第三章 植物基因工程载体及其构建

载体应具备的条件
➢ 具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制； ➢ 具备合适的酶切位点，供外源片段插入； ➢ 含有供选择转化子的标记基因； ➢ 适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备； ➢ 载体的安全性：对受体细胞无毒害，不能随便转移； ➢ 载体大小：原则上要求载体越小越好； ➢ 如果需要外源基因的表达：启动子。
5.8×106 4.2×106 7.4×106
1~3
EcoR I
tetr
严紧
20
EcoR I
大肠杆菌素 松弛
10 EcoR I (BamH I)
ampr
松弛
改造策略： ➢去掉多余片段：缩小质粒分子量，提高外源DNA片段的装载量； ➢减少限制性酶切位点：缺失突变，限制性酶、核酸外切酶和连接酶...； ➢提供多克隆位点 ➢易识别的选择标记：通过质粒之间的重组导入； ➢安全性改造：质粒载体不能在细菌间随便转移； ➢增加辅助功能：表达载体。
筛选标记基因 插入失活法
互补筛选法
➢ lacZ编码β-半乳糖苷酶，乳糖及其衍生物可诱导其表达
(乳糖既是诱导物, 也是底物)；
➢ IPTG：乳糖衍生物，可作为lac操纵子的诱导物，但不能 作为反应底物；
➢ X-gal：可作 lac操纵子的底物，不能作为诱导物。还可 作为生色剂，被β-半乳糖苷酶分解后产生兰色物质，使 菌落呈现兰色。
5、质粒的可转移性
接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一 个细胞（接合作用）。甚至能使寄主染色体上的基因随其一 道转移到受体菌种。 非接合型质粒：不能再天然条件下独立地发生接合作用。 某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助，也能发生 DNA转移。由mob、tra基因顺式因子bom及其内部的转移缺 口位点nic决定。
3、质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒。 DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个 细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：
①严紧型质粒（stringent plasmid） 拷贝数少，只有1—3份拷贝。
② 松弛型质粒（relaxed plasmid） 拷贝数多，有几十—几百份拷贝。
2.载体的种类
细菌质粒载体
病毒载体 按来源分：
噬菌体载体
Ti 质粒 Ri 质粒
转座子载体 人工染色体载体、线粒体载体、叶绿体载体等
按功能分：
➢ 克隆载体：主要用来克隆和扩增DNA片段，能带动外 源基因在宿主细胞中复制扩增。
➢ 表达载体：除具有克隆载体的基本元件外，还具有转 录、翻译所必需的DNA元件，使外源基因在宿主细胞 中有效表达。
不是寄主生长所必需的，但可以赋 予寄主某些抵御外界环境因素不利 影响的能力（带有抗性基因等）。
分子量在1-200 kb之间。
2、质粒（plasmid）构象 超螺旋：共价闭合环状DNA
质粒空间构型 开环DNA：1条链上有一至数个缺口
线型DNA：
最快的是超螺旋， 其次是线性DNA， 最慢的是开环DNA。
卸甲载体
切除致瘤基因的Ti质粒或Ri质粒，是构 建转化载体的受体质粒。
转化载体
最后用于目的基因导入植物细胞的载体，工程载体。 由中间表达载体和卸甲载体构建。
第二节 质粒载体
1、质粒（plasmid）概念 质粒(plasmid)：存在于细菌或真菌染色体外的小型环 状(线型质粒DNA分子——线虫、衣藻等)双链DNA分子 (酵母的“杀伤质粒”是RNA)，可自身复制和表达。
➢ lac Z ΔM15 ：缺失β-半乳糖苷酶第11-41个aa； ➢ lac Z’ ：只编码N端140个aa；
lac Z ΔM15 + lac Z’ =功能互 在lac Z’补编码区上游插入一小片段DNA (如51bp的MCS)，
不影响β-半乳糖苷酶的功能互补。但在该小片段DNA中再插 入一个片段，将导致产生无互补能力的β-半乳糖苷酶片段；
➢ 整合载体：将目的基因插入到受体染色体中。
目的基因 克隆载体
其功能是保存和克隆目的基因。与微生物基因工程 相似，通常是由多拷贝的E. Coli小质粒为载体。
中间克隆载体
大肠杆菌质粒插入T-DNA片段及目的基因、标 记基因等。是构建中间表达载体的基础质粒。
中间载体
中间表达载体
含有植物特异启动子的中间载体。作为构建 转化载体的质粒。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
6、携带特殊的遗传标记
物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱
对重组DNA分子的筛选十分重要！
按用途可分为选择标记基因和筛选标记基因。 ➢ 选择标记：用于转化子的挑选； ➢ 筛选标记：用于重组子的挑选； ➢ 转化子：成功转化了载体的宿主细胞； ➢ 重组子：真正含有重组DNA的转化子。
➢ lac Z ΔM15 放在F质粒上，随宿主传代； ➢ lac Z’ 放在载体上，作为筛选标记；
➢ 受体菌有JM系列、TG1和XL1-Blue等。
7、天然质粒载体的局限性
（1）分子量大，拷贝数低 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。
但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。
第三章 植物基因工程载体及其构建
第一节 载体概述
1.载体概念
载体(vector)：能够承载外源基因，并将其转入受体细胞 进行扩增和表达的DNA分子。
功能 ➢ 运送外源基因高效转入受体细胞； ➢ 为外源基因提供复制能力和整合能力； ➢ 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件；
所以，目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持 高效表达，很大程度上取决于载体。
（2）筛选标志不理想，合适的单一酶切位点少 ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。 杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。
唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。
天然质粒 相对分子质量 拷贝数 单一酶切位点 选择性标记 复制类型
pSC101 ColE1 RSF2124
4、质粒的不相容性 同种的或亲缘关系相近的两种质粒，含有相似复制子结构， 不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相 容性。不相容性的质粒组成不相容性群。
在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时，不相容的质 粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞 争，随机挑选，最终放大。