凋亡素基因重组腺病毒的构建

凋亡素基因重组腺病毒的构建【摘要】目的构建携凋亡素基因的腺病毒载体，为进一步研究凋亡素基因功能及其作用机制建立基础。方法 Pmel酶切线性化已经构建好的含凋亡素基因的穿梭质粒pAdTrack CMV VP3，然后电转化到BJ5183AD1细胞中进行同源重组。PacⅠ酶切出含凋亡素基因的腺病毒DNA，然后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒，运用RT PCR鉴定重组腺病毒。用氯化铯梯度离心纯化病毒。用物理和生物方法确定病毒的滴度。结果 PacⅠ酶切证实同源重组成功。绿色荧光观察证实病毒包装成功并且具有感染力，RT PCR证实了重组腺病毒具有凋亡素蛋白的编码。重组腺病毒的浓度为84.52×109 VP/ml，滴度为6.561×109 PFU/ml。结论成功构建含凋亡素基因的重组腺病毒，它的滴度足以满足体内外实验。

【关键词】凋亡素基因腺病毒载体基因治疗

【Abstract】Objective To construct a recombinant adenovirus carrying Apoptin gene so as to provide basis for further studying Apoptin gene functions and ascertaining corresponding mechanism. Methods The shuttle vector pAdTrack CMV VP3 containing Apoptin gene was linearized with Pmel and subsequently electrotransformed into BJ5183AD 1 cells for homologous recombination. The DNA containing Apoptin gene

of the recombinant adenovirus was obtained by digesting with PacI and then transfected into 293 cells, where the recombinant adenovirus containing Apoptin gene was identified by RT

PCR and purified by cesium choride density centrifugation. Finally, the titre of the recombinant adenovirus was determined by biological and physical assays. Results Digestion with PacI proved successful homologous recombination. Green fluorescence showed successful recombinant adenovirus with infectiveness. RT PCR confirmed that the recombinant adenovirus had coding of Apoptin gene proteins. The titre of the recombinant adenovirus was 84.52×109 VP/ml and 6.561×109 PFU/ml. Conclusion The recombinant adenovirus vector containing Apoptin gene is successfully constructed, with its titre sufficient for in vivo and in vitro experiment.

【Key words】 Apoptin gene; Adenovirus vector; Gene therapy

凋亡素，又称Apoptin(apoptosis induction)［1］，是来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子蛋白质。它能引发一些肿瘤细胞凋亡和细胞转化，而对正常细胞无此作用。在肿瘤的治疗上具有巨大潜力［1］。由于凋亡素是外来物质，在发挥作用前必须进入细胞，所以我们选择腺病毒作为载体来运载它，以期能探索它的作用机制，为肿瘤的治疗提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 含凋亡素基因的穿梭质粒PAdtrack CMV VP3的获得［2］我们已经成功构建了含凋亡素基因的穿梭质粒，并且通过了酶切和测序鉴定，为下一步实验的进行奠定了基础［2］。

1.2 含凋亡素基因的腺病毒基因组(PAd VP3)质粒的构建

1.2.1 同源重组 pAdTrack CMV VP3用Pmel酶切，线性化，再用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)进行去磷酸化处理，最后电转化(Bio Rad Gene Pulser Electropoerator 2 500 V 200 Ωmax)到BJ5183AD1细胞中，与其内的pAd Easy1进行同源重组。设置阴性对照组为空载体pAd Track CMV，经过以上处理后同样进行同源重组。

1.2.2 酶切鉴定只有重组成功才能用PacⅠ酶切出两个不同长度的条带：长的为23 kb，短的根据重组位点不同而不同，可以为3.0或4.5 kb条带。无论在何位点重组均不影响pAd VP3腺病毒基因组的功能。

1.3 含凋亡素基因腺病毒DNA的获得

从含pAd VP3腺病毒基因组的质粒中使用PacⅠ酶切，然后用胶回收23 kb的DNA片段，即重组腺病毒基因组。

1.4 重组腺病毒在293细胞内的包装、扩增及鉴定

1.4.1 重组腺病毒的包装将获得的重组腺病毒DNA转染293细胞。6孔细胞培养板种入2×105细胞，待细胞密度达到60%，除去培养基，用不含小牛血清的DMEM洗涤细胞(5 min)，加入500 μl不含小牛血清的DMEM与5 μg 重组腺病毒DNA和5 μl Lipofectamine reagent的混合物(混合10 min后加入)，空白对照用不含目的基因的腺病毒DNA转染。37 ℃孵育箱中孵育3 h，吸取培养基，加入4 ml 培养基重新孵育6～7 h后，再次更换培养基37 ℃孵育5～7 d，此期间细胞长满后可以传代至大的培养瓶内继续生长。每天用荧光显微镜观察有否荧光蛋白以判断有无病毒的产生。当50%细胞出现荧光蛋白时不再传代和换液，只是加液，直到病毒的继续产生。此时收集培养液和细胞，将上述细胞悬液移入5 ml的离心管中，并在-80 ℃和37 ℃水浴中反复冻融3次，每次冻融后，旋转离心管1次，以使细胞悬液充分冻融，室温下，12 000×g离心10 min，沉淀细胞碎屑，将上清液(主要成分为病毒原液)移入新的离心管中于-80