腺病毒载体构建 ppt
腺病毒载体构建ppt课件
第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代
载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
整理版课件
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腺病毒的基因及其功能
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚 期表达。
早期表达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并 且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。
早期表达的E1区蛋白（甚至包括E2区蛋白）是腺病毒基因组复制、病毒
包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
E2蛋白涉及AdDNA复制
E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统
E4蛋白调节有效的晚期基因转录
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腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）
安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞
基因组外游离状态下表整达理版，课整件合突变致癌可能性小。
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几种病毒载体的区别
整理版课件
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整理版课件
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AdEasy腺病毒载体系统
稳定 性高
腺病毒.ppt
什么季节容易感染腺病毒
1、冬春季节气温较低，病毒存活时间更长 2、冬季人群常在室内聚集活动，居所大多通风
不佳，易于病毒传播
冬春季容易出现腺病毒感染的暴发流行
典型临床表现
发热、干咳、咽痛等上呼吸道感染症状为主，部 分伴有头痛、乏力、恶心、食欲缺乏等不适感，大便 每天2-4次，呈稀水样或糊状。
症状明显的患者张开嘴便可发现咽部“一片 红”，俗称为“血盆大口”这是病毒侵犯咽部导致 的充血反应，部分患者扁桃体会增大，并可见白色 分泌物。
腺病毒 相关知识
什么是腺病毒
1、腺病毒是一种DNA病毒，自然界广泛分布，一般把 能感染人类的腺病毒称为人腺病毒。
2、腺病毒能引起呼吸系统，消化系统，泌尿系统等多个 系统的感染
3、以儿童的呼吸系统感染和粘膜感染最为常见
腺病毒是如何传播的？
患者和隐性感染者是腺病毒感染的主要传染源， 主要通过呼吸道飞沫近距离传播，在相对密闭，通风 不畅的场所容易发生传播。
呼吸道感染
间质性肺炎
一般急骤发热，往往自第1～2日起即发生39℃以上 的高热，至第3～4日多呈稽留或不规则的高热；3/5以 上的病例最高体温超过40℃。
消化系统感染
流行性角膜结膜炎
结膜充血，有异物感、烧灼感、怕光、流泪及轻度 视力障碍。
腺病毒感染引起的并发症
腺病毒呼吸道感染绝大多数为轻症病例，一般7-10 天可自行好转；只有少数发展为重症病例。在免疫稳 定的人群中很少导致死亡，但在新生儿、婴幼儿和免 疫低下人群中可导致严重腺病毒肺炎或致死性腺病毒 感染。
老师，在采取有效防护措施的情况下及时到卫生队就 诊；
具体措施
1、避患者：由于腺病毒主要通过飞沫传播，与患者说话距
离应在1.8米以上，尽量避免触摸患者接触过的物体。如 衣物、门把手、钱币和扶手等
腺病毒载体的构建和应用
腺病毒载体的构建和应用随着生物工程技术的不断发展，越来越多的生物医学研究领域开始趋向于基因治疗和基因编辑等方向。
这些技术的实现需要一种特殊的工具——腺病毒载体。
腺病毒（Adenovirus）是一种不包含RNA病毒的DNA病毒，其表面包裹着许多蛋白质，使其具有较好的基因导入能力。
这使得腺病毒成为一种常用的基因载体，被广泛应用于细胞遗传学、基因治疗等领域。
腺病毒的构成腺病毒包含一个大小为36 kb的线性双链DNA，这条DNA上编码了丰富的基因信息，其中大约包含40个基因左右。
腺病毒分为革兰氏正染色体和非冠状病毒两种类型，目前在研究中应用最多的是非冠状病毒型腺病毒。
腺病毒载体构建的两种方法目前有两种主要的构建腺病毒载体的方法，分别是端到端的法和质粒基因重组的法。
端到端的法端到端的法在构建腺病毒载体时需要把目标基因全长克隆进腺病毒的基因组中。
这种方法在基因克隆、重组和转染等方面比较复杂，对实验人员的操作技能要求较高。
同时，这种方法的构建产物相对来说比较容易受到细胞内DNA修饰和限制性酶的影响。
质粒基因重组的法对比之下，质粒基因重组的法相对来说较为容易，需要构建的重组质粒包括表示目标基因的转录单元以及与腺病毒DNA重组所需的旁路序列等。
通过将质粒DNA转染至腺病毒蛋白质、酶和基因表达产物等组分共同构成的细胞核中，将质粒DNA与腺病毒DNA进行重组，从而构建出目标腺病毒载体。
质粒基因重组法不仅可以有效克服端到端法受到限制性酶和DNA修饰的影响，而且富于设计灵活度，从而满足更多的实验需求。
腺病毒载体的应用腺病毒载体广泛应用于人类和动物细胞体内的基因传递、基因治疗和基因工程方面。
通过腺病毒载体可进行基因敲除、基因转录和基因转译等一系列基因编辑操作。
基因敲除基因敲除是研究腺病毒载体理解生命过程和信号转导途径的重要手段之一。
通过基因敲除的方法可以对特定基因进行敲除，从而寻找与该基因相关联的复杂的生物学催化剂。
目前腺病毒载体敲除方法尤其得到广泛应用，对于生命科学研究者来说具有重要的意义。
腺病毒载体工艺平台介绍(PPT37张)
LMP2
CDC病毒病所委托 源兴承担药学研究
2019/4/11
基因药物研发中心
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新药申报三方面研究内容 • 药学研究 • 药效研究 • 安全评价
2019/4/11
基因药物研发中心
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药学研究主要内容 • • • • • • • 上游构建及鉴定 细胞/毒种研究及三级库建立 原液工艺研究 制剂工艺研究 检测方法及质量标准研究 稳定性研究 试制三批样品
2019/4/11
基因药物研发中心
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管理制度 • 建立了300多个SOP、SMP等标准程 序和规章管理制度，按照GMP要求 严格规范管理。
2019/4/11
基因药物研发中心
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研发中心工艺平台
• 研发中心工艺产业化平台是通用型腺病毒载体药 物生产工艺和质量标准研究的药学技术平台，中 试生产工艺水平达到了国内同行业先进水平，可 以在产量及质量上满足腺病毒载体药物临床前和 临床用样品制备的要求。 • 本工艺拥有自主知识产权，可作为腺病毒载体新 药研发及生产的技术基础。 • 5L细胞罐收获物经纯化后产量能达到E15VP/批， 注射液制剂工艺达到了小容量水针1万支/批的生 产能力。 • 产品纯度大于98%，比滴度大于3.3%，各项质检 结果都能达到FDA对腺病毒类生物制品的质量标 准要求。
20211122?基因药物研发中心研发中心已完成申报临床所需药学研究的品种品种代号研究单位研究时间治疗性重组hbv腺病毒疫2004年3月至2005年11月治疗性hiv腺病毒载体疫苗h302005年12月至2007年8月治疗性重组腺病毒eb病毒潜伏膜抗原疫苗lmp2cdc病毒病所委托源兴承担药学研究2007年9月至2008年10月20211122?基因药物研发中心新药申报三方面研究内容安全评价20211122?基因药物研发中心药学研究主要内容试制三批样品20211122?基因药物研发中心细胞及毒种研究毒种检定代次及遗传稳定性研究20211122?基因药物研发中心建细胞库原始细胞细胞来源于atcc主细胞库质量控制工作细胞库质量控制细胞扩增细胞扩增20211122?基因药物研发中心工作种子批病毒扩增原始种子批主种子批鉴定检病毒扩增20211122?基因药物研发中心原液工艺流程参数及技术指标sepharosefastflow分子筛层析回收率3批平均重组腺病毒种子罐收获物超滤浓缩液source30q阴离子交换柱层析层析收集液6000rpm离心20min500k膜超滤浓缩10倍细胞种子细胞罐扩增5l罐细胞培养病毒扩增
【医学ppt课件】腺病毒
➢血清学诊断
采取患者早期和恢复期双份血清做CF试验、HI试验 及NT试验。恢复期血清抗体滴度比早期增长4倍以上有诊 断意义。其中CF试验最为疫苗和 减毒活疫苗。但因腺病毒对新生地鼠有致癌作 用，人们对于疫苗的作用难免有疑虑。最近有 人研制腺病毒衣壳亚单位疫苗，可解决疫苗的 安全性问题。
➢抵抗力
腺病毒对理化因素的抵抗力较强，耐酸并能耐 受蛋白酶及胆汁的作用。在室温中可存活10d 以上，56℃30min灭活。
➢致病性
致病性和免疫性
腺病毒经呼吸道、消化道或眼结膜侵入人体，在扁 桃体、增殖腺、肠系膜淋巴结等局部淋巴组织中增殖， 不形成病毒血症。
腺病毒主要感染儿童，大多无症状。相关的临床病 症主要是小儿急性咽炎、急性呼吸道感染和病毒性肺炎 等。 某些型别腺病毒可引起婴儿腹泻，称肠道腺病毒。 此外，还能导致其它一些临床疾病，如小儿的急性出血 性膀胱炎。
纤维状刺突 (antennal fiber,or fiber)：
纤突对哺乳类动物的细胞有毒性作用。腺 病毒具有血凝性。
共同抗原：CF 特异性抗原： NT/HI
➢培养特性：
生物学性状
人类腺病毒无敏感动物，也不能在鸡胚中生长。 但能在来源于人的多种细胞培养中增殖，引起 明显CPE：细胞肿胀变圆、集聚成葡萄串状， 并可在感染的细胞核内形成嗜碱性包涵体。
其中腺病毒肺炎是我国北方儿童的一种常见病， 1958年曾有过大流行。A组腺病毒在体外具有转化细胞的 性质，并能对新生地鼠致癌。但迄今尚未见在人体致癌 的报告。
致病性和免疫性
➢免疫性
腺病毒感染后，产生特异性抗体，对同 型病毒的感染有保护作用，免疫力持久。
Get格雅 重组腺病毒理论 ppt课件
An ideal gene delivery should include:
Protecting DNA against nuclease degradation; Transporting DNA to the target cells; Facilitating transport of DNA across the plasma membrane; Promoting the import of DNA into the nucleus.
In vivo gene transfer for ocular diseases. A. An aAAV) vector is injected into the subretinal space using a surgical procedure. B. Gene transfer of RPE-65 (色素表皮细胞特异的65kDa蛋白)to the retina restored light sensitivity in patients with Leber's congenital amaurosis (LCA) (from Proc Natl Acad Sci USA 105(39):15112-7,2021. C. A similar protocol for AAV-mediated Lopsin corrected color blindness in squirrel monkeys.
DNA: large molecular weight; Sensitive to nucleases
The key problem remains gene delivery
DNA entering to cell, three major obstacles
真核载体构建
42℃、90sec
不含抗生素的培养基热休克 得到细菌的克隆
37℃ 涂布选择性平板 30-60min （合适抗生素） （使质粒扩增）
37℃ 10hr
2.感染（infection）：也称转导（transduction） 由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的过程 有一个：体外包装过程
lDNA ®E-coli 动、植物病毒DNA ®动植物细胞
PCR扩增
vDNA polymerase 高保真酶 primerstar probest Phusion vRich GC sequence primerstar with GC buffer v热启动PCR，Nest PCR
载体构建步骤
v Get the target DNA sequence v Select appropriate vector v PCR primer design v Obtain cell or tissue v PCR amplification v Restriction, ligation and transformation
克隆载体→表达载体
A A
双 酶 切
表达载体
限制性内切酶
连接
v PCR product:vector 1：10~ 10:1（1：3 ~ 3：1）摩尔比 v At 25 °C for 23 hours or at 16 °C overnight v Inactive T4 DNA ligase (at 70 °C for 10min )
2. 缺点：①高水平表达基因产物易沉淀、凝集、不易折叠 ②基因产物纯化工艺复杂 ③基因产物易受污染（内毒素） ④基因产物对受体菌有毒害作用 ⑤基因产物易被水解 ⑥从安全角度——并不理想 ⑦缺乏基因产物表达后加工机制
TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建-最新文档
TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建能够特异识别抗原肽-MHC复合物的T 细胞受体(T cell antigen receptor ,TCR)，在肿瘤抗原的识别及杀伤过程中具有重要作用[1,2]，将肿瘤抗原特异性识别的TCR基因转染T细胞用于杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的方法之一[3]。
在以往实验中发现转染TCRVβ7.1基因的T细胞对肝癌细胞株BEL-7402[4]杀伤活性明显提高，由于脂质体的转染率较低和毒性较大，现构建重组腺病毒载体Ad.TCRVβ7.1，以提高转染率和降低毒性。
1材料与方法1.1质粒、菌株和细胞AdMaxTM 腺病毒包装系统(腺病毒骨架质粒、腺病毒穿梭质粒pDC315、HEK293细胞)购自加拿大Microbix公司；PBMC从人血分离；质粒pcDNA3.1- TCRVβ7.1、Hela（宫颈癌细胞）及大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。
1.2试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录试剂盒及DNA Mark购自Takara公司。
Lipofectamine2000和Trizol购自Invetrogen公司。
质粒提取及胶回收试剂盒均购自Omega公司。
淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技XX公司。
1.3穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1的构建穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1构建过程如（图1）。
设计一对带有EcoRⅠ和XhoⅠ的TCRVβ7.1引物，PCR产物双酶切后连接到穿梭质粒pDC315中，得到腺病毒穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1。
图1 穿梭质粒pDC315Vβ7.1的构建1.4重组腺病毒Ad.TCRVβ7.1的包装接种4×105个低代的HEK293细胞于六孔板中，约24h后细胞密度达到60%～80%时，用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒和骨架质粒共转染293细胞。
待细胞长满培养板时，将其消化转移至10cm细胞培养皿中继续培养。
〖医学〗重组腺病毒载体的构建
BTEB2简介
基本转录元件结合蛋白2－转录因子 功能：促进VSMC增殖和表型转化
外源性基因的制备
VSMC中提取总RNA RT－PCR得到BTEB2 cDNA 体会：从目的基因丰度高的组织或细胞
中提取。
重组穿梭质粒的构建－－将 PCR产物克隆到穿梭质粒
用BamH I 和 EcoR I 双酶切穿梭质粒 pDC315及BTEB2 cDNA
用T4连接酶将BTEB2 cDNA反向连接到 穿梭质粒 定向克隆
体会：设计引物时引入需要的酶切位点 可使基因定向克隆的程序简化
重组穿梭质粒的鉴定
酶切鉴定：用BamH I 和 EcoR I 双酶切 重组穿梭质粒pDC315ASBTET2，电泳
目的片段测序
重组腺病毒的制备
脂质体介导重组穿梭质粒和腺病毒基因组质粒 共转染293细胞
腺病毒载体的包装细胞
HEK293细胞的培养 高糖型DMEM 10%FBS（构建），10%NBS（扩增）
HEK293细胞的传代次数与腺病毒载体构 建和扩增 构建：＜20代－－构建成功的关键 扩增：无特殊要求
重组原理
重组腺病毒载体构建
以反义BTEB2腺病毒表达载体为例 介绍重组腺病毒载体的构建过程
重组腺病毒的鉴定
病变293细胞于液氮、37°C反复冻融， 离心
取上清提取重组病毒DNA 用目的片段引物和病毒基因组特征片段
引物作PCR
病毒滴度测定
24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加
PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至 第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液 0.2ml。 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
pAAV-MCS腺病毒载体说明(图)
pAAV-‐MCS编号 载体名称北京华越洋VECT10024 pAAV-‐MCSpAAV-‐MCS载体基本信息：载体名称: pAAVMCS， pAAV-‐MCS, p AAV M CS质粒类型: 腺病毒相关载体表达水平: 高启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4650 b p5' 测序引物及序列: CMV-‐F: 5'-‐CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-‐3'3' 测序引物及序列: hGH-‐PA-‐R: C CAGCTTGGTTCCCAATAGA载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: /组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐MCS载体质粒图谱和多克隆位点信息pAAV-‐MCS载体序列:ORIGIN1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCAAAG C CCGGGCGTC 61 G GGCGACCTT T GGTCGCCCG G CCTCAGTGA G CGAGCGAGC G CGCAGAGAG G GAGTGGCCA 121 A CTCCATCAC T AGGGGTTCC T GCGGCCGCA C GCGTGGAGC T AGTTATTAA T AGTAATCAA 181 T TACGGGGTC A TTAGTTCAT A GCCCATATA T GGAGTTCCG C GTTACATAA C TTACGGTAA 241 A TGGCCCGCC T GGCTGACCG C CCAACGACC C CCGCCCATT G ACGTCAATA A TGACGTATG 301 T TCCCATAGT A ACGTCAATA G GGACTTTCC A TTGACGTCA A TGGGTGGAG T ATTTACGGT 361 A AACTGCCCA C TTGGCAGTA C ATCAAGTGT A TCATATGCC A AGTACGCCC C CTATTGACG 421 T CAATGACGG T AAATGGCCC G CCTGGCATT A TGCCCAGTA C ATGACCTTA T GGGACTTTC 481 C TACTTGGCA G TACATCTAC G TATTAGTCA T CGCTATTAC C 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ACAGGTATC 4441 C GGTAAGCGG C AGGGTCGGA A CAGGAGAGC G CACGAGGGA G CTTCCAGGG G GAAACGCCT 4501 G GTATCTTTA T AGTCCTGTC G GGTTTCGCC A CCTCTGACT T GAGCGTCGA T TTTTGTGAT4561 G CTCGTCAGG G GGGCGGAGC C TATGGAAAA A CGCCAGCAA C GCGGCCTTT T TACGGTTCC 4621 T GGCCTTTTG C TGGCCTTTT G CTCACATGT//pAAV-‐MCS其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFPpAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFP pAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCS pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMV pAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFP pAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐Fluc pAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐B pDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RC pAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐Pur pAAV-‐minCMV-‐mCherry。
腺病毒载体的构建
腺病毒载体的构建第四章SOCS2腺病毒载体的构建 1腺病毒载体的构建由第三章结果可知，基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达⽔平较低，但是GH 可以诱导SOCS2稳定⾼表达。
SOCS2⾼表达的同时，GH诱导的脂肪细胞分化因⼦和脂质代谢基因表达发⽣了变化。
为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过⼀种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续⾼表达。
细胞导⼊外源基因是⽬前常⽤的⽅法，但是保证外源基因的⾼效表达需要合适的表达系统。
⽬前常⽤的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。
质粒载体可以导⼊外源基因，但是质粒的转染效率很低，如何把⽬标基因导⼊靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。
逆转录病毒可以把⽬标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。
蔓病毒本⾝对脂肪细胞的感染率⼜⽐较低。
⽽腺病毒滴度⾼，适合外源基因⼤量表达，并且可插⼊较⼤的⽬的⽚段，对细胞类型限制较⼩，可感染⾮分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。
另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作⽐较简单(Luo JY et al. 2007)。
本章克隆SOCS2基因，采⽤pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体，为SOCS2在脂肪细胞中⾼效表达，研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。
4.1材料4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株脂肪组织取⾃6周龄昆⽩⼩⿏，⼩⿏购⾃第四军医⼤；E.coli DH5α菌株由本实验室保存；pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒，E.coli BJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌⾁发育实验室赠送；⼈胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中⼼。
4.1.2 主要试剂限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋⽩Marker购⾃Fermentas公司；内切酶PmeI和PacI购⾃NEB公司；pMD TM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购⾃Takara公司；穿梭质粒⼩提试剂盒购⾃Omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购⾃Bioflux公司；λ/Hin dIII Marker购⾃天根公司；OptiMem优化培养液购⾃Gibico公司；脂质体Lipofectamine TM 2000购⾃Invitrogen公司。
医学：重组腺病毒载体的构建
02
重组腺病毒载体的构建涉及多个步骤，包括选择合适的腺 病毒血清型、设计外源基因的插入位点、构建重组质粒、 转染腺病毒生产细胞等。这些步骤需要精确的操作和严格 的质量控制，以确保重组腺病毒载体的安全性和有效性。
03
重组腺病毒载体的构建过程中，需要注意选择适当的腺病 毒血清型，以确保与宿主细胞的良好亲和力和低免疫原性 。同时，需要对外源基因进行适当的修饰和优化，以提高 其在重组腺病毒载体中的表达效率和稳定性。
医学重组腺病毒载体的构建
目录
• 重组腺病毒载体概述 • 重组腺病毒载体的构建过程 • 重组腺病毒载体的应用研究 • 重组腺病毒载体的安全性及挑战 • 参考文献
01 重组腺病毒载体概述
腺病毒的特点
01
02
03
宿主范围广
腺病毒对多种细胞类型具 有感染能力，包括人体细 胞。
基因容量大
腺病毒载体可以携带较大 的基因片段，适合用于基 因治疗和疫苗研发。
02 重组腺病毒载体的构建过 程
目的基因的获取与。
目的基因的处理
对目的基因进行限制性酶切、修饰、 纯化等处理，以便于后续的克隆和鉴 定。
载体的选择与处理
载体的选择
根据实验需求选择适合的载体，如腺病毒载体、质粒载体等。
载体的处理
重组腺病毒载体的构建过程简介
选择合适的腺病毒血清型
根据应用需求选择对特定细胞类型感染力强、 免疫原性弱的腺病毒血清型。
构建重组质粒
将目的基因插入腺病毒载体的转移质粒中， 形成重组质粒。
转染与筛选
将重组质粒转染进包装细胞，筛选出能够产 生重组腺病毒的细胞克隆。
病毒扩增与纯化
在筛选出的细胞克隆中扩增重组腺病毒，并 进行纯化和浓缩。
腺病毒的感染与防治PPT课件
咽结合膜热
以发热、咽炎、结膜炎为特征 ，常伴有颈部淋巴结肿大。
急性出血性膀胱炎
主要表现为尿频、尿急、尿痛 等膀胱刺激症状，以及镜下血
尿或肉眼血尿。
其他类型
包括胃肠炎、心肌炎、脑炎等 ，临床表现多种多样。
重症患者特征及预后
重症患者特征
多见于5岁以下儿童，尤其是2岁以下婴 幼儿；持续高热超过3天，精神萎靡或烦 躁不安；频繁咳嗽，气促明显，甚至出 现呼吸困难和发绀；心率增快，出现心 音低钝或奔马律；肝脏进行性肿大，伴 有压痛；外周血白细胞计数明显升高或 降低，C反应蛋白等炎症指标明显升高。
腺病毒分类
根据血清型和基因组的不同，腺 病毒可分为多个种类，包括A-F组 ，每组又包含多个血清型。
腺病毒传播途径
空气传播
水传播
腺病毒可通过飞沫、气溶胶等空气传 播方式传播，感染者在咳嗽、打喷嚏 或说话时产生的飞沫可携带病毒。
腺病毒还可能在游泳池、浴室等潮湿 环境中通过水传播，感染者在水中排 泄后，病毒可在水中存活一段时间。
勤洗手
经常用肥皂和清水洗手， 特别是在接触公共场所或 动物后。
戴口罩
在公共场所、医院等环境 中，应佩戴口罩，防止病 毒通过飞沫传播。
避免接触
避免与生病的人密切接触 ，减少感染风险。
公共场所卫生管理要求
定期清洁消毒
对公共场所如学校、幼儿园、医 院、商场等，要定期进行清洁和
消毒。
保持通风
确保公共场所通风良好，有助于降 低病毒在空气中的浓度。
可通过病毒学检测进行鉴别。
支原体肺炎
支原体肺炎与腺病毒肺炎在影像 学上表现相似，但支原体肺炎起 病较缓、病程较长，可通过血清
学检测和PCR技术进行鉴别。
人可溶性转化生长因子βⅡ型受体重组腺病毒表达载体的构建
网１．ＰＳＩ质粒图谱、多克隆酶切位点及质粒特点（摘自＿ｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ）图２．腺病毒骨架质粒及其特点（摘自ｗｗｗ．—ｓｔ—ｒａｔａｇｅｎｅ，ｃｏｍ）１．３试剂１．３．１实验试剂１．３．１．１Ｐｌａｔｉｎｕｍ高保真ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／１１１）：美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，共含ＩＯＯＵ酶，货号１３１３５５９。
１．３．１．２ＥｘＴａｑＤＮ＾聚合酶（５Ｕ／ｌｌ１）｛日本Ｔａｋａｒａ，共含２５０Ｕ聚合酶、Ｉｍｌ１０ｘＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒ（峭ｐｌｕｓ）、８００ｎ１２．５ｍＭｄＮＴＰｓ混合液和Ｉｍｌ６ｘｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ，货号ＤＲＲＯＯＩＡ。
１．３．Ｌ３限制性内切酶ＳａｌＩ（２０ｕ／｜Ｉ１）：英国ＮＥＢ公司，共含１０００Ｕ内切酶，ＩｍｌｌＯｘＴａｎｇｏｂｕｆｆｅｒ，货号Ｒ０１３８Ｖ。
１．３．１．４限制性内切酶ＸｈｏＩ（２０ｕ／１１１）：英国ＮＥＢ公司，共含２５００Ｕ内切酶。
ｌｍｌｌＯｘＴａｎｇｏｂｕｆｆｅｒ，货号Ｒ０１４６Ｖ。
１．３．１．５限制性内切酶ＰｍｅＩ（１０Ｕ／１１１）：英国ＮＥＢ公司，共含２５０Ｕ内切酶、５００Ｉｌ１１０ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ４、５００ｌｌｌ１００ＸＢＳＡ，货号Ｒ０５６０Ｖ。
１．３．１．６限制性内切酶ＰａｃＩ（ＩＯＵ／１１１）：英国ＮＥＢ公司，共含１２５Ｕ内切酶、结果表明序列正确。
如图４所示．Ｍ．－眦＾ＭａｒｋｅｒＤＬ２，０００Ｉ：ｓＴＢＲＩＩＰＣＲ产物Ｍ：＾－ＨｉｎｄｍＤＮＡＭａｒｋｅｒｌ：ＴＡ＿ｓＴＢＲⅡ质粒（１号）２：ＴＡ＿ｓＴＢＲⅡ质粒（２号）Ｍｌ：＾－Ｈｉｎｄ０１ＤＮＡＭａｒｋｅｒ１：．ｒ＿Ａ＿ｓＴ６ＲⅡ质粒（１号）的双酶切结果２：ＴＡ—ｓＴＢＲⅡ质粒（２号）的双酶切结果啦：ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２，０００图４、ｓＴＢＲＩＩ和Ｔ卜ｓＴＢＲＩＩ质粒鉴定结果１．２测序结果显示插入片段为正确的人ｓＴＯＲⅡ序列。
测序结果如下Ｉ测序结果与Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ中所提供的序列在ＤＮＡｓｓｉｓｔ２．０软件上分析比对，结果正确。
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部（或右侧大部分）
腺病毒基因组DNA
的大质粒，即骨架
质粒
-
6
二、小的穿梭质粒，其带有
目的基因的表达盒以及表达
盒两侧的与大质粒上的目的
基因拟插入部位同源序列
（左右臂）
-
7
-
8
AdEasy腺病毒载体系统
稳定 性高
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在 连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
-
5
腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础
重组腺病毒的构建
-
1
腺病毒
•腺病毒 Adenovirus 最初由人类腺样增殖体组织培养中分 离得到的，此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微米 的正二十面体，各顶点具有突起。结构亚基总数为252个。 核酸是双链DNA，分子量20—25×106。无包膜。在被感染的细 胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合成，再输送到细胞核。 •腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感冒 症状、呼吸系统不适等。
宿主范 可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处
围广
于分裂状态的细胞。
感染性 可经不同途径进入不同组织(可以在肠道内繁殖，也可
强以
在呼吸道内繁殖。
包装容量 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb， 大 腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。
安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞
早期表达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并 且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。
早期表达的E1区蛋白（甚至包括E2区蛋白）是腺病毒基因组复制、病毒
包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
E2蛋白涉及AdDNA复制
E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统
E4蛋白调节有效的晚期基因转录
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4
腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）
第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代
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2
腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它 通过 受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病 毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整 合进入宿主细胞基因组中.
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3
腺病毒的基因及其功能
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚 期表达。
基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小。
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9
几种病毒载体的区别
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