第三章-基因工程载体
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第三章基因工程载体
16
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
17
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
6
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
7
(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
9
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
12
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
PO
lacZ
调控蛋白P
β-半乳糖苷酶 分解半乳糖
17
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i
PO
lacZ -
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段
β-半乳糖苷酶-
分解半乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
18
互补显色反应
19
(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供
6
单链切割 连接
线性DNA （L型）
开环DNA
（oc型）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （SC型）
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
7
(三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。
能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。
9
(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的 质粒带有一套与传递有关的基因。
(7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将 其去除。
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合 成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质 合成的严格控制。
(9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗 性等。
个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
12
根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复 制控制的质粒(stringent plasmid)；
基因工程-载体
cmlr
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
基因工程的载体
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称 氨苄青霉素 （Amp） 氯霉素 （Cm） 卡那霉素 （Kan） 链霉素 （Sm） 四环素 （Tet） 作用方式 抗性机理 一种青霉素的衍生物，通过干扰 bla抗性基因编码的一种周质酶，即β-内 细菌胞壁合成之末端反应，而杀 酰胺酶，可特异的切割amp的β-内酰胺 死生长细胞。 环，从而失去杀菌效力。 一种抑菌剂，通过同核糖体50S 亚基的结合作用，干扰细胞蛋白 质的合成，并阻止肽键的形成。 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异地使 氯霉素乙酰化而失活
λ噬菌体载体
结构特点: ①线性双链DNA分子 ②具非必需区(约1/3长度） ③两端具12个核苷酸单链互补粘性末端 ④可在E.coli中大量繁殖 ⑤可克隆15Kb左右的外源DNA
（2）质粒的基本特性
1) 2) 3) 4) 5) 自主复制性 不相容性 可扩增性 可转移性 携带遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传 标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需 的附加性状，包括：抗生素、抗抗生素、抗重金 属、产生细菌毒素等。对DNA重组分子的筛选具有 重要意义。
（3）质粒DNA的转移
质粒自主转移
导入
+
自主转移
+
无DNA转移
donor
H H
H
+
辅助转移
H
+
质粒的辅助转移
H
H
+
Notransfer
质粒的重组转移
R-重组DNA分子
重组
+
DNA 转移
R
+ R
（4）质粒的命名
人工组建的质粒 第一个字母是质粒的英文名字（Plasmid）的第一 个字符p, 用小写。后面有两个字母是大写，代表质 粒的发现者和实验室名称，再后面是质粒的编号。
《基因工程》第三章 载体2
Induction
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
Such as ultraviolet light
Cell division
Assembled or packaged Lysis of cell and release of mature phage particles
2.λ噬菌体作为克隆载体的依据
①λ噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。
β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配 为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前 者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都 存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个 部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之 为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为 标记基因。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并 产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发 光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与 FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可 使大肠杆菌菌落呈蓝色。
Polylinker or multiple cloning site [MCS]
pUC family
pUCm-T载体(pUCm-T Vector): 1 线性化的载体， 2 载体每条链的3’端带有 一个突出的T。
第三章 第一节 基因工程（基因表达载体的构建）
4．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C （图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列 操作与实验目的不符的是（ C ）
A．用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
三、目的基因及其表达产物的检测鉴定
1．检测与鉴定的内容、方法
阅读教材98~99页的内容，根据表格提示的项目填写表格中缺 少的内容。
检测水平
分子水 DNA 平的检 RNA
测 蛋白质 个体水平的检测
检测内容
方法
结果显示
1．检测与鉴定的内容、方法
检测水平
检测内容
方法
结果显示
检测转基因生物的染色体 DNA分子杂交法（基因探针
3．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全 能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。
4．大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但 又有所不同。大肠杆菌为原核生物，而酵母菌为真核生物（具有 多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质 时比大肠杆菌有优势。 有内质网和高尔基体
2．病毒感染法 用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞， 也能使目的基因导入动物细胞内。
（三）将目的基因导入微生物细胞 1．感受态细胞 经过适当的处理（如用Ca2+处理）后，细胞质膜对DNA的通透性会
发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为 感受态细胞。
2．过程
Ca2+处理微生物细胞
感受态细胞
基因工程原理与技术-3
pBV221
rrnB
制备RNA探针的载体
两条链RNA 探针的制备程序
简化外源蛋白纯化的载体(标签载体) pBAD/His
常用的标签： 多聚组氨酸残基、 结合麦芽糖蛋白、 谷胱甘肽-s-转移 酶。
亲和层析法纯 化外源蛋白。
pBAD/His的三种变体(3种读码框)
BglII site of the MCS.
表达载体
(根据受体细胞)
原核细胞表达载体 真核细胞表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的转运)
分泌型表达载体 非分泌型表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的组成)
融合型表达载体 非融合型表达载体
大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比)：①强启动
子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子。②SD序列； ③强终止子。如rrnB。
大多数)、双链线形 DNA、RNA(酵母的 杀伤质粒)。
提取的质粒有三 种构型：①闭合环形 DNA(超螺旋构型)， ②开环形DNA，③线 形DNA。
2、质粒的复制类型 严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝
松弛型：不严格受宿主控制，10~200拷贝
质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中 是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与 R1质粒正好相反。
起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制 的质粒载体。
如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载 体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动 物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物 细胞穿梭质粒载体。
例如，将λ噬菌体在EcoRI限制-修饰的宿主和EcoRI限制-修 饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了 EcoRI酶切位点的λ噬菌体。然后将突变体同野生型λ噬菌体 在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有1~2个 EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。
基因工程基因工程的载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体的基本功能
1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三章 基因工程的载体
作为基因工程载体必须具备的基本条件
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr 3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分 子进入细菌细胞。
第三章 基因工程的载体
载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体
•细菌质粒载体 •噬菌体λ衍生载体 •Cosmid载体 •Phagemid载体
•酵母质粒载体 •真核病毒载体 •Bacmid载体 •YAC载体
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr 抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β—内酰胺环的 水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
基因工程载体
第三章基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒（cosmid）载体基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。
（2）有选择性标记。
（3）有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA（cccDNA）②开环DNA（open circular,ocDNA）③线形DNA（linear,lDNA）（二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
Col质粒：细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
基因工程的操作单元——载体
居抗原，破伤风毒素，炭疽毒素，溶血毒素，苏云金芽孢杆菌 的杀虫晶体蛋白，植物冠瘿病（Ti质粒）和发根病（Ri质粒）。
云南大学
The catabolic plasmids that complete sequence has been determined
Plasmid Substrates Strain Size (bp) Catabolic genes References
云南大学
基因工程的操作单元——载体
1.
2.
3.
4.
一个理想的载体至少包括4个方面的条件： 具有对受体细胞的可转移性，提高载体进入受体细 胞的效率； 具有与特定受体细胞相互适应的复制位点或整合位 点，使得外源基因在宿主细胞中稳定遗传； 具有多种的单一核酸内切酶识别切割位点，有利于 外源基因的拼接插入； 具有合适的选择性标记，便于重组DNA分子的检测； 其中前两点即载体的可转移性与可复制性取决于它 与宿主细胞之间严格的亲缘关系，不同受体细胞只 能使用与之匹配的载体。
pOAD2
Nylon Flavobacterium K172 45519 nylA Microbiology oligomers nylBC 1995,141:2585 pNL1 Biphenyl,naphthalene Sphingomonas 184457 pbh, xyl, J. Bacteriol. m-xylene, p-cresol aromaticivorans F199 nah, pch 1999,181:1585 pADP-1 Atrazine Pseudomonas ADP 108845 atzA,atzB J. Bacteriol. atzC,atzDEF 2001,183:5684 pWWO Xylene,Toluene P. putida mt-2 116580 xyl Envi.. Microbiol. 2002,4:856 pAO1 Nicotine Arthrobacter 165137 ndh, 6hlno J. Bacteriol. nicotinovorans kdh, dhph 2003,185:1976 pCAR1 Carbazole P. resinovorans CA10 199035 carABCDEF J. Mol. Biol. antABC 2003,326:21 pBD2 Isopropylbenzene Rhodococcus 210205 ipbA1A2A3A4 J. Bacteriol. Erythropolis BD2 2003,185:5269 pUO1 Haloacetates Delfitia 67066 dehH1, dehH2 J. Bacteriol. Acidovorans B 2003,185:6741 pJP4 2,4-D Ralstonia 87688 tfdA, tfdB Envi..Microbiol. 3-chlorobenzoate eutropha JMP134 tfdCDEF 2004,6:655 pND6-1 naphthalene Pseudomonas ND6 101858 nah Gene 2004,336:231 pDTG1 naphthalene P. putida 83042 nah J. Mol. Biol. NCIB 9816-4 2004,341:753
云南大学
The catabolic plasmids that complete sequence has been determined
Plasmid Substrates Strain Size (bp) Catabolic genes References
云南大学
基因工程的操作单元——载体
1.
2.
3.
4.
一个理想的载体至少包括4个方面的条件： 具有对受体细胞的可转移性，提高载体进入受体细 胞的效率； 具有与特定受体细胞相互适应的复制位点或整合位 点，使得外源基因在宿主细胞中稳定遗传； 具有多种的单一核酸内切酶识别切割位点，有利于 外源基因的拼接插入； 具有合适的选择性标记，便于重组DNA分子的检测； 其中前两点即载体的可转移性与可复制性取决于它 与宿主细胞之间严格的亲缘关系，不同受体细胞只 能使用与之匹配的载体。
pOAD2
Nylon Flavobacterium K172 45519 nylA Microbiology oligomers nylBC 1995,141:2585 pNL1 Biphenyl,naphthalene Sphingomonas 184457 pbh, xyl, J. Bacteriol. m-xylene, p-cresol aromaticivorans F199 nah, pch 1999,181:1585 pADP-1 Atrazine Pseudomonas ADP 108845 atzA,atzB J. Bacteriol. atzC,atzDEF 2001,183:5684 pWWO Xylene,Toluene P. putida mt-2 116580 xyl Envi.. Microbiol. 2002,4:856 pAO1 Nicotine Arthrobacter 165137 ndh, 6hlno J. Bacteriol. nicotinovorans kdh, dhph 2003,185:1976 pCAR1 Carbazole P. resinovorans CA10 199035 carABCDEF J. Mol. Biol. antABC 2003,326:21 pBD2 Isopropylbenzene Rhodococcus 210205 ipbA1A2A3A4 J. Bacteriol. Erythropolis BD2 2003,185:5269 pUO1 Haloacetates Delfitia 67066 dehH1, dehH2 J. Bacteriol. Acidovorans B 2003,185:6741 pJP4 2,4-D Ralstonia 87688 tfdA, tfdB Envi..Microbiol. 3-chlorobenzoate eutropha JMP134 tfdCDEF 2004,6:655 pND6-1 naphthalene Pseudomonas ND6 101858 nah Gene 2004,336:231 pDTG1 naphthalene P. putida 83042 nah J. Mol. Biol. NCIB 9816-4 2004,341:753
基因工程-3-载体
完整的β-半乳糖苷酶 N端 C端
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
2.pUC系统
蓝白斑筛选
X-gal也是β-半乳糖苷酶的 一种底物，经降解后可生成 溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落 呈蓝色。
3.pGEM-T载体 经 Taq DNA 聚合 酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单 个 A
六、枯草杆菌分泌表达系统
三、质粒的类型
1、抗性质粒（Resistance （R）plasmids） 2、致育因子（Fertility （F）plasmids） 3、Col质粒 4、降解质粒(degradative plasmids)
5、侵入性质粒(virulence plasmids)
四、质粒载体的改造 ①去掉不必要的DNA区域 ②减少限制性内切酶酶切位点 ③加入易于检出的选择性标记 ④关于质粒安全性的改造 ⑤改造或增加基因表达的调控序列
优点：
①非致病的土壤微生物,不像大肠杆菌那样具 有热源性脂多糖; ②遗传学特性先进,很多噬菌体和质粒适合于 用作克隆载体; ③分泌蛋白能力强,当分泌蛋白跨过细胞膜后, 就被加工和直接释放到培养基中,这使得回收 和纯化目的蛋白较为简单; ④良好的发酵基础和生产技术。枯草杆菌在 工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶等
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称
氨苄青霉素 （Amp）
作用方式
一种青霉素的衍生物，通过干扰细菌胞 壁合成之末端反应，而杀死生长细胞。
抗性机理
bla抗性基因编码的一种周质酶，即 β-内酰胺酶，可特异的切割amp的 β-内酰胺环，从而失去杀菌效力。
氯霉素（Cm） 一种抑菌剂，通过同核糖体50S亚基的结 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异 合作用，干扰细胞蛋白质的合成，并阻 地使氯霉素乙酰化而失活 止肽键的形成。 卡那霉素 （Kan） 一种杀菌剂，通过同70S核糖体的结合作 kan抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移 用，导致mRNA发生错读。 酶，可对Kan进行修饰，从而阻止同 核糖体之间的相互作用。
基因工程第3章 基因克隆载体(1质粒载体)
诱导物：IPTG
• IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵 子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都 表达。从而互补。 • 但载体MCS上插入外源DNA后，不能 产生肽！
lacZ的肽互补
• -肽（ lacZ’ 基因编码）：-半乳糖苷酶N端 的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。 • lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 • pUC质粒载体上的lacZ’ 编码的肽与这个缺 失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形 成4聚体，又能分解Xgal，产生蓝色物质。
• pBR322质粒是按照标准的质粒载体命 名法则命名的。
• “p”表示它是一种质粒； • “BR”则是分别取自该质粒的两位主 要构建者F．Bo1ivar和 R．L．Rodriguez姓氏的头一个字母， • “322'’系指实验室编号，以与其他质 粒载体如pBR325，pBR327， pBR328等相区别。
合适的启动子
• 真核生物基因在原核生物中表达，改 用原核生物或病毒（噬菌体）基因的 启动子。
• 原核生物基因在真核生物中表达，仍 用原核生物基因的启动子。 • 选用外界条件诱导的启动子。
(1) 质粒克隆载体pBR322
• pBR322是经人 工改造的一种较 为理想的大肠杆 菌质粒载体，应 用广泛。现在已 经被许多更优良 的新型克隆载体 所替代。 (P40)
• （1）分子量大，拷贝数低
• 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子 长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点， Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
• ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。 • colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形 成“噬菌斑”。 • 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因 的内部。因此可通过插入失活筛选。但细 菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细 胞…….
第三章 基因克隆载体 基因工程课件
3.1.3.1 不同类型的质粒载体
• 高拷贝的质粒载体
克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因
• 低拷贝的质粒载体
有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰 寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白 质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编 码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因 等。
3.1 质粒克隆载体
是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体，主要用于建克隆载体相关的质粒性质：
3.1.1.1 质粒的构型 3.1.1.2 质粒DNA分子大小 3.1.1.3 质粒DNA分子的复制 3.1.1.4 质粒DNA的不亲和性 3.1.1.5 质粒迁移 3.1.1.6 显性质粒和隐蔽质粒
•
正选择的质粒载体
正向选择： 应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养 条件进行选择。这种质粒载体具有直接选 择记号 并可 赋予寄主细胞相应的表型。
Example：
质粒pKN80有来自Mu噬菌 体DNA的EcoRI-C的片 断，编码一种致死功能 的kil基因。 该质粒在Mu噬菌体的溶源 菌株中正常复制；在非 溶源菌株中是致死的。 在Hind III 或Hpa I位点插入 外源DNA片断后，会产 生具Ampr表型的Mu噬菌 体的非溶源的转化子菌 株。
第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含 有一个EcoR V酶切位点，一个四环素抗性 选择记号（Tetr ），插入外源片断后不影 响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷 贝数低，只具有一种抗菌素抗性基因，无 法使用插入失活技术选择重组分子。
（4363bp）
以Ampr和 Tetr为选择 性标记， 克隆位点 在这两个 选择性标 记的单酶 切位点上。 选择 AmprTets 或 AmpsTetr 的重组子。
第三章 基因工程载体
表达载体与克隆载体的区别
Hale Waihona Puke 强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因 有效的转录 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有 一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进 蛋白质翻译 在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终 止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳 定性
表达型载体（expression vector）
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子 即为非重组子
pUC系列的质粒载体
pBR322质粒的复制起点 Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制 性核酸内切酶的单一酶切位点 大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ‘基 因 位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点 (MCS ，multiple cloning sites)区，但它 并不破坏该基因的功能
4、
去除两 个PstI
pBR318 （6.3Kb)
酶切 体外重组 酶切
pBR313
EcoRII片 断去掉
pBR322 (4.3Kb)
pBR320 (2.8Kb)
四、常用质粒载体类型
1、克隆质粒载体
2、表达质粒载体
3、多功能质粒载体
4、穿梭质粒载体
1、克隆质粒载体
克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁
pBR322插入失活效应
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r Tcr
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克隆载体必须是安全的。
Pvu I Pst I
EcoR I
C la I
Pst I
H in d III
Bam H I
Apr
Tcr
pBR322
4363 bp
ROI ROP
Sal I Bal I
O rig in o f R ep licatio n H in d II
第一节 质粒克隆载体
一、 质粒的一般生物学特性
322的构建是质粒载体构建的 一个典范。
322的亲本质粒 2124，含有抗性基因 1，含有松弛型1的复制起点（） 101，含有抗性基因
大肠杆菌质粒克隆载体322及其衍生质粒 克隆载体的构建
1、在菌体内将R119质粒（沙门氏菌中R1质粒 的一种变异体）的易位子3（携带有抗性基因） 易位到1质粒上，构成一个较大的质粒3(13.3)。
3
黏性末端环化
导入大肠杆菌
8(2.6)*
2、从质粒101获得四环素抗 性基因（)。
获得9（5.3)
3、向9引入抗性基因。
2124的3体内易位至9 获得312 (10.2,具有抗 性基因和抗性基因）
312
313 (8.8，
除去 抗性基因中的位点）
*
4、
313
去除两 个
318 （6.3)
第三章 基因工程载体
基因克隆载体
要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生 物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生 物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具 就是运载体。
基因克隆载体(克隆载体)：通过不同途径能将 承载的外源片段(基因)带入受体细胞，并在其 中得以维持的分子。
载体的功能及特征
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒复制启动控制
控制复制起始因子与复制起始位点（）的结合
Cop
Rep
Pco
co
p
p
P/Orep re
ori
p
质粒的不亲和性
有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下， 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细 胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中 必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质 粒称为不亲和质粒。
一、发展概况 1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利
用，如101, 1, , 313和322 (1977, ) 2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多
克隆位点区和新的遗传标记基因。如系列载体。 3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆
中的不同要求，如M13系列载体，含T3，T7，6启动 子载体，表达型载体及各种探针型载体。
质粒载体
二、构建质粒克隆载体的基本策略
1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多 的拷贝。
2、含有尽可能多的克隆位点。 3、含有供选择克隆子的标记基因。 4、构建的质粒克隆载体分子尽可能小。 5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种
“元件”（小片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。
发现：细菌，偶见于链霉 菌和酵母
独立于染色体之外进行复 制和遗传,又依赖于宿主 编码的酶和蛋白质来进行 复制和转录。
比病毒还简单的亚细胞结 构，一旦离开寄主细胞则 无法繁殖。
一、质粒的一般生物学特性
质粒是细菌染色体外能够自主复制的 环形双链的分子
在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共 价闭合环分子（）的形式存在。
在体外理化因子作用下，质粒可以成 为开环分子（）或线形分子（）。
在变性条件下，质粒可成为单链分子 （）。
质粒分子大小1-100以上。
质粒的复制
质粒能利用寄主细胞的复制系统进行自主复制 复制方向性：纯单向性（）；纯双向性（F质粒）；既
有单向又有双向性（R6K）。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分
为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 – 数个 拷贝 松弛型复制控制的质粒 10 个 拷贝以上
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒复制启动控制
控制复制引物与模板的结合
RNA II 3’
5’
RNA I
ori
E.coli ColE1 plasmid
复制方向
5’
3’
rop
（+） Rop
如、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（1）在接合型质粒
的存在和协助下，也能发生转移，这个过程由 和 基因 决定
携带特殊的遗传标记
野生型的质粒上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对重组分子的筛选具有重要意义
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件
在克隆载体分子合适的位置有一至多个 克隆位点，供外源片段组入克隆载体分 子。
至少有一个复制起点，因而至少可在一 种生物体中自主复制。
至少应有一个遗传标记基因，以指示载 体或重组分子是否进入宿主细胞。
三、质粒克隆载体的构建
质粒克隆载体的设计和构建过程的原则 选择合适的出发质粒（亲本质粒）。 正确获得构建质粒克隆载体的元件。 组装合适的选择标记基因。 选用合适的启动子。 在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体
的构建过程力求简单。
大肠杆菌质粒克隆载体322及其衍生质粒 克隆载体的构建
以大肠杆菌的质粒为例： 1、1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 101、F、4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
质粒迁移
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到
另一个细胞（接合作用），如F、、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用
酶切
体外重组 322(4.3)
片断去掉 320(2.8) 酶切
四、常用质粒载体类型
1、克隆质粒载体 2、表达质粒载体 3、多功能质粒载体 4、穿载体是指专用于基因或片断无性繁殖的 质粒载体。
322质粒 系列的质粒载体
322质粒
具有较小的分子量，大小4363 可以克隆大到6的外源片断 具有两种选择标记，即和。 具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点 抗性基因内可被 I, I, I切开，抗性基因可被 I, 切开，
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4363 bp
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第一节 质粒克隆载体
一、 质粒的一般生物学特性
322的构建是质粒载体构建的 一个典范。
322的亲本质粒 2124，含有抗性基因 1，含有松弛型1的复制起点（） 101，含有抗性基因
大肠杆菌质粒克隆载体322及其衍生质粒 克隆载体的构建
1、在菌体内将R119质粒（沙门氏菌中R1质粒 的一种变异体）的易位子3（携带有抗性基因） 易位到1质粒上，构成一个较大的质粒3(13.3)。
3
黏性末端环化
导入大肠杆菌
8(2.6)*
2、从质粒101获得四环素抗 性基因（)。
获得9（5.3)
3、向9引入抗性基因。
2124的3体内易位至9 获得312 (10.2,具有抗 性基因和抗性基因）
312
313 (8.8，
除去 抗性基因中的位点）
*
4、
313
去除两 个
318 （6.3)
第三章 基因工程载体
基因克隆载体
要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生 物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生 物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具 就是运载体。
基因克隆载体(克隆载体)：通过不同途径能将 承载的外源片段(基因)带入受体细胞，并在其 中得以维持的分子。
载体的功能及特征
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒复制启动控制
控制复制起始因子与复制起始位点（）的结合
Cop
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P/Orep re
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质粒的不亲和性
有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下， 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细 胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中 必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质 粒称为不亲和质粒。
一、发展概况 1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利
用，如101, 1, , 313和322 (1977, ) 2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多
克隆位点区和新的遗传标记基因。如系列载体。 3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆
中的不同要求，如M13系列载体，含T3，T7，6启动 子载体，表达型载体及各种探针型载体。
质粒载体
二、构建质粒克隆载体的基本策略
1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多 的拷贝。
2、含有尽可能多的克隆位点。 3、含有供选择克隆子的标记基因。 4、构建的质粒克隆载体分子尽可能小。 5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种
“元件”（小片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。
发现：细菌，偶见于链霉 菌和酵母
独立于染色体之外进行复 制和遗传,又依赖于宿主 编码的酶和蛋白质来进行 复制和转录。
比病毒还简单的亚细胞结 构，一旦离开寄主细胞则 无法繁殖。
一、质粒的一般生物学特性
质粒是细菌染色体外能够自主复制的 环形双链的分子
在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共 价闭合环分子（）的形式存在。
在体外理化因子作用下，质粒可以成 为开环分子（）或线形分子（）。
在变性条件下，质粒可成为单链分子 （）。
质粒分子大小1-100以上。
质粒的复制
质粒能利用寄主细胞的复制系统进行自主复制 复制方向性：纯单向性（）；纯双向性（F质粒）；既
有单向又有双向性（R6K）。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分
为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 – 数个 拷贝 松弛型复制控制的质粒 10 个 拷贝以上
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒复制启动控制
控制复制引物与模板的结合
RNA II 3’
5’
RNA I
ori
E.coli ColE1 plasmid
复制方向
5’
3’
rop
（+） Rop
如、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（1）在接合型质粒
的存在和协助下，也能发生转移，这个过程由 和 基因 决定
携带特殊的遗传标记
野生型的质粒上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对重组分子的筛选具有重要意义
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件
在克隆载体分子合适的位置有一至多个 克隆位点，供外源片段组入克隆载体分 子。
至少有一个复制起点，因而至少可在一 种生物体中自主复制。
至少应有一个遗传标记基因，以指示载 体或重组分子是否进入宿主细胞。
三、质粒克隆载体的构建
质粒克隆载体的设计和构建过程的原则 选择合适的出发质粒（亲本质粒）。 正确获得构建质粒克隆载体的元件。 组装合适的选择标记基因。 选用合适的启动子。 在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体
的构建过程力求简单。
大肠杆菌质粒克隆载体322及其衍生质粒 克隆载体的构建
以大肠杆菌的质粒为例： 1、1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 101、F、4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
质粒迁移
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到
另一个细胞（接合作用），如F、、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用
酶切
体外重组 322(4.3)
片断去掉 320(2.8) 酶切
四、常用质粒载体类型
1、克隆质粒载体 2、表达质粒载体 3、多功能质粒载体 4、穿载体是指专用于基因或片断无性繁殖的 质粒载体。
322质粒 系列的质粒载体
322质粒
具有较小的分子量，大小4363 可以克隆大到6的外源片断 具有两种选择标记，即和。 具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点 抗性基因内可被 I, I, I切开，抗性基因可被 I, 切开，