饮用水微生物限度检查操作规程

1．目的：使生活饮用水检查操作规范化、标准化。

2．范围：生活饮用水微生物限度检查

3．职责：生活饮用水微生物限度检查操作人员

4.引用标准：GB5749-2006 中国药典2015年版四部

5．内容

5.1主要设备、仪器及用具

5.1.1 生化培养箱、恒温水浴锅、0.45µm滤膜及薄膜过滤器、灭菌柜、乙醇灯等。

5.1.2玻璃器皿锥形瓶、培养皿（直径90mm）、量筒、试管、刻度吸管等。刻度吸管、量筒用前应洗涤干净。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm适宜疏松的棉花，置不锈钢盒内。锥形瓶、量筒、试管均应加硅胶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于高压蒸汽121℃灭菌30 min，备用。

5.2操作步骤：

5.2.1需氧菌总数：采用薄膜过滤法处理。

5.2.2用10ml无菌水，润湿滤膜，取供试液10ml 2份，分别过滤；取出滤膜，菌面朝

上，贴于R2A琼脂培养基上；

5.2.3用10ml无菌水，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照；

5.2.4将上述计数平板倒置于30-35℃培养箱中培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计

菌落数并报告；

标准规定：每1ml需氧菌总数不得过100cfu。

5.2.5菌数报告规则以1ml供试液的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数（每张滤膜过滤1ml供试液）。

5.3耐胆盐革兰氏阴性菌标准规定：不得检出。

5.3.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌

种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌［CMCC（B）44102］

铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］

5.3.2菌液制备接种大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂培养基中，30一35 ℃培养18一24小时；上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数不大于100cfu的菌悬液。

菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2-8℃可在24小时内使用。

5.3.3 操作步骤

5.3.3.1供试液制备和预培养取供试品10ml 3份，分别接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，制成1:10的供试液。一份作为供试品，一份加入不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml，一份加入不大于100cfu的铜绿假单胞菌菌悬液1ml，作为阳性对照。取10ml灭菌水同法操作，作为阴性对照在20-25℃培养，培养约2小时。5.3.3.2 定性试验分别取上述10ml供试品的预培养物接种至100ml肠道菌增菌液体培养基中，30-35℃培养48小时，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上30-35℃培养24小时。如果平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰氏阴性菌；阳性对照应生长良好。

5．4大肠埃希菌

5.4.1 操作步骤

5.4.1.1 供试液的制备和增菌培养：取供试液100ml 2份，分别接种至1000m l的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，一份加入不大于100cfu 的试验菌做为阳性对照，在

30-35℃培养18-24小时，

5.4.1.2选择和分离培养：取上述培养物1mL接种至100mL 麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24-48 小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18-72小时，阳性对照应检出相应的控制菌。

5.4.1.3阴性对照试验取试验用的稀释剂，同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

5.4.1.4结果判断若麦康凯琼脂培养基平板上，有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，验证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上，没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性、判供试品未检出大肠埃希菌。

6.变更历史