重组腺病毒构建的标准操作规程
构建重组腺病毒
重组腺病毒载体1、片段处理先测质粒含量，限制性内切酶NheI和SpeI双酶切含有目的基因的T 载体质粒DNA，双酶切体系根据质粒含量而定，TaKaRa公司的的Buffer与体系总体积比为10:1，酶10U/µL可切底物1µg（实际操作时通常加2-4倍量，但所加酶的体积不能超过反应总体积的十分之一）。
先进行琼脂糖凝胶分离，用洁净的刀片切出目的条带，纯化回收目的片段（试剂盒）。
限制性内切酶SpeI单酶切pAd4△E3穿梭质粒，酶切4-6小时，先取少量进行凝胶电泳，电泳时设立未切的质粒对照，以确定质粒被完全切开，如果没有完全切开，继续延长时间或加大酶量酶切，确定酶切完全后，进行去磷酸化，纯化回收线性pAd4△E3穿梭质粒（要根据质粒的大小确定合适的纯化回收方法）。
2、连接16℃，过夜。
体系：连接酶的Buffer通常为2X，所以，这里就要加总体积1/2的Buffer，同样，连接酶的量也不能超过总体积的1/10!!3、转化入DH5α细胞取10µL连接产物加入100µLDH5α感受态细胞（实验室保存的感受态细胞保存在-70度，取出前要准备好冰水混合物，将感受态细胞取出后，迅速放入冰水）中，轻轻混匀后冰浴30min（目的是让连接产物中的DNA分子与细胞膜吸附在一起）；42℃水浴热激90s（使细胞膜上的孔径变大，DNA分子进入内部），再立即冰浴3min（让细胞膜上的孔快速闭合）；加入890µL LB培养基，37℃温和振荡1h；8000rpm离心5min; 无菌弃去600µL上清，重新悬浮；均匀涂布于含氨苄青霉素（pAd4△E3穿梭质粒不是卡那霉素抗性，而是氨苄青霉素，这是最最重要的）的培养皿上，培养12h。
4、挑分离良好的单克隆，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37度剧烈震荡（240rpm）摇菌挑取数个菌落，接种于LB培养基中，37℃震荡过夜培养。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
4-1BBL重组腺病毒载体的构建及表达
Ｉ—ｎ ａｉｅ ｌｓ ｄ ｐ ｄ ｒｃ Ｃ ｌ ｅｒｚｄｐａ ｍｉ Ａ Ｔ ａｋ ＭＶ・ ４ １ Ｂ ａ ｄ ｃ—ｒ ｓｏｍｅ ｎｏ ｃｍｐｔｎ Ｊ １ ３ ｗｔ ｄ ｎ ｖｒｓ ｂ ｃ ｂ ｎ ｌｓ ｉ ｍ — Ｂ Ｌ ｎ ｏｔａ ｆｒ ｄ ｉｔ ｏ ｅｅ ｔＢ ５ ８ ｉ ａ ｅ ｏ ｉ ａ ｋ ｏ ｅ ｐａ— ｎ ｈ ｕ
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１Ｂ Ｂ Ｌ表达。结论 成 功构建 了含 ４ １ Ｂ —Ｂ Ｌ基 因的腺病毒载体 ， 该载体可用于前列腺癌的免疫治疗 。
吉玛重组腺病毒操作手册说明书
如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************吉玛重组腺病毒操作手册GenePharma Recombinant Adenovirus Operation Manual2017 年 6 月如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：**************************E-mail：************************目录一、产品简介 (4)二、腺病毒载体优势 (4)三、生物安全性 (5)3.1安全性 (5)3.2实验室安全措施 (5)四、流程描述 (6)五、材料与仪器 (7)5.1实验材料 (7)5.1.1细胞株 (7)5.1.2质粒 (7)5.1.3试剂 (8)5.2实验耗材及仪器 (8)5.2.1耗材 (8)5.2.2仪器 (9)六、具体步骤 (9)6.1细胞培养 (9)6.1.1活细胞计数 (9)6.1.2细胞株的冻存 (9)6.1.3细胞复苏 (10)6.1.4细胞传代 (10)6.2病毒包装 (10)6.3病毒收集 (11)6.4病毒扩增 (12)6.5病毒纯化 (12)6.6病毒重悬和保存 (13)6.7病毒滴度检测 (13)七、使用方法 (14)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************重组腺病毒在细胞水平使用 (14)7.1病毒滴度复核（有限稀释法测定） (14)7.2靶细胞感染预实验 (16)7.3正式试验 (18)八、运输和储存 (18)九、常见问题及解决方案 (19)十、吉玛案例 (20)十一、附录 (21)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************一、产品简介腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种线性双链DNA 病毒。
TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建-最新文档
TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建能够特异识别抗原肽-MHC复合物的T 细胞受体(T cell antigen receptor ,TCR)，在肿瘤抗原的识别及杀伤过程中具有重要作用[1,2]，将肿瘤抗原特异性识别的TCR基因转染T细胞用于杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的方法之一[3]。
在以往实验中发现转染TCRVβ7.1基因的T细胞对肝癌细胞株BEL-7402[4]杀伤活性明显提高，由于脂质体的转染率较低和毒性较大，现构建重组腺病毒载体Ad.TCRVβ7.1，以提高转染率和降低毒性。
1材料与方法1.1质粒、菌株和细胞AdMaxTM 腺病毒包装系统(腺病毒骨架质粒、腺病毒穿梭质粒pDC315、HEK293细胞)购自加拿大Microbix公司；PBMC从人血分离；质粒pcDNA3.1- TCRVβ7.1、Hela（宫颈癌细胞）及大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。
1.2试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录试剂盒及DNA Mark购自Takara公司。
Lipofectamine2000和Trizol购自Invetrogen公司。
质粒提取及胶回收试剂盒均购自Omega公司。
淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技XX公司。
1.3穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1的构建穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1构建过程如（图1）。
设计一对带有EcoRⅠ和XhoⅠ的TCRVβ7.1引物，PCR产物双酶切后连接到穿梭质粒pDC315中，得到腺病毒穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1。
图1 穿梭质粒pDC315Vβ7.1的构建1.4重组腺病毒Ad.TCRVβ7.1的包装接种4×105个低代的HEK293细胞于六孔板中，约24h后细胞密度达到60%～80%时，用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒和骨架质粒共转染293细胞。
待细胞长满培养板时，将其消化转移至10cm细胞培养皿中继续培养。
(整理)FnCBD64基因重组腺病毒载体AdFnCBD64的构建
FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64构建的实验研究徐瑞剑王志强包头市九原区医院胸外科内蒙古包头 014060内蒙古自治区自然科学基金项目项目编号2009MS1148通讯作者：王志强Xu ruijian Wang zhiqiangDepartment of Thoracic Surgery, Jiuyuan District Hospital of Baotou, Baotou Inner Mongolia 014060实验目的：构建纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组人腺病毒载体（Ad.FnCBD64）。
实验方法：1.FnCBD64重组腺病毒粘粒载体的构建。
2.293细胞和Hela细胞的培养。
3.磷酸钙转染。
4. 筛选和扩增FnCBD64基因重组腺病毒。
5．设计公共PCR引物。
6. 鉴定Ad. FnCBD64重组腺病毒。
7. 浓缩纯化重组腺病毒。
8. 测定病毒滴度（50％组织培养感染量TCID50）。
9.体外安全性研究。
结果：成功构建了纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64。
结论：本实验成功地构建了携带人FnCBD64基因的重组腺病毒，为应用FnCBD64促进骨髓间质干细胞的黏附力提供了转染载体，使应用骨髓间质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜成为可能。
运用基因转染的技术加强及改造种子细胞的功能是组织工程研究中的热点问题之一。
通过这一手段的应用，不仅能获得具备旺盛生理功能的种子细胞，而且还能使种子细胞大量表达需要的目的蛋白，有利于组织构建。
腺病毒载体是组织工程基因改造的常用的病毒性载体，同其他的载体体系对比，腺病毒载体是最具有潜力的载体之一，具有高效感染分裂细胞及非分裂细胞能力，制备容易、纯化和储存方便，并且滴度高、容量大[1]。
能插入大片段的目的基因，携带的外源基因不会整合在宿主染色体中，在靶细胞内以附加体形式存在，插入突变的危险极低，具有较低的遗传毒性。
重组腺病毒rAd-mIL-15的构建及表达
重组腺病毒rAd-mIL-15的构建及表达谭榜云;李莉;刘志武【摘要】目的构建并制备鼠白细胞介素-15(mIL-15)重组腺病毒(rAd-mIL-15),感染HEK293细胞,为肝细胞肝癌的免疫治疗奠定基础.方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增mIL-15,将扩增产物连接到穿梭载体pDC316上,构建重组穿梭质粒pDC316-mIL-15.在Lipofectamine2000脂质体介导下将腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3 Cre和穿梭质粒pDC316-mIL-15共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-mIL-15.随后在HEK293细胞中包装扩增病毒并测定病毒滴度.采用PCR对重组腺病毒进行鉴定.结果重组腺病毒质粒经PCR鉴定,证实含有mIL-15基因,重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25×1010 PFU/mL.结论采用细胞内同源重组方法可成功构建含mIL-15基因的重组腺病毒,并可获得高滴度病毒,其能高效感染HEK293细胞,能为进一步研究奠定基础.%Objective To construct and prepare the recombinant adenovirus carrying mouse interleukin-15 (mIL-15 ) ,and to transfect it into HEK293 cells on order to lay the foundation for immunotherapy of hepatocellular carcinoma(HCC) .Methods The PCR was adopted to amplify mIL-15 ,the amplified products were connected into shuttle vector DC 316 ,the recombinant shuttle plasmid pDC316-mIL-15 was constructed .Under mediation of lipofectamine2000 ,recombinant adenovirus backbone vectorpBHGlox△E1 ,3 Cre and shuttle plasmid pDC316-mIL-15 were co-transfected into HEK293 cells for conducting the homologous recombina-tion .The recombinant adenovirus plasmid rAd-mIL-15 was obtained .Then the amplified virus was packed in HEK293 cells and the viral titer wasmeasured .The recombinant adenovirus was identified by PCR .Results The recombinant adenovirus plasmid was verified to contain mIL-15 gene by PCR identification .The recombinant adenovirus vector was successfully constructed ,the viral ti-ter reached 1 .25 × 1010 PFU /mL .Conclusion Recombinant adenovirus vector containing mIL-15 can be successfully constructed by adopting the intracellular homologous recombination method ,moreover which can obtain high titer virus ,can efficiently infect HEK293 cells and lay a foundation for further study .【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2017(014)022【总页数】3页(P3300-3302)【关键词】白细胞介素-15;重组腺病毒载体;包装【作者】谭榜云;李莉;刘志武【作者单位】兰州大学第一医院检验科 ,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院检验科 ,甘肃兰州730000;兰州大学第一医院检验科 ,甘肃兰州730000【正文语种】中文白细胞介素(IL)-15是学者于1994年从猿肾上皮细胞系成功分离时发现。
〖医学〗重组腺病毒载体的构建
BTEB2简介
基本转录元件结合蛋白2－转录因子 功能：促进VSMC增殖和表型转化
外源性基因的制备
VSMC中提取总RNA RT－PCR得到BTEB2 cDNA 体会：从目的基因丰度高的组织或细胞
中提取。
重组穿梭质粒的构建－－将 PCR产物克隆到穿梭质粒
用BamH I 和 EcoR I 双酶切穿梭质粒 pDC315及BTEB2 cDNA
用T4连接酶将BTEB2 cDNA反向连接到 穿梭质粒 定向克隆
体会：设计引物时引入需要的酶切位点 可使基因定向克隆的程序简化
重组穿梭质粒的鉴定
酶切鉴定：用BamH I 和 EcoR I 双酶切 重组穿梭质粒pDC315ASBTET2，电泳
目的片段测序
重组腺病毒的制备
脂质体介导重组穿梭质粒和腺病毒基因组质粒 共转染293细胞
腺病毒载体的包装细胞
HEK293细胞的培养 高糖型DMEM 10%FBS（构建），10%NBS（扩增）
HEK293细胞的传代次数与腺病毒载体构 建和扩增 构建：＜20代－－构建成功的关键 扩增：无特殊要求
重组原理
重组腺病毒载体构建
以反义BTEB2腺病毒表达载体为例 介绍重组腺病毒载体的构建过程
重组腺病毒的鉴定
病变293细胞于液氮、37°C反复冻融， 离心
取上清提取重组病毒DNA 用目的片段引物和病毒基因组特征片段
引物作PCR
病毒滴度测定
24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加
PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至 第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液 0.2ml。 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒） 附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要*）1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。
4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定
人HCN4基因重组腺病毒载体的构建和鉴定作者：蔡军，林国生，江洪，王腾，曾彬，罗浩，郭军，李俊，汪蕾【关键词】腺病毒科Construction and identification of human HCN4 gene recombinant adenovirus【Abstract】AIM: To construct the recombinant adenovirus of human HCN4 gene. METHODS: HCN4 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pAdTrackCMV to form the transfer vector by the methods of homogeneous recombination in bacteria and the recombinant adenovirus was then transfected into 293 cells using Lipofectamine 2000. The target gene was detected by polymerase chain reaction (PCR) and the titer and its infection rate were determined using the green fluorescent protein (GFP) expression in the shuttle plasmid. RESULTS: Restriction enzyme digestion analysis and the sequence analysis confirmed that the HCN4 gene was successfully inserted into the adenovirus vector. The titer of the recombinant adenovirus was ×1015 pfu/L. GFP was observed in thetransfected 293 cells under a fluorescent microscope. CONCLUSION: The recombinant adenovirus containing human HCN4 gene is successfully constructed by the method of homogeneous recombination in bacteria.【Keywords】 HCN gene; adenoviridae; recombination, genetic【摘要】目的：构建超极化激活环核苷酸门控通道基因（HCN4）重组腺病毒载体. 方法：采用基因工程技术，将HCN4 cDNA 定向克隆至穿梭载体pAdTrackCMV中，利用pAdeasy1系统进行细菌内同源重组后，脂质体转染293T细胞包装、扩增，CsC1密度梯度超速离心纯化. 采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定，利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因，对病毒滴度和感染效率进行监测. 结果：测序结果证明成功构建了HCN4基因重组腺病毒载体，病毒滴度达×1015pfu/L. 结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含人HCN4基因的重组腺病毒载体.【关键词】 HCN基因；腺病毒科；重组，遗传0引言起搏电流（If）在窦房结生理性起搏机制中担当重要角色，同时也是自主神经调节心脏节律的主要靶点，其编码基因为超极化激活环核苷酸门控通道基因（HCN）［1-4］. HCN超家族包括HCN1～HCN4型，其中HCN4占窦房结HCN总mRNA的80%［5］. 最近研究发现，在家族性或遗传性窦房结功能障碍家系中存在HCN4 D553N或1613delC位点突变［6,7］. 为了进一步深入研究HCN4的通道动力学及其在起搏活动中的功能角色，积极开展窦房结功能障碍的基因治疗，我们构建了表达HCN4的重组腺病毒载体.1材料和方法1．1材料腺病毒细菌内同源重组系统包括Bj5183、穿梭质粒pAdTrackCMV及腺病毒骨架质粒pAdeasy1（美国Johns Hopkins大学Dr. He TC惠赠）；293细胞系（武汉大学细胞典藏中心）；各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、RNase A（TaKaRa公司）；转染试剂Lipofectamine 2000（Gibco BRL）；PCR产物回收纯化试剂盒（Promega公司）；质粒提取试剂盒（Hispeed Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司）；氯化铯（Sigma公司）. 其余各种试剂均为进口或国产分析纯试剂.1．2方法1．2．1穿梭载体pAdTrackCMV HCN4的构建和鉴定1．2．1．1pAdTrackCMVHCN4的构建质粒用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后回收 kb的HCN片段. 穿梭质粒pTrackCMV用HindⅢ和Xba Ⅰ双酶切后回收载体骨架，T4 DNA连接酶连接载体骨架与目的基因片段得到重组质粒pTrackCMVHCN4. 转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，质粒提取试剂盒提取质粒.1．2．1．2pAdTrackCMVHCN4的酶切鉴定取 mL离心管，依次加入酶切缓冲液2 μL，内切酶HindⅢμL，内切酶XbaⅠμL, 重组质粒μL，去离子水μL，充分混匀，37℃水浴2 h，酶切后10 g/L琼脂糖凝胶电泳，分析电泳条带.1．2．2细菌内同源重组产生腺病毒质粒用100 mL/L的冰冷的无菌甘油制备 BJ 5183及 DH5α电穿孔感受态菌，将穿梭质粒pAdTrackCMVHCN4用PmeⅠ线性化，纯化回收酶切产物. 分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy1等浓度比混合，在2500 V, 200 Ω, 25 μF 条件下，电转化BJ5183感受态菌，卡那霉素（50 mg/L）固体LB培养基筛选，16 h后挑取10个克隆，提取质粒. PacⅠ酶切鉴定阳性克隆得到重组腺病毒质粒pAdHCN4. 重组腺病毒质粒pAdHCN4的序列测定：以质粒提取试剂盒提取的高纯度质粒为模板，双脱氧核苷酸终止法测序，以SP6Promter Primer为测序引物，采用ABI PRISM B DyeTM测序试剂盒在ABI PRISMTM377XL DNA sequncer序列分析仪上对插入片段进行序列测定.1．2．3293细胞中包装产生重组腺病毒利用HEK293细胞可稳定表达复制缺陷病毒Ad5 E1基因的特性，将重组病毒质粒包装成有完整功能的重组病毒颗粒. 转染前24 h于每个T25 cm2培养瓶中接种1×106细胞，转染时细胞密度为50%～70%. 转染当日，将4 μg pAdHCN4质粒用PacⅠ酶切线性化，用20 μL Lipofectamine 2000按说明转染293细胞，2 d后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，2 wk后收集细胞. -70℃/37℃/Vortex反复冻融4次，取1/5病毒提取上清再感染293细胞扩增，3~4 d后收集细胞，PBS重悬，反复冻融，离心收集病毒上清，保存于-80℃.1．2．4重组腺病毒大规模扩增及CsC1密度梯度超速离心纯化按照上述方法连续扩增病毒5~6轮，最后共感染了大约3×108个293细胞，3~4 d后收集病毒上清，制备CsC1低密度母液（1200 g/L）和高密度母液（1460 g/L）. 将高、低密度母液以及病毒上清加至超速离心管中，以10 000 g于4℃离心3~4 h，侧向穿刺小心吸出病毒条带，加入透析袋中透析12 h，其间更换透析缓冲液（10 mmol/L TrisHC1 pH , 1 mmol/L MgC12, 10 mL/L甘油）3次，透析完全后，用2×病毒储存液（19 mmol/L TrisHC1 pH , 100 mmol/L NaC1, 1 mL/L BSA, 50 mL/L甘油）按1∶1稀释病毒，μm滤膜过滤，分装后放-80℃保存，得到纯化好的病毒AdHCN4.1．2．5病毒滴度测定先用A值初步估算：取15 μL纯化好的病毒用 mL H2O稀释15 μL高密度CsC1母液作为空白对照，测A260 nm值，按1012/VP/A260 nm进行换算. 再以GFP法进行测定：将病毒储存液作不同比例的稀释，取500 μL稀释液加至T25 cm2培养瓶培养的293细胞中，于37℃吸附30 min换新鲜培养基继续培养36 h，在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数，按病毒滴度（pfu/mL）=GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数/ mL计算.1．2．6重组腺病毒的鉴定目的基因的PCR鉴定，根据HCN4 cDNA的碱基序列，设计了HCN4的寡聚核苷酸引物：正向引物： 5′GGCATGTCCGACGTCTGGCTCA3′；反向引物：5′TCACGAAGTTGGGGTCCGCATT GG3′. 提取病毒基因组DNA： 2 mL PBS 收集2种病毒感染后发生病变的293细胞，冻融4次，于4℃ 600 g 离心10 min取上清，加入200 μL蛋白酶K （5 g/L），并加入2 mL SET裂解液（10 mL/L SDS, 10 mmol/L EDTA, 20 mmol/L Tris HCl pH ），56℃消化2 h, 3000 g离心10 min取上清，等体积的酚/氯仿抽提一次，无水乙醇沉淀，20 μL TE溶解，以上述病毒基因组DNA为模板，进行PCR: 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸90 s，共35个循环，最后于72℃延伸10 min，产物用10 g/L琼脂糖电泳进行鉴定. 2结果2．1穿梭载体pAdTrackCMVHCN4的鉴定重组质粒被切成的片段与理论预期一致，表明HCN4 cDNA序列已成功插入pAdTrackCMV 载体中，且连接正确（Fig 1）.2．2重组腺病毒质粒pAdHCN4的序列测定用一条PCR鉴定引物进行测序，测定序列结果与GenBank报道的序列完全一致（Fig 2）.2．3重组腺病毒在293细胞中包装、扩增及纯化将腺病毒质粒pAdHCN4用PacⅠ酶切线性化后转染293细胞，2~3 d后荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白的表达，说明有感染力的病毒颗粒包装成功（Fig 3）. 将大规模扩增所得到的病毒液经过CsC1密度梯度超速离心的方法进行纯化，并经过透析得到可以直接用于在体实验的重组腺病毒AdHCN4.2．4病毒滴度的测定应用A值和GFP法测得AdHCN4最终的滴度为×1015pfu/L.2．5重组腺病毒AdHCN4中HCN4基因的PCR鉴定提取AdHCN4病毒基因组DNA，以HCN4基因的引物进行PCR鉴定，结果AdHCN4可见353 bp的阳性扩增条带，而AdGFP没有条带（Fig 4）.3讨论心律失常是影响人们健康威胁人们生命的疾病. 心律失常遗传基因的发现以及突变监测的进展促进了心律失常基因治疗的研究. 最近的研究结果都提示HCN4基因是具有很大潜力的基因治疗的靶基因：①在遗传性窦房结功能障碍患者存在HCN4 D553N或1613delC位点突变［6,7］；②在HCN4基因敲除的鼠胚胎心脏记录不到具有4期自动除极特征的起搏细胞动作电位，胚胎不能发育成熟［8］；③胚胎心室肌细胞在早期阶段（）具有自发除极能力，晚期（）则丧失起搏能力，其机制在于HCN4表达持续性下调及If进行性减少［9］. 因此，HCN4转染的心肌细胞将过度表达If从而具备4期自动除极能力，这将可能构建建立在基因工程基础上的生物起搏器. 我们成功的构建了重组腺病毒载体AdHCN4，可以通过腺病毒载体将HCN4导入体外培养的细胞深入研究HCN4通道动力学及其在起搏活动中的功能角色，也可以心肌内注射开展窦房结功能障碍的基因治疗，为今后的临床应用奠定坚实的基础.由于腺病毒载体的病毒滴度高、容量大、转导效率高、感染范围广以及稳定性好，因此被广泛应用于各种基因治疗中. He等［10］首次介绍细菌内同源重组法，此方法简便快捷，实验周期短，极大地方便了构建重组腺病毒. 目前美国Johns Hopkins Oncology Center 制备了含腺病毒核心基因组pAdEasy1的BJ5183细菌，即AdEasy1（亦称作BJAEasy或AdEasier细菌），与pAdTrack或pAdTrackCMV等穿梭质粒共同组成一个高效重组腺病毒构建系统，只需将含目的基因的穿梭质粒线性化后转化AdEasy1获得重组腺病毒质粒，再经293细胞包装、扩增便可获得所需重组腺病毒，因此选用该系统进行目的基因的修饰在时效上有很大优势.我们希望能够以腺病毒载体为介导，进一步研究HCN4基因在生理性起搏中的功能角色及其分子机制，探索HCN4基因作为基因治疗靶基因的价值，为窦房结功能障碍和重度房室传导阻滞的基因治疗提供候选基因，并为临床前研究提供实验依据. 我们在前一阶段的研究中曾通过窦房结细胞移植来修复或重建心脏优势起搏点以完全或部分代替窦房结功能［11，12］. 但由于人的胚胎心肌细胞移植受到伦理学争议，限制了其在临床上的应用. 由于建立在基因工程基础上的“生物起搏器”可以进行大规模生产，有望成为比电子起搏器更便宜、更安全、更灵敏、创伤更小、更适宜于儿童治疗的新选择，具有广阔的临床应用前景和巨大的社会经济效益.【参考文献】［1］ DiFrancesco D, Ferroni A, Mazzanti M, et al. Properties of the hyperpolarizingactivated current in cells isolated from the rabbit sinoatrial node ［J］. J Physiol, 1986;377(5):61-67.［2］ Moonsmang S, Stieber J, Zong X, et al. Cellular expression and function characterization of four hyperpolarizationactivated pacemaker channels in cardiac and neuronal tissues ［J］. Eur J Biochem, 2001; 268(3):1646-1650.［3］李翠兰，胡大一. 细胞兴奋：从起搏电流到超极化激活的环核苷酸门控通道［J］. 中国心脏起搏与心电生理杂志，2003; 17（4）：244-248.Li CL, Hu DY. Cell exciting: from If to hyperpolarizing activated channel ［J］. Chin J Card Electrophysiol, 2003;17（4）:244-248.［4］蔡军，林国生，江洪. 窦房结起搏细胞膜离子流与4期自动除极［J］. 中国心脏起搏与心电生理杂志，2004；18（4）：302-304.Cai J, Lin GS, Jiang H. Membrane current of sinus node cell and phase 4 automatical depolarzation ［J］. Chin J Card Electrophysiol, 2004；18（4）：302-304.［5］ Shi W, Wymore R, Yu H, et al. Distribution and prevalence of HCN mRNA expression in cardial tissue ［J］. Circ Res, 1999; 85: E1-E6.［6］SchulzeBahr E, Neu A, Friederich P, et al. Pacemaker channel dysfunction in patient with sinus node disease ［J］. J Clin Invest, 2003; 111: 1537-1545.［7］ Ueda K, Nakeharu K, Hayashi T, et al. Functional characterization of a traffickingdefective HCN4 mutation, D553N, associated with cardiac arrythmia ［J］. J Biol Chem, 2004; 279: 27184-27194.［8］ Stieber J, Herrmann S, Feil S, et al. The HCN4 is required for the generation of pacemaker action potentials in the embryonic heart ［J］. PNAS, 2004;100:.［9］ Yasui K, Liu W, Kada K, et al. If current andspontaneous activity in embryonic ventricular myocytes ［J］. Circ Res, 2001;88:536-542.［10］ He TC, Zhou S, Cost LT, et al. A simplified systerm for generating recombinant adenovirus ［J］. PNAS, 1998; 95: 2509-2514.［11］ Cai J, Lin GS, Jiang H, et al. Transplanted neonatal cardiomyocytes as a potential biological pacemaker in pigs with complete atrioventricular block ［J］. Transplantation, 2005;106:346-352.［12］ Lin GS, Cai J, Jiang H, et al. Biological pacemaker created by fetal cardiomyocytes transplantation ［J］. J Biomed Sci, 2005;17:402-408.。
医学：重组腺病毒载体的构建
02
重组腺病毒载体的构建涉及多个步骤，包括选择合适的腺 病毒血清型、设计外源基因的插入位点、构建重组质粒、 转染腺病毒生产细胞等。这些步骤需要精确的操作和严格 的质量控制，以确保重组腺病毒载体的安全性和有效性。
03
重组腺病毒载体的构建过程中，需要注意选择适当的腺病 毒血清型，以确保与宿主细胞的良好亲和力和低免疫原性 。同时，需要对外源基因进行适当的修饰和优化，以提高 其在重组腺病毒载体中的表达效率和稳定性。
医学重组腺病毒载体的构建
目录
• 重组腺病毒载体概述 • 重组腺病毒载体的构建过程 • 重组腺病毒载体的应用研究 • 重组腺病毒载体的安全性及挑战 • 参考文献
01 重组腺病毒载体概述
腺病毒的特点
01
02
03
宿主范围广
腺病毒对多种细胞类型具 有感染能力，包括人体细 胞。
基因容量大
腺病毒载体可以携带较大 的基因片段，适合用于基 因治疗和疫苗研发。
02 重组腺病毒载体的构建过 程
目的基因的获取与。
目的基因的处理
对目的基因进行限制性酶切、修饰、 纯化等处理，以便于后续的克隆和鉴 定。
载体的选择与处理
载体的选择
根据实验需求选择适合的载体，如腺病毒载体、质粒载体等。
载体的处理
重组腺病毒载体的构建过程简介
选择合适的腺病毒血清型
根据应用需求选择对特定细胞类型感染力强、 免疫原性弱的腺病毒血清型。
构建重组质粒
将目的基因插入腺病毒载体的转移质粒中， 形成重组质粒。
转染与筛选
将重组质粒转染进包装细胞，筛选出能够产 生重组腺病毒的细胞克隆。
病毒扩增与纯化
在筛选出的细胞克隆中扩增重组腺病毒，并 进行纯化和浓缩。
重组腺病毒Ad-PML(NLS)-的构建及鉴定
。 Ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｌ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｙ ｏ ｎ ｇ － ｃ ｈ ｕ ａ ｎ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ｌ，Ｃ ａ ｈ ｏ ｎ ｇ ｑ ｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｌ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｃ ｈ ｏ ｎ ｇ ｑ ｉ ｎ ｇ ４ ０ ２ １ ６ ０ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
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腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养 85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖85.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组 24 6.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactop yranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
重组腺病毒构建_扩增及纯化基本技术操作——永诺生物
重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作——永诺生物一目的基因的克隆（以pshuttle-CMV质粒为例）1. 选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入pshuttl-CMV质粒多克隆位点。
2. 重组质粒鉴定：酶切鉴定或测序。
3. 重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。
4. 用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。
5. 胶回收线性化质粒，以备共转化使用。
二共转化1 大肠杆菌BJ5183电转感受态制备1）从新鲜琼脂板上挑取单个BJ5183细菌，接种于LB培养基中，37℃振摇过夜。
2）接种25ml过夜培养物于500ml LB培养基，37℃振摇，至OD600 达到0.4。
3）迅速将培养物置于冰浴中30min，至充分冷却。
4）将菌液转移至预冷的离心管中，4℃下以2500r/min离心15 min，弃培养液，回收细胞。
5）以10ml预冷的10%甘油洗涤沉淀，低温离心，共两次。
6）加约1ml（适量）预冷的10%甘油重悬沉淀，稀释悬液100倍，测量OD600，至稀释浓度为2-3×1010个细胞/ ml (1.0 OD600约2.5×1010个细胞/ml)。
分装，-80℃或液氮保存待用。
2 病毒骨架质粒转化大肠杆菌，扩增，纯化。
3 将1-5µl (约1µg) 线性化的穿梭质粒及1µl（约100ng/µl）病毒骨架质粒（如pAdEasy-1）加入至含约40µl BJ5183电转感受态的EP管中混匀,冰上冷却。
4 将混合物加入电转杯，电击（1250-1500V/mm,5ms）。
5 电击结束取出样品，加入1ml SOC或LB培养液，37℃低速振荡40min。
6 取适当体积的电击转化细胞液涂于数个卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培养16-20hr。
7 次日挑取平板上长出的菌落（选择最小的菌落）,接种于3ml含25-50mg/ml的LB 培养基，37℃培养10-15hr。
cscl双重梯度法纯化重组腺病毒的操作规程
cscl双重梯度法纯化重组腺病毒的操作规程(SOP)目的：使得重组腺病毒得到进一步的纯化原理：根据粒子的不同密度来分离。
离心过程中，粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。
主体内容：纯化一种AD（腺病毒）有三个步骤：1，不连续cscl梯度除去细胞主要的污染物和有缺陷的病毒颗粒；2，连续的cscl梯度从有缺陷的病毒颗粒中完全分离出来；3，通过透析（或脱盐）除去cscl。
连续的cscl梯度的步骤要整夜的离心分离。
一个有效的方法是，在白天竟早的开始第一步，然后在下午的早些的时候可以开始整夜的离心分离。
完整的纯化记录包括脱盐，如果按照时间表的话，要大约两天时间。
所有的纯化记录设计时是用30ml的sw28转子的离心管或等同物。
在理论上，如果分离容量合适的话，其他尺寸大小的管子也好用的。
但是要记得离心完要收集条带的。
因为污染物的密度和成熟病毒颗粒差不多，分离是两个条带很接近；所以用大直径的管子，病毒条带在管子里会显现得更稀薄更大的空间。
因此，用30ml的管子比用12ml的管子更易回采病毒带。
—，不连续cscl梯度必须注意的是在连续cscl梯度时为了更容易的获得病毒条带，你要首先阔增病毒至少到3 x 108个细胞。
1，预冷浮桶式转头(离心机)到4°C；2，用自动移液器将8 mL的cscl1.4(53 g + 87 mL of 10 mM Tris-HCl pH 7.9)移入10ml的移液管中，然后，用6ml的cscl1.2 (26.8 g + 92 mL of 10 mM Tris-HCl pH 7.9)覆盖。
病毒最后的纯化决定于这梯度的质;3,在层流通风橱中，病毒储存在5%DMEM里，漫漫的将其加到不连续的梯度液的上面，至20ml。
这病毒保存液应该来自至少感染了109个的细胞，否则梯度将会负荷过重的。
如果病毒保存液不到20ML，用10 mM Tris-HCl pH 7.9加到20ML。
4，确保管子平衡得很好，离心100 000 x g (23 000 rpm in SW 28) for90 min at 4°C,减速率= 0.5，在层流通风橱中，从转子中小心移出管子，然后用钳子安全的取出管子到台子上。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章AdEasyTM 技术 33.1 技术概况33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1 克隆的一般原则44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则54.2.2 共转化方法54.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6 4.4.1 细胞铺板64.4.2 磷酸钙转化技术7第五章常用技术85.1 QBI-293A细胞培养85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞95.3 MOI测定105.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交135.5.4 Southern杂交和点杂交135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心175.7.2 连续密度梯度离心175.7.3 病毒溶液去盐和浓集175.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法205.8.3 50%组织培养感染剂量法20第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养226.2 感染力测定226.3 转移载体克隆236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞256.6 筛选和测定256.7 在QBI-293A细胞中表达266.8 重组腺病毒的扩增266.9 纯化266.10 病毒滴度测定27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒操作手册
Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作手册(Version 2.0)上海吉凯基因技术有限公司 二〇〇九年二月地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 1 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒实验系统腺病毒是一种的线型双链 DNA 无包膜病毒， 它的 DNA 和核心蛋白形成的内核， 蛋白外壳 是直径约 80nm 的正二十面体，由 240 个六 面体和 12 个位于正二十面体顶部的五面体 构成。
Genechem 重组腺病毒系统是将携带外源基 因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的 包装质粒共转染 HEK293 细胞， 通过 Cre/loxP 系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。
重组腺病毒能够表达较大的外源基因片段， 感染分裂和非分裂细胞，具有广泛的宿主。
GFP-adenovirus 感染的代表细胞――腺病毒可以感染绝大多数细胞TCA8113SGC-7901NRKPC-3Huh-7GliaRabbit Mesenchymal Stem CellsHuman Mesenchymal Stem CellRat Cardiac Fibroblasts地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 2 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作过程一, 注意事项:1. 操作病毒时请尽量使用生物安全柜。
腺病毒载体过表达基因的流程
腺病毒载体过表达基因的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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凋亡素基因重组腺病毒的构建参考模板
凋亡素基因重组腺病毒的构建【摘要】目的构建携凋亡素基因的腺病毒载体，为进一步研究凋亡素基因功能及其作用机制建立基础。
方法 Pmel酶切线性化已经构建好的含凋亡素基因的穿梭质粒pAdTrack CMV VP3，然后电转化到BJ5183AD1细胞中进行同源重组。
PacⅠ酶切出含凋亡素基因的腺病毒DNA，然后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒，运用RT PCR鉴定重组腺病毒。
用氯化铯梯度离心纯化病毒。
用物理和生物方法确定病毒的滴度。
结果 PacⅠ酶切证实同源重组成功。
绿色荧光观察证实病毒包装成功并且具有感染力，RT PCR证实了重组腺病毒具有凋亡素蛋白的编码。
重组腺病毒的浓度为84.52×109 VP/ml，滴度为6.561×109 PFU/ml。
结论成功构建含凋亡素基因的重组腺病毒，它的滴度足以满足体内外实验。
【关键词】凋亡素基因腺病毒载体基因治疗【Abstract】Objective To construct a recombinant adenovirus carrying Apoptin gene so as to provide basis for further studying Apoptin gene functions and ascertaining corresponding mechanism. Methods The shuttle vector pAdTrack CMV VP3 containing Apoptin gene was linearized with Pmel and subsequently electrotransformed into BJ5183AD 1 cells for homologous recombination. The DNA containing Apoptin geneof the recombinant adenovirus was obtained by digesting with PacI and then transfected into 293 cells, where the recombinant adenovirus containing Apoptin gene was identified by RTPCR and purified by cesium choride density centrifugation. Finally, the titre of the recombinant adenovirus was determined by biological and physical assays. Results Digestion with PacI proved successful homologous recombination. Green fluorescence showed successful recombinant adenovirus with infectiveness. RT PCR confirmed that the recombinant adenovirus had coding of Apoptin gene proteins. The titre of the recombinant adenovirus was 84.52×109 VP/ml and 6.561×109 PFU/ml. Conclusion The recombinant adenovirus vector containing Apoptin gene is successfully constructed, with its titre sufficient for in vivo and in vitro experiment.【Key words】 Apoptin gene; Adenovirus vector; Gene therapy凋亡素，又称Apoptin(apoptosis induction)［1］，是来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子蛋白质。
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重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048）
1、目的及适用范围
该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。
2、主要仪器及试剂
电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。
限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿
3、操作步骤
3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。
3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。
3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。
所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。
3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。
如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。
3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。
3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。
3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。
划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。
分装20μL/管，-80℃冻存。
3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。
提取质粒DNA。
推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。
3.4 用Pme I或EcoRI线性化穿梭质粒：必须保证酶切完全。
0.1μg-0.5μgDNA用300U的酶100μL 体系。
电泳检测酶切是否完全。
3.5乙醇沉淀法回收纯化线性化的穿梭载体。
3.6 冰上操作：向20μLBJ5183感受态细胞中加入pAdeasy-1腺病毒骨架质粒和线性化的穿梭质粒，混匀，总体积不超过30μL。
3.7 将感受态和DNA混合物转移到用冰预冷的电转杯中，电击转化。
电击完成后加入预热的LB
101。