第三章 植物基因工程载体及其构建

筛选标记基因 插入失活法
互补筛选法
➢ lacZ编码β-半乳糖苷酶，乳糖及其衍生物可诱导其表达
(乳糖既是诱导物, 也是底物)；
➢ IPTG：乳糖衍生物，可作为lac操纵子的诱导物，但不能 作为反应底物；
➢ X-gal：可作 lac操纵子的底物，不能作为诱导物。还可 作为生色剂，被β-半乳糖苷酶分解后产生兰色物质，使 菌落呈现兰色。
第三章 植物基因工程载体及其构建
第一节 载体概述
1.载体概念
载体(vector)：能够承载外源基因，并将其转入受体细胞 进行扩增和表达的DNA分子。
功能 ➢ 运送外源基因高效转入受体细胞； ➢ 为外源基因提供复制能力和整合能力； ➢ 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件；
所以，目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持 高效表达，很大程度上取决于载体。
➢ lac Z ΔM15 放在F质粒上，随宿主传代； ➢ lac Z’ 放在载体上，作为筛选标记；
➢ 受体菌有JM系列、TG1和XL1-Blue等。
7、天然质粒载体的局限性
（1）分子量大，拷贝数低 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。
但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。
➢ lac Z ΔM15 ：缺失β-半乳糖苷酶第11-41个aa； ➢ lac Z’ ：只编码N端140个aa；
lac Z ΔM15 + lac Z’ =功能互 在lac Z’补编码区上游插入一小片段DNA (如51bp的MCS)，
不影响β-半乳糖苷酶的功能互补。但在该小片段DNA中再插 入一个片段，将导致产生无互补能力的β-半乳糖苷酶片段；
➢ 整合载体：将目的基因插入到受体染色体中。
目的基因 克隆载体
其功能是保存和克隆目的基因。与微生物基因工程 相似，通常是由多拷贝的E. Coli小质粒为载体。
中间克隆载体
大肠杆菌质粒插入T-DNA片段及目的基因、标 记基因等。是构建中间表达载体的基础质粒。
中间载体
中间表达载体
含有植物特异启动子的中间载体。作为构建 转化载体的质粒。
不是寄主生长所必需的，但可以赋 予寄主某些抵御外界环境因素不利 影响的能力（带有抗性基因等）。
分子量在1-200 kb之间。
2、质粒（plasmid）构象 超螺旋：共价闭合环状DNA
质粒空间构型 开环DNA：1条链上有一至数个缺口
线型DNA：
最快的是超螺旋， 其次是线性DNA， 最慢的是开环DNA。
载体应具备的条件
➢ 具备复制原点，在宿主细胞内能够自主复制； ➢ 具备合适的酶切位点，供外源片段插入； ➢ 含有供选择转化子的标记基因； ➢ 适当的拷贝数：较高的拷贝数，便于回收、制备； ➢ 载体的安全性：对受体细胞无毒害，不能随便转移； ➢ 载体大小：原则上要求载体越小越好； ➢ 如果需要外源基因的表达：启动子。
3、质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒。 DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个 细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：
①严紧型质粒（stringent plasmid） 拷贝数少，只有1—3份拷贝。
② 松弛型质粒（relaxed plasmid） 拷贝数多，有几十—几百份拷贝。
5.8×106 4.2×106 7.4×106
1~3
EcoR I
tetr
严紧
20
EcoR I
大肠杆菌素 松弛
10 EcoR I (BamH I)
ampr
松弛
改造策略： ➢去掉多余片段：缩小质粒分子量，提高外源DNA片段的装载量； ➢减少限制性酶切位点：缺失突变，限制性酶、核酸外切酶和连接酶...； ➢提供多克隆位点 ➢易识别的选择标记：通过质粒之间的重组导入； ➢安全性改造：质粒载体不能在细菌间随便转移； ➢增加辅助功能：表达载体。
（2）筛选标志不理想，合适的单一酶切位点少 ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。 杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。
唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。
天然质粒 相对分子质量 拷贝数 单一酶切位点 选择性标记 复制类型
pSC101 ColE1 RSF2124
5、质粒的可转移性
接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一 个细胞（接合作用）。甚至能使寄主染色体上的基因随其一 道转移到受体菌种。 非接合型质粒：不能再天然条件下独立地发生接合作用。 某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助，也能发生 DNA转移。由mob、tra基因顺式因子bom及其内部的转移缺 口位点nic决定。
4、质粒的不相容性 同种的或亲缘关系相近的两种质粒，含有相似复制子结构， 不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相 容性。不相容性的质粒组成不相容性群。
在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时，不相容的质 粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞 争，随机挑选，最终放大。
卸甲载体
切除致瘤基因的Ti质粒或Ri质粒，是构 建转化载体的受体质粒。
转化载体
最后用于目的基因导入植物细胞的载体，工程载体。 由中间表达载体和卸甲载体构建。
第二节 质粒载体
1、质粒（plasmid）概念 质粒(plasmid)：存在于细菌或真菌染色体外的小型环 状(线型质粒DNA分子——线虫、衣藻等)双链DNA分子 (酵母的“杀伤质粒”是RNA)，可自身复制和表达。
2.载体的种类
细菌质粒载体
病毒载体 按来座子载体 人工染色体载体、线粒体载体、叶绿体载体等
按功能分：
➢ 克隆载体：主要用来克隆和扩增DNA片段，能带动外 源基因在宿主细胞中复制扩增。
➢ 表达载体：除具有克隆载体的基本元件外，还具有转 录、翻译所必需的DNA元件，使外源基因在宿主细胞 中有效表达。
6、携带特殊的遗传标记
物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱
对重组DNA分子的筛选十分重要！
按用途可分为选择标记基因和筛选标记基因。 ➢ 选择标记：用于转化子的挑选； ➢ 筛选标记：用于重组子的挑选； ➢ 转化子：成功转化了载体的宿主细胞； ➢ 重组子：真正含有重组DNA的转化子。