有利。

在提取设备上要考虑用冷盐水（夹层或蛇管）进行冷却，以降低温度，特别是酸化岗位，温度要求更低些。

青霉素在缓冲液中，由于较稳定故温度影响不太大。

3.时间 除了严格控制pH 和低温条件外，青霉素在提取过程中停留时间越短越好。

因此要求操作熟练设备良好，不发生故障。

酸化提取时速度应快些，数秒钟液体充分混合后应立即分离，使青霉素游离酸尽快的转移到醋酸丁酯中（因为青霉素游离酸在丁脂中比青霉素盐类在水中要稳定得多）。

根据实验结果得知，青霉素在0～15℃条件下，在丁脂中放置24小时不致损失效价（但在室温下损失可达5.32%）。

碱化提取时速率可放慢些因为青霉素在中性条件下半衰期要长些，破坏情况要缓和些，故以能分离得清为原则。

4.萃取方式和浓缩比 根据萃取方式及理论收率的计算得知，多级逆流萃取较理想。

目前生产上多采用二级逆流萃取方式。

浓缩比的选择性也很重要，因为丁脂的用量与收率和质量都有关系。

如果丁脂用量太多，虽然萃取较安全，收率亦高，但达不到收结晶浓度要求，反而增加溶媒的消耗用量；如果丁脂用量太少，则萃取不安全，影响收率。

据国外报导，丁脂用量为滤液体积的25～30%时，色素相对含量低，青霉素的纯度最高，称之为丁脂用量的最佳条件。

目前生产上从滤液萃取到丁脂时，浓缩比为1.5～2.5倍，即一次丁脂萃取液的浓缩倍为1.5～2.5倍。

从丁脂反萃取到水相时，因分配系数之值较大，故浓缩倍数可较高些，一般为3—5倍。

经过几次反复萃取后共约浓缩10倍左右，浓度已符合结晶要求。

（三）结晶
结晶是提纯物质的有效方法。

例如在第二次丁脂萃取液中，青霉素的纯度只有70%左右，但结晶后纯度可提高至98%以上。

青霉素的结晶有很多方法，现主要用碱金属盐的结晶方法。

1.青霉素钾盐结晶 青霉素游离酸在有机溶媒中的溶解度是很大的，但是它与某些金属或有机胺结合成盐之后，由于极性增大，溶解度大大减小而且自溶媒中析出。

例如青霉素游离酸的丁脂提取液加入醋酸钾、醋酸钠或丙二酸钙盐，就分别出现了青霉素钾盐，钠盐或钙盐的结晶。

它和醋酸甲的化学反应式如下：
溶液中的水分，酸度和温度对青霉素钾盐在此溶液中的溶解度有很大影响。

水分含量高，溶解度增大，温度上升，溶解度降低；酸度大则溶解度增大。

（1）水分的影响 反应液中水分可以溶去一部分杂质，可提高晶体质量，但收率要下降，因此水分应控制在0.9%以下，则影响收率较少。

同时要求乙醇——醋酸钾溶液的水分控制在9.5～11%范围内，醋酸钾浓度在46～51%范围内，应注意醋酸钾浓度高低与水分含量浓度高低成正比较好。

如果醋酸钾浓度高，而水分含量低，则醋酸钾在配置过程中易析出结晶。

如果二次丁脂提取液水分含量低于0.75%以下，加之醋酸钾溶液水分也低，会使结晶包含色素多而色深，影响晶体色泽。

如果配置醋酸钾溶液水分过高（在12～12.5%），再加上二次丁脂提取液中水分含量，整个反应母液中总水量增加，就会影响结晶收率。

（2）温度影响 温度高时结晶速率快，晶体细小；温度高低结晶速率慢，晶体细粗大。

另外反应也与污染数高低有关。

一般污染数在0.5%以下，结晶温度控制在10～15℃污染数在0.5%以上，则结晶温度控制在15～20℃。

（3）污染数高低对结晶的影响 杂酸与青霉素含量之比值称为“污染数”（即污染数=青霉素酸
杂酸）。

总酸量可以用氢氧化钠滴定求得，青霉素含量可以旋光法测定，两者之差表示杂酸含量。

上述工艺条件要求污染数在0.5%左右，污染数高会使感应速率降低，生成的晶体略大些结晶收率低；而污染数低使反应速率快，生成的晶体颗粒较小。

同时杂酸的存在能污染晶体，影响晶体质量。

（4）青霉素与醋酸钾摩尔比关系 根据上述反应式可知，1摩尔醋酸钾可以生成1摩尔的青霉素盐。

但由于反应是可逆的，故采取过量0.1摩尔醋酸钾，使反应朝生成青霉素钾盐方向进行。

另外丁脂萃取液中杂酸的存在，要消耗一部分醋酸钾、因此结晶过程中根据污染数多少而决定醋酸钾的加入量，以保证反应能完全进行。

如污染数在0.5%左右，则反应是加入的醋酸钾摩尔比是按1：1.6。