凋亡素基因重组腺病毒的构建

凋亡素基因重组腺病毒的构建【摘要】目的构建携凋亡素基因的腺病毒载体，为进一步研究凋亡素基因功能及其作用机制建立基础。

方法 Pmel酶切线性化已经构建好的含凋亡素基因的穿梭质粒pAdTrack CMV VP3，然后电转化到BJ5183AD1细胞中进行同源重组。

PacⅠ酶切出含凋亡素基因的腺病毒DNA，然后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒，运用RT PCR鉴定重组腺病毒。

用氯化铯梯度离心纯化病毒。

用物理和生物方法确定病毒的滴度。

结果 PacⅠ酶切证实同源重组成功。

绿色荧光观察证实病毒包装成功并且具有感染力，RT PCR证实了重组腺病毒具有凋亡素蛋白的编码。

重组腺病毒的浓度为84.52×109 VP/ml，滴度为6.561×109 PFU/ml。

结论成功构建含凋亡素基因的重组腺病毒，它的滴度足以满足体内外实验。

【关键词】凋亡素基因腺病毒载体基因治疗【Abstract】Objective To construct a recombinant adenovirus carrying Apoptin gene so as to provide basis for further studying Apoptin gene functions and ascertaining corresponding mechanism. Methods The shuttle vector pAdTrack CMV VP3 containing Apoptin gene was linearized with Pmel and subsequently electrotransformed into BJ5183AD 1 cells for homologous recombination. The DNA containing Apoptin geneof the recombinant adenovirus was obtained by digesting with PacI and then transfected into 293 cells, where the recombinant adenovirus containing Apoptin gene was identified by RTPCR and purified by cesium choride density centrifugation. Finally, the titre of the recombinant adenovirus was determined by biological and physical assays. Results Digestion with PacI proved successful homologous recombination. Green fluorescence showed successful recombinant adenovirus with infectiveness. RT PCR confirmed that the recombinant adenovirus had coding of Apoptin gene proteins. The titre of the recombinant adenovirus was 84.52×109 VP/ml and 6.561×109 PFU/ml. Conclusion The recombinant adenovirus vector containing Apoptin gene is successfully constructed, with its titre sufficient for in vivo and in vitro experiment.【Key words】 Apoptin gene; Adenovirus vector; Gene therapy凋亡素，又称Apoptin(apoptosis induction)［1］，是来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子蛋白质。

它能引发一些肿瘤细胞凋亡和细胞转化，而对正常细胞无此作用。

在肿瘤的治疗上具有巨大潜力［1］。

由于凋亡素是外来物质，在发挥作用前必须进入细胞，所以我们选择腺病毒作为载体来运载它，以期能探索它的作用机制，为肿瘤的治疗提供新的途径。

1 材料与方法1.1 含凋亡素基因的穿梭质粒PAdtrack CMV VP3的获得［2］我们已经成功构建了含凋亡素基因的穿梭质粒，并且通过了酶切和测序鉴定，为下一步实验的进行奠定了基础［2］。

1.2 含凋亡素基因的腺病毒基因组(PAd VP3)质粒的构建1.2.1 同源重组 pAdTrack CMV VP3用Pmel酶切，线性化，再用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)进行去磷酸化处理，最后电转化(Bio Rad Gene Pulser Electropoerator 2 500 V 200 Ωmax)到BJ5183AD1细胞中，与其内的pAd Easy1进行同源重组。

设置阴性对照组为空载体pAd Track CMV，经过以上处理后同样进行同源重组。

1.2.2 酶切鉴定只有重组成功才能用PacⅠ酶切出两个不同长度的条带：长的为23 kb，短的根据重组位点不同而不同，可以为3.0或4.5 kb条带。

无论在何位点重组均不影响pAd VP3腺病毒基因组的功能。

1.3 含凋亡素基因腺病毒DNA的获得从含pAd VP3腺病毒基因组的质粒中使用PacⅠ酶切，然后用胶回收23 kb的DNA片段，即重组腺病毒基因组。

1.4 重组腺病毒在293细胞内的包装、扩增及鉴定1.4.1 重组腺病毒的包装将获得的重组腺病毒DNA转染293细胞。

6孔细胞培养板种入2×105细胞，待细胞密度达到60%，除去培养基，用不含小牛血清的DMEM洗涤细胞(5 min)，加入500 μl不含小牛血清的DMEM与5 μg 重组腺病毒DNA和5 μl Lipofectamine reagent的混合物(混合10 min后加入)，空白对照用不含目的基因的腺病毒DNA转染。

37 ℃孵育箱中孵育3 h，吸取培养基，加入4 ml 培养基重新孵育6～7 h后，再次更换培养基37 ℃孵育5～7 d，此期间细胞长满后可以传代至大的培养瓶内继续生长。

每天用荧光显微镜观察有否荧光蛋白以判断有无病毒的产生。

当50%细胞出现荧光蛋白时不再传代和换液，只是加液，直到病毒的继续产生。

此时收集培养液和细胞，将上述细胞悬液移入5 ml的离心管中，并在-80 ℃和37 ℃水浴中反复冻融3次，每次冻融后，旋转离心管1次，以使细胞悬液充分冻融，室温下，12 000×g离心10 min，沉淀细胞碎屑，将上清液(主要成分为病毒原液)移入新的离心管中于-80℃保存。

1.4.2 重组腺病毒的扩增将AD293细胞接种于6孔板上，使每孔内细胞数达到(7～8)×105。

吸去培养液，然后加入1 ml新鲜培养液，同时加入200 μl病毒原液混匀，37 ℃孵育2 h，再加入2 ml 培养液继续孵育。

每日用荧光显微镜观察情况。

当有病毒产生后即按上述方法收集病毒液。

1.4.3 重组腺病毒的鉴定由于我们已经通过观察荧光蛋白的情况证实了重组腺病毒是包装出来的，并且具有感染能力。

下一步需证实的是该腺病毒是否有目的蛋白的编码。

采用RT PCR方法鉴定。

转染后48 h，用Trizol抽提各孔细胞的总RNA，以Oligo(dT)为引物合成cDNA。

然后以cDNA为模板，用人工合成的凋亡素基因上下游引物行PCR检测。

1.5 重组腺病毒的纯化及滴度测定我们将扩增的病毒送成都基因治疗肿瘤药物工程技术研究中心纯化和滴度测定。

1.5.1 纯化采用氯化铯梯度离心方法纯化。

1.5.2 滴度测定1.5.2.1 物理检测：物理检测指腺病毒蛋白和DNA(主要是DNA)能吸收紫外线的特性来测定，其对应公式为：1OD=1.1×1012病毒数。

根据这个线性关系能测出病毒的实际病毒数。

1.5.2.1 生物检测：我们采用嗜斑形成单位(plaque forming units,PFU)来描述病毒的感染力。

既通过观察细胞病变(cytopathic effect,CPE)来确定病毒的感染能力。

用5% FBS DMEM将待测样本稀释至其106倍，再在盛2 ml 5% FBS DMEM培养液离心管(5 ml)中进行3倍倍比稀释(1∶2)，共12管，各管有病毒液2 ml。

用5% FBS DMEM培养液调细胞密度为1×105/ml，在96孔培养板中每孔加入此细胞悬液100 μl，置于37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中培养24 h。

弃去培养液，将倍比稀释的第1管病毒液加入第1列，第2管病毒液加入第2列，100 μl/孔，直至第12管。

培养后第12天显微镜下观察各孔，以培养孔中发生病变细胞数多于50％为阳性，计数阳性细胞孔数。

并以下式计算所测样本病毒颗粒滴度［3］：腺病毒载体滴度=稀释倍数×稀释度(CPE阳性细胞孔数-4)/8=106×3(CPE阳性细胞孔数-4)/8(PFU/ml)2 结果2.1 含凋亡素基因的腺病毒基因组(PAd VP3)质粒的获得(见图1)图1 含凋亡素基因腺病毒基因组质粒的PacⅠ酶切图M: λHindⅢ,DNA Marker； 1：含腺病毒DNA的质粒PacⅠ酶切电泳从图1中可以看出：PacⅠ酶切能切出两个条带：大于23 kb和4.5 kb的条带。

表示同源重组成功。

2.2 重组腺病毒的包装当感染病毒后293细胞增大，细胞丝状结构消失，细胞核增大，到第3天时，可观察到细胞已崩解成荧光碎片。

由于有新病毒的产生，可使受感染的293细胞数目增多，到第5天，细胞全部出现荧光蛋白，随后荧光减弱，表示病毒已开始从多数的细胞内释放。

到第7天时大部分细胞脱落，可看到细胞有发泡现象，细胞结构不清，并且细胞脱壁，漂浮在培养液中出现细胞崩解释放病毒。

此时收集病毒液。

见图2。

2.3 重组腺病毒的鉴定(见图3)从图3可看出：含凋亡素基因的腺病毒具有编码凋亡素蛋白的活性。

而不含凋亡素基因的腺病毒不具有。

2.4 重组腺病毒的滴度测定2.4.1 物理检测重组腺病毒的浓度为84.52×109 VP/ml，见图4。

不含凋亡素基因的腺病毒的浓度为67.14×109 VP/ml，见图5。

2.4.2 生物检测实验发现，重组腺病毒及不含凋亡素基因的腺病毒均可见68个阳性孔(发生细胞病变率大于50%)，故滴度均为：106×3(68-4)/8=6.561×109 PFU/ml。