猪瘟正向间接血凝试验

猪瘟、口蹄疫间接血凝操作方法

猪瘟、口蹄疫间接血凝操作方法

猪瘟间接血凝操作方法

一、试验材料

1、 6孔110°-120°微量血凝板。

2、 10-100微升可调微量移液器

3、塑料咀

4、猪瘟间接血凝抗原（猪瘟正向血凝诊断液），每瓶5毫升，可检测血清25-30头份。

5、阳性对照血清，每瓶2毫升；阴性对照血清每瓶2毫升

6、稀释液每瓶10毫升

7、待检血清每份0.2-0.5毫升（56℃水浴灭活30分钟）

二、操作步骤

1、检测前，应将冻干诊断液每瓶加稀释液5毫升浸泡7-10天后方可应用。

2、稀释待检血清：在血凝板上的第一孔――第六孔各加稀释液50ul加入第一孔，混匀后从中取出5 0ul加入第二孔，依此类推直至第六孔混匀后丢弃50ul，从第一孔――第六孔的血清稀释度依次为1：2、1：

4、1：8、1：16、1：32、1：64。

3、稀释阴性血清和阳性血清：在血凝板上的第11排第1孔加稀释液60ul，取阴性血清20ul混匀

后取出30ul丢弃。此孔即为阴性血清对照孔。

在血凝板上的第12排第1孔加稀释液70ul，第2孔――第7孔各加稀释液50ul 。吸取阳性血清1 0ul，加入第1孔混匀并从中取出50ul加入第2孔……直到第7孔混匀并丢弃50ul。该孔的阳性血清稀释

度则为1：512。

4、在血凝板上的第1排第8孔加稀释液50ul即为稀释液对照孔。

5、滴加抗原：第1排1－8孔和对照孔各加血凝抗原25ul立即置微量震荡器上震荡1分钟，或用手

摇匀。室温下静置1.5-2小时。

6、判定方法和标准：先观察阴性血清对照好和稀释液对照孔，红血球应全部沉入孔底，无凝集现象

（－）或呈阳性（+）的轻度凝集为合格；阳性血清对照应呈(+++)凝集为合格。

在以上3孔对照合格的情况下，观察待检血清各孔的凝集程度，以呈“++”凝集的待检血清最大稀释度为血凝效价（血凝价）。血清的血凝价达到1：16为免疫合格。

“－”表示红血球100％沉于孔底，完全不凝集

“+”表示约有25％的红血球发生凝集

“++”表示50％红血球出现凝集

“+++”表示75％红血球凝集

“++++”表示90-100％红血球凝集

7、注意事项

（1）勿用90°或130°血凝板，以免误判。

（2）污染严重或溶血严重的血清样品不宜检测。

（3）冻干血凝抗原，必须加稀释液浸泡7－10天，方可使用，否则易发生自凝现象。

（4）用过的血凝板，应及时冲洗干净，勿用毛刷或其它硬物刷洗板孔，以免影响孔内光洁度。

（5）使用血凝抗原时，必须充分摇匀，瓶底应无血球沉积。

（6）液体血凝抗原4-8℃贮存，有效期三年。

（7）如来不及判定结果或静置2小时结果不清晰，也可放置第二天判定。

（8）每次检测，只设阴性、阳性血清和稀释液对照各1孔。

（9）稀释不同的试验要素时，必须更换塑料咀。

（10）血凝板和塑料咀洗净后，自然干燥，可重复使用。

口蹄疫间接血凝试验操作方法

一、材料

1、 96孔110-120°V型医用血凝板

2、 10-100微升可调微量移液器

3、塑料咀

4、 O型口蹄疫血凝抗原（口蹄疫O型正向血凝诊断液），每瓶5ml，可检测25-30头份

5、阳性对照血清，每瓶2ml阴性对照血清每瓶2ml

6、稀释液，每瓶10ml

7、待检血清0.20.5ml（56℃水浴灭活30分钟）

二、操作步骤

1、检测样品前，应将冻干的血凝抗原，每瓶加稀释液5ml，摇匀后置4℃冰箱内静置710天。

2、稀释待检血清样品：在血凝板的第一排第一孔加稀释液70ul（微升），第2－7孔各加稀释液5

0ul。

取待检血清10ul，加入第一孔混匀，吸取50ul加入第二孔，混匀后并从中取出50ul加入第3孔……直至第7孔，并从中取出50ul丢弃，使第1排的第2－7孔，每孔的血清保持50ul，此时第1排第2孔的稀释度为1：16，第3孔为1：32，第4孔为1：64，第5孔为1：128，第6孔为1：256，第7孔为1：

512。

3、稀释阴性和阳性对照血清：在血凝板上的第11排第1孔加稀释液70ul，第2－4孔各加稀释液50ul，取阴性血清10ul加入第一孔混匀，并从中取出50ul加入第2孔混匀后取出50ul加入第3孔混匀后取出50ul加入第4孔，混匀后弃50ul该孔的稀释度为1：64。

在血凝板上的第12排第1孔加稀释液70ul，第2－7孔各加稀释液50ul。取阳性血清10ul，加入第1孔混匀后取50ul加入第2孔……依此类推，直至第7孔并丢弃50ul，该孔阳性血清稀释度为1：512。

4、在血凝板上的第1排第8孔加稀释液50ul，作为稀释液对照。

5、滴加血凝抗原：在滴1排的第2－8孔，第11排的第4孔和第12排的第6孔中各加口蹄疫O 型血凝抗原25ul，立即将血凝板放置于微量振荡器上，震荡1分钟或用手摇匀。将血凝板放置于白纸上，观察每孔内的红血球是否充分混匀，若血球均匀无沉积孔底，便可在室温静置1.5－2小时判定检测结果。

6、判定方法和标准：先观察阴性血清对照孔和稀释液孔，无凝集现象，红血球全部沉于孔底或呈“＋”凝集为合格。阳性血清孔，应出现“＋＋”或“＋＋＋”凝集为合格。最后观察待检血清孔，以呈现“＋＋”凝集的血清最大稀释度为该份样品的血凝价，例如：第2孔和第3孔出现“＋＋＋＋”凝集，第4孔、第5孔出现“＋＋＋”凝集，第6孔出现“＋＋”凝集，第7孔出现“＋”凝集，那么第6孔即为判定终点，该份血清的血

凝滴度（或血凝价）为1：256。

猪口蹄疫油佐剂灭活疫苗接种种猪的抗体水平达到1：128以上为免疫合格。

“－”表示红血球100％沉于孔底，完全不凝集

“＋”表示约有25％的红血球发生凝集

“＋＋”表示50％红血球出现凝集

“＋＋＋”表示75％红血球凝集