青霉素的生产

青霉素の生产工艺

一、青霉菌简介

青霉属[Penicillium ，X=2 (P.species)] 真菌の一种（真核细胞），属于子囊菌亚门，不整囊菌纲，散囊菌目，散囊菌科，青霉属。间有性生殖阶段。菌丝为多细胞分枝。无性繁殖时，菌丝发生直立の多细胞分生孢子梗。梗の顶端不膨大，但具有可继续再分の指状分枝，每枝顶端有2-3

个瓶状细胞，其上各生一串灰绿色分生孢子。分生孢子脱落后，再适宜の条件下萌发产生新个体。有性生殖极少见。常见于腐烂の水果、蔬菜、肉食及衣履上，多呈灰绿色。亦能引起柑橘の青霉病。有些种类如点青霉（P.notatum）和黄青霉（P.chrysogenum）等可提取青霉素，药用青霉素又称盘尼西林。灰黄青霉（P.griseofulvum）等可提取灰黄霉素。

青霉菌代谢类型是异养需氧型。青霉菌属于丛梗孢科。菌丝体由多数具

有横隔の菌丝所组成，通常以产生分生孢子进行繁殖，产生孢子时，菌丝体顶端产生多细胞の分生孢子梗，梗の顶端分枝2—3次，每枝の末端细胞分裂成串の分生孢子，形成扫帚状。分生孢子一般呈蓝绿色，成熟后随风飞散，遇适宜环境，萌发成菌丝。青霉菌の种类很多，通常生于柑桔类水果上。蔬菜、粮食、肉类、皮革和食物上也常有分布。

二、青霉素の发酵工艺过程

1、工艺流程

（1）丝状菌三级发酵工艺流程

冷冻管（25°C，孢子培养，7天）——斜面母瓶（25°C，孢子培养，7天）——大米孢子（26°C，种子培养56h,1:1.5vvm）——一级种子培养液（27°C，种子培养，24h,1:1.5vvm）——二级种子培养液（27~26°C,发酵,7天,1:0.95vvm）——发酵液。

（2）球状菌二级发酵工艺流程

冷冻管（25°C，孢子培养，6~8天）——亲米（25°C，孢子培养，8~10天）——生产米（28°C，孢子培养，56~60h,1:1.5vvm）——种子培养液（26~25-24°C，发酵，7天，1：0.8vvm）——发酵液。

2、工艺控制

（1）影响发酵产率の因素

基质浓度在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱の阻遏或抑制, 苯乙酸の生长抑制）, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成, 为了避免这一现象, 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法, 即对容易产生阻遏、抑制和限制作用の基质进行缓慢流加以维持一定の最适浓度。这里必须特别注意の是葡萄糖の流加, 因为即使是超出最适浓度范围较小の波动, 都将引起严重の阻遏或限制, 使生物合成速度减慢或停止。目前, 糖浓度の检测尚难在线进行, 故葡萄糖の流加不是依据糖浓度控制, 而是间接根据pH 值、溶氧或C02 释放率予以调节。

（2）温度青霉素发酵の最适温度随所用菌株の不同可能稍有差别, 但一般认为应在25 °C 左右。温度过高将明显降低发酵产率, 同时增加葡萄糖の维持消耗, 降低葡萄糖至青霉素の转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说, 最适温度不是一样の, 一般前者略高于后者, 故有の发酵过程在菌丝生长阶段采用较高の温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度, 以利于青霉素の合成。

（3）pH 值青霉素发酵の最适pH 值一般认为在6. 5 左右, 有时也可以略高或略低一些, 但应尽量避免pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱の培养基中, pH 值の变化是葡萄糖流加速度高低の反映。过高の流加速率造成酸性中间产物の积累使pH 值降低；过低の加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生の氨或其他生理碱性物质代谢产生の碱性化合物而引起pH 值上升。

（4）溶氧对于好氧の青霉素发酵来说, 溶氧浓度是影响发酵过程の一个重要因素。当溶氧浓度降到30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于10% 饱和度时, 则造成不可逆の损害。溶氧浓度过高, 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力の发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗の一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制の一个参考指标。

（5）菌丝浓度发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵の临界菌体浓度随菌株の呼吸强度(取决于维持因数の大小, 维持因数越大,呼吸强度越高) 、发酵通气与搅拌能力及发酵の流变学性质而异。呼吸强度低の菌株降低发酵中氧の消耗速率，而通气与搅拌能力强の发酵罐及黏低の发酵液使发酵中の传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。

（6）菌丝生长速度用恒化器进行の发酵试验证明，在葡萄糖限制生长の条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝の比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于O. 015h-1时, 比生产速率与比生长速率无关D 因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率, 必须使比生长速率不低

0.015h-1 。这一比生长速率称为临界比生长速率。对于分批补料发酵の生产阶段来说, 维持0.015h斗の临界比生长速率意味着每46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现の。事实上, 青霉素工业发酵生产阶段控制の比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能达到很高の比生产速率。这是由于工业上采用の补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要高一些。

（7）菌丝形态在长期の菌株改良中, 青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形态。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中の基质及氧接触, 故一般比生产速率较高；后者则由于发酵液黏度显著降低, 使气-液两相间氧の传递速率大大提高, 从而允许更多の菌丝生长(即临界菌体浓度较高), 发酵罐体积产率甚至高于前者。

在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当の分支和长度, 并避免结球, 是获得高产の关键要素之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧, 并尽量减少游离菌丝の含量, 也是充分发挥其生产能力の关键素之一。这种形态の控制与糖和氮源の流加状况及速率、搅拌の剪切强度及比生长速率密切相关。

3、工艺控制要点

（1）种子质量の控制丝状菌の生产种子是由保藏在低温の冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25 °C 培养7 天, 真空干燥并以这种形式保存备用。生产时它按一定の接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主の种子罐内,26 °C 培养56h 左