第三章 基因载体的选择与构建.

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1.质粒的改造、构建与使用
删除非必需区，减小质粒的分子量，提高外源DNA 的装载量(一般来说，大于20kb的质粒很难导入受 体细胞)
加入遗传标记基因 在标记基因内引入具有多种限制酶识别及切割位点
的DNA序列，即多克隆位点(multiple cloning sites， MCS) 根据不同要求，插入特殊的基因表达调控序列
第三阶段：进一步完善载体的功能以满足基 因工程克隆中的不同要求
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（二）、载体的结构特点
至少有一个复制起点，至少可在一种生物体中有效 复制，稳定遗传
至少有一个限制酶识别位点，供外源DNA插入 至少有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA
分子是否进入宿主细胞 具有较小的分子量和较高的拷贝数 具有对受体细胞的可转移性, 提高载体导入受体细胞
有一个或几个质粒拷贝; (2)松弛型控制(relaxed control):
可自主复制，因此每个宿主细胞10~200个质粒拷 贝，此对分子克隆有利。
在宿主停止合成蛋白质时宿主染色体和严紧型质 粒都不复制，而松弛型质粒可继续复制。
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（二）重要的大肠杆菌质粒载体
pSC101 Col E1质粒载体 pBR322 pUC质粒载体 pGEM－3Z质粒 穿梭质粒载体
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理想的质粒载体，应具备以下几个条件：
(1) 能自主复制，即本身是复制子 (2) 具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此
位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能； (3) 在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供
易于检测的表型特征。 (4) 分子量要小，多拷贝，易于操作。
5、把pBR313的PstI位点除去，得到pBR318。 除去EcoR II，得到pBR320。pBR322基础上衍生出来的一系列质粒载体 pUC质粒载体的优点: ◇具有更小的分子量和更高的拷贝数
（2.7kb, 500~700 copies/cell） ◇适用于组织化学法检测重组体，一步实现对阳
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pGEM-T 多克隆位点的序列
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穿梭质粒载体
人工构建的具有两 种不同复制起点和 选择标记，可以在 两种不同的寄主细 胞中存活和复制的 质粒载体。
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4.大肠杆菌中的表达载体
表达载体应含有：
（1）强启动子 （2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD序 列。 （3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录 终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。
《基因工程原理》
第三章 基因载体(Vectors)的选 择与构建
山东理工大学生命科学学院
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第三章 基因载体的选择与构建
一 载体的一般特性 二 质粒载体 三 λ噬菌体载体 四 cos质粒（cosmid） 五 人造染色体载体（酵母人工染色体，细菌人工染
色体载体和噬菌体人工染色体载体）
7种内切酶的单一切点。 Hin d III、Bam H I和Sal I
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pSC101
EcoRI
pR6-5
大肠杆菌
Boyer 和Cohen的实验
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Col E1质粒载体
松弛型，多拷贝 1000～3000 copy 选择标记
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pBR322
特点： 多种抗药标记 分子量低：4363bp 高拷贝 多单酶切位点 不影响复制
四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质， 与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细 菌细胞。
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氨苄青霉素抗性基因（Ampr）
杀菌剂，Ampicillin可抑制细菌细胞膜 上参与细胞壁合成酶类的活性，干扰细胞分 裂，杀死细胞。
Ampr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞 周间质的酶，催化β-内酰胺环的水解，使氨 苄青霉素失活。
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葡萄糖苷酸酶基因（GUS gene）
β-葡萄糖苷酸酶可将X-Gluc（5-溴-4氯-3-吲哚 -β-D-半乳糖苷）降解为兰色产物
适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这 种基因
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Eucalyptus occidentalis （桉树）
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荧光素酶基因（luciferase Gene）
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（四）、遗传标记基因
1.标记基因的作用：
指示外源DNA分子（载体或重组分子）是 否进入宿主细胞
指示外源DNA分子是否插入载体分子形成 了重组子
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2.标记基因的种类： 抗性标记基因 营养标记基因 生化标记基因
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3.常用的遗传标记基因
四环素抗性基因（Tetr）
抑菌剂，Tetracycline可结合在核糖体30s 亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的 转位过程。抑制细胞蛋白质合成，细胞停止 生长。
杀菌剂，Kanamycin，Neomycin和G418均属脱 氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖 体上，导致mRNA发生错读。
来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使 这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。
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β-半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
◇ β-半乳糖苷酶基因编码1021个氨基酸 ◇ 其氨基末端称为α链，羧基末端称为β链 ◇ α链负责将β链装配为四聚体 ◇ 单独的β链不具酶活性，只有在α链的帮助下组装成
β4才具有酶活性——α-互补作用 ◇ 为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)
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β-半乳糖苷酶基因的优点
◇酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观
5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β-D-galactoside
◇LacZα和β链基因的分别表达
通常以 LacZα作为载体的遗传标记基因，而由宿主 细胞表达β链
原核载体：质粒(pBR322,pUC…） 噬菌体（λ，M13）等。
真核载体：动物病毒载体pLXSN等 BAC、YAC、PAC等。
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（一）、发展概况
第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质 粒的利用，如pSC101, ColE1, pCR, pBR313
第二阶段：增大载体容量，建立多克隆位点 区和新的遗传标记基因
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2.质粒的命名
(1) 人工组建的质粒
人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid） 的第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的 作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。
例：pXYp109；pSC101等
(2) 天然载体质粒
天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括号括起 来。如（C01E1）。
和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提 供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别 位于lacZ'基因中多克隆位点区的两侧(图)
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pGEM-T
pGEM用途多， 能在离体情况下合
成RNA、ssDNA。 含SP6和T7RNA聚
合酶的启动子，位 于β-半乳糖苷酶的 α-肽段的两测。
性克隆的鉴定 ◇具有多克隆位点区（MCS）
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pUC质粒载体
pBR322的复制起点 ampr，但不含酶切
位点 lacZ的启动子和编
码α-肽链的序列。 多克隆位点（MCS）
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pGEM系列载体 pGEM系列载体是一种与pUC系列十分类似的小
分子的质粒载体。 它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子
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（一）质粒一般特性
1. 质粒形状 质粒：环状质粒、线性质粒
DNA质粒、RNA质粒 Common plasmid vectors can carry up to 15kb
foreign DNA
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2.野生型质粒具有下列基本特性:
自主复制: 质粒DNA含有自己的复制起点(ori)以 及控制复制频率的基因,能够摆脱宿主染色体 DNA复制调控系统而进行自主复制,并在宿主细 胞产生不同的拷贝数
噬菌斑，即感染的细菌细胞被噬菌体裂解之 后留下的空斑。
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Life cycle:
◇ lytic cycle(裂解周期） ◇ lysogenic cycle（溶源周期）
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噬菌体
有的噬菌体（phage）基因组较大，如λ噬菌和T噬菌 体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。用 感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。
农杆菌质粒用p加Ti（Tumer inducing）或At （Agrobacterium tumefacions）表示，如pTiC58。
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3. 常用的质粒载体
pSC101(plasmid Stanley Cohen ) 严紧型、低拷贝，平均每
个细胞1～2个copy。 9.09kb 含有抗四环素基因(tetr)和
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pBR322： 它由三部分组成： 来自pSCl01的四环素抗
性基因Tetr 来自ColEl的衍生物
pMBl的松弛复制起点 ori 来自RSF2124的氨苄青 霉素抗性基因Ampr
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pBR322质粒载体的构建过程：
1、以pMB1为基础，引入Rldrd19质粒的Tn3易 位子。得到pMB3；
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三、 噬菌体载体
（一） 噬菌体的生物学特性 噬菌体英文名叫做
Bacteriophage（简称 phage）。 它的DNA分子除了复制起 点之外，还有编码外壳蛋 白质的基因。
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噬菌体最常见的是双链线性DNA。除此之外， 还发现有双链环形DNA、单链环形DNA、单 链线性DNA以及单链RNA等多种形式的噬菌 体。 有些噬菌体的DNA碱基并不是由标准的 A、T、G、C四种碱基组成。
2、pMB3通过EcoRI去掉无用片段，形成pMB8 质粒（2.6kb）；