参照菌种的传代与保藏记录、确认表xin

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药品检验用菌种的传代和保藏(2021精选文档)

影响集菌培养效果的若干因素
温度渗透压氧气光 pH值和氧化还原电位培养基抗生素
验证纯培养的主要依据
1、用显微镜观察时，全部的生物个体是相似的，如果是细菌，对革兰氏染色反应应当是一致的。
2、将培养物制成悬液，重新倾注平板，或平板划线培养后，所形成的全部菌落的形态应该是相似的。如果是细菌，将重新形成的菌落各作穿刺培养，其培养特征应当是一致的。
琼脂斜面低温保藏法
适用细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏优点：简便、大多数微生物适用缺点：保藏期短；传代次数多；容易发
生变异及污染。生孢梭菌用硫乙醇酸盐培养基、乙型溶
血性链球菌及肺炎球菌用血肉汤（琼脂）培灭菌去水备用。获得需要保藏菌种的纯培养，将液体石蜡注入培养容器中，并完全覆盖培养基。
我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供
标准菌种的保藏形式
我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。
获取纯培养的工作环境
1、洁净工作室：环境洁净度10000级下的局部100级的单向流空气区域内，全过程必须无菌操作，防止微生物污染。
2、无菌隔离舱
获取纯培养的接种工具
1、接种环 2、接种针 3、接种铲 4、接种钩 5、其他玻璃器械
获取纯培养的其他器具
1、玻璃器皿：如各种规格培养皿。 2、微生物实验室常用的设备，如高压灭菌
纸表面干燥将形成的明胶片密封保藏
麸皮保藏法
我国历史悠久的微生物保藏法适于保藏根霉、曲霉、青霉、红曲霉等

菌种记录表格

工作用菌种
操作人
数量
编号
有效期
保存
方法
数量
编号
有效期
保存
方法
分离与纯化过程

附表3：《检定菌种使用登记台账》
记录名称
检定菌种保存、领用登记台账
代码
页次
1
共1页
收到日期
名称及编号
数量
接收人
移交人
领用日期
用途
数量
发放人
领用人
附表4：《检定菌种观察记录》
记录名称
检定菌种观察记录
代码
页次
1
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日期
冰箱温度（℃）
塞子是否松动
是否霉变
处理措施
观察人
附表5：《检定菌种鉴定记录》
记录名称
检定菌种鉴定记录
代码
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1
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菌种名称及编号
鉴定原因
开始鉴定日期
鉴定人
复核人
年月日
鉴定项目
菌落形态
革兰染色
显微镜下形态
典型生化反应特征
鉴定结论
日期：年月日
附表6：《检定菌种使用登记台账》
记录名称
检定菌种使用登记台账
代码
页次
1
共1页
领用日期
名称及编号
数量
使用人
制备菌悬液浓度
(CFU/ml)
用于检验的
产品批号
记录名称
废弃菌种（物品）销毁处理记录
代码
页次
1
共1页
日期
被处理菌种（物品）名称
销毁原因
处理方式
批准人
操作人
监督人
备注：废弃菌种要标明编号、数量（支）

菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程

菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程传代用菌种采用甘油冷冻管保存法。

将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合甘油并分装至冷冻管中，冷冻管标注菌种名称、代数、保存日期等信息，然后放置于-80℃冰箱中保存。

每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。

5.3.2.2液体石蜡保存法对于一些难以保存的菌种，采用液体石蜡保存法。

将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合液体石蜡并分装至玻璃瓶中，瓶口用铝箔密封，标注菌种名称、代数、保存日期等信息，保存温度为-70℃。

每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。

5.4菌种的传代传代用菌种每年进行一次复苏和传代。

复苏后，将菌种接种至适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，按照规定的传代代数制备传代用菌种，并及时更新菌种库存记录。

5.5菌种的使用使用菌种前，应先确认菌种的品质和纯度，并按照规定的传代代数制备工作用菌种。

使用后，应及时更新菌种库存记录，并进行相应的消毒处理。

5.6菌种的销毁菌种在使用过程中，如出现变异或污染等情况，应及时进行应灭活处理，并填写《菌种销毁记录表》，经主管部门审核同意后，进行销毁处理。

菌种库存中长期未使用的菌种，应定期进行清理和销毁处理。

菌复苏、复壮；Sabouraud葡萄糖琼脂培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮；青霉素-链霉素琼脂培养基：用于铜绿假单胞菌复苏、复壮。

5.4.1.1.3复苏步骤：1.取出保存好的菌种管，用接种针在酒精灯上消毒；2.将接种针在75%酒精中消毒，再用酒精棉球擦拭消毒；3.用接种针在相应的培养基上进行接种；4.置于适宜温度下孵育，待菌落出现后进行传代或进行实验。

5.4.1.2标准菌株的确认通过形态学、生理生化特性、分子生物学等方法进行鉴定，确认菌株的纯度和种属。

5.4.1.3标准菌株的传代将菌株从原始保存方式中转移到新的保存方式中，确保菌株的保存和传承。

传代次数不宜过多，一般不超过10代。

菌种记录表格

记录名称
检定菌种使用登记台账
代码
页次
1
共1页
领用日期
名称及编号
数量
使用人
制备菌悬液浓度
(CFU/ml)
用于检验的
产品批号
记录名称废弃菌种（物品）销源自处理记录代码页次1
共1页
日期
被处理菌种（物品）名称
销毁原因
处理方式
批准人
操作人
监督人
备注：废弃菌种要标明编号、数量（支）
附表7：《废弃菌种（物品）销毁记录
传代用菌种
工作用菌种
操作人
数量
编号
有效期
保存
方法
数量
编号
有效期
保存
方法
分离与纯化过程
纯度
检查结果
操作人：复核人：
附表3：《检定菌种使用登记台账》
记录名称
检定菌种保存、领用登记台账
代码
页次
1
共1页
收到日期
名称及编号
数量
接收人
移交人
领用日期
用途
数量
发放人
领用人
附表4：《检定菌种观察记录》
记录名称
检定菌种观察记录
附表1：《检定菌接收记录》
记录名称
检定菌种接收记录
代码
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1
共1页
名称及编号
数量
代数
来源
接收日期
接收人
检查情况
保存条件
附表2：《检定菌种传代、分离、保存记录》
记录名称
检定菌种传代、分离记录
代码
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1
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名称及编号
购进（领取）日期
年月日
来源
传代前菌种保存方法

菌种传代、接受和使用记录

菌种传代记录
菌种名称：
□Staphylococcus aureus /S.a/金黄色葡萄球菌□Escherichia coli /E.c/大肠埃希氏杆菌□Pseudomonas aeruginosa /P.a/铜绿假单胞菌□Bacillus subtilis /B.s/枯草芽孢杆
□Clostridium sporogenes /C.s/生孢梭菌□Candida albicans /C.a/白色念珠菌□Aspergillus niger /A.n/黑曲霉菌
菌种编号：
、、、
、、、
、、、
□传代菌种□工作菌种
保存条件：
传代所用菌种编号：
传代人/日期：
复核人/日期：
培养基/批号：
培养温度
□30-35℃
□20-25℃
培养时间：
□h
□d
传代数量：支
编号：
编号：
传代所用菌种编号：
传代人/日期：
复核人/日期：
培养基/批号：
培养温度
□30-35℃
□20-25℃
培养时间：
保存温度
有效期
复核人/日期
使用人/日期
用途
复核人/日期
备注
□ -20 ℃ □ 2-8 ℃
□ -20 ℃ □ 2-8 ℃
□ -20 ℃ □ 2-8 ℃
□ -20 ℃ □ 2-8 ℃
□ -20 ℃ □ 2-8 ℃
□ -20 ℃ □ 2-8 ℃
工作菌种接受和使用登记
菌种名称：
□Staphylococcus aureus/S.a/金黄色葡萄球菌□Escherichia coli/E.c/大肠埃希氏杆菌□Pseudomonas aeruginosa/P.a/铜绿假单胞菌□Bacillus subtilis/B.s/枯草芽孢杆

菌种的传代、保藏及菌液

3.关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将 3.关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。 4.右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口 4.右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。
培养基的选择
细菌一般用营养琼脂培养基，特别指出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基进行传代。真菌一般用改良马丁培养基。
菌种的传代
菌种的复苏菌种的确认菌种的接种菌种的保藏
菌种的复苏
《中国药典》2005版规定，所用标准菌种中国药典》2005版规定，所用标准菌种的传代次数不得超过5 的传代次数不得超过5代。从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直至到第3 后为第1代，直至到第3代为工作菌种。
霉菌各种菌落形态
白色念珠菌
形态特征： G＋、圆形或卵圆形、着色不均匀、在玉米培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成灰白色、表面光滑、带有浓重酵母气味的典型的类酵母菌落。培养稍久，菌落增大。在改良马丁培养基中呈沉淀生长。分离培养：快速显色培养基
白色念珠菌— 白色念珠菌—显色平板的形态
严格菌种的质量控制，确保菌种的质量严格菌种的质量控制，菌种的质量对检验至关重要，对实验式储备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种进行纯度和属性确认外，还应对每一次传代都进行确认的质量控制系统。因为微生物菌种从上一代传到下一代时，很可能发生污染或变异，因此每次传代中至少要对菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实验。

检定用菌种传代、贮存、接种操作细则

检定用菌种、传代、贮存、接种操作细则传代与接种操作步骤：1、先点燃酒精灯，在火焰旁的上部空间操作，烧灼接种环。

2、再将菌种管（即原有的菌种斜面培养基）与待接种的新鲜斜面培养基（接种管）持在左手拇指、食指与中指之间，要注意能清楚的观察到斜面，菌种管在前、接种管在后，应斜持试管显45℃角，使试管内斜面上，两试管口平齐，注意不要持成水平，以免底管凝聚小浸湿培养基表面。

3、用右手将两管棉塞转动，以便接种时易于拔取。

再灼烧接种环注意灼烧时，接种环应垂直或稍斜的在外焰上灼烧，外焰温度与内焰高，顶端的环必须烧红，以彻底灭菌，环以上进入试管部分也应充分通过火焰灭菌。

4、使用右手小指与无名指及无名指中指之间，在火焰旁分别拔下两只试管的棉塞、持住，将试管口通过火焰，以杀灭管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。

5、将灼烧过的接种环伸入菌种管，先接触无军生长的培养基快速冷却，若接触的培养基有熔印时则表明接种环未冷却，能烫死细胞。

待冷后，从斜面上挑取菌苔少许，在火焰旁边，迅速踌躇接种环伸入接种管，在管内斜面上划线接种。

划线时在斜面上应先由内向外划一直线后，再由内向外划曲线。

*注意事项：1、整个操作过程应迅速且在酒精灯上方操作，勿使菌苔沾至管壁或管口。

2、从菌种管取出少量菌种苔后接种环，切不可通过火焰，以免菌种被烧死，也不宜火焰太远。

（避免污染）3、接种完毕后，立即在火焰旁塞上棉塞，再将接种环灼烧灭菌放回原处，再把可能未塞紧的棉塞塞紧，即可置适宜温度培养。

4、操作过程中，若棉塞不慎触及火焰而着火，切忌用口吹，若是棉塞进试管塞内一端着火，可在刚刚着火时迅速塞入试管，因管内氧气不是会很快熄灭，若棉塞外着火，可用手捏熄，若棉烧坏不宜再用，可另取未接种斜面培养基的灭菌棉塞，代替塞上。

5、借重完毕，应做好记录。

菌种的分离鉴别操作细则目的：当菌种污染某菌时，可将菌种接种于平板培养基进行分离，再根据菌种形态，挑取典型纯菌落并鉴别制成菌种管。

分离方法及步骤：1、取已污染某菌的菌落管，左手拿着菌种管拧松棉塞。

2010版《中国药典》菌种的传代与保藏

如药品中的控制菌检查使用的阳性对照菌须防止因多次传代而使阳性对照菌的典型生物学特征发生变化及菌株的死亡，保证达到菌种长期正确的形态；
如药品微生物学检验过程中，检出的可疑致病菌须妥善保藏，以达到进一步鉴定的目的，保证用药安全。
二、菌种代号的意义
国内药品微生物检验所用的菌种代号是 CMCC（F）或 CMCC（B） CMCC —— 中国医学菌种保藏中心 B —— 代表细菌， F ——代表真菌。大肠杆菌 [CMCC (B) 44102] 乙型副伤寒沙门杆菌 [CMCC (B) 50094] 铜绿假单胞菌 [CMCC (B)10104] 金黄色葡萄球菌 [CMCC (B)26003] 生孢梭菌[CMCC(B)64941] 白色念珠菌[CMCC(F)98001]
沙门菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌生孢梭菌白色念珠菌
营养肉汤
营养肉汤营养肉汤营养肉汤
硫乙醇酸盐培养基
真菌琼脂斜面
真菌培养基
五、菌种保管
• 菌种保管应有专人负责，保存与加锁的冰箱中或特制的白铁箱中加锁置阴暗处，确保菌种安全。因工作变动时，必须做好交接工作。 • 菌种应有详细登记本，包括名称、分离日期、鉴定日期、鉴定者、主要鉴定性能，并注意记录使用、转移及销毁情况和原因。 • 各种菌种应按规定时间定期移种。一般每移种3次后作一次全面鉴定。注意菌种有无污染和变异，如发现污染和变异时，应及时更换。 • 购置菌种，应有介绍信。全部保存菌种应具备清单，并定期向部门负责人报告。
④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于 95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。 ⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面1 ㎝为宜。 ⑥制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。

《中国药典》菌种的传代与保藏

酵母菌
一般用麦芽汁琼脂或麦芽汁酵母膏琼脂
4~6℃
一般4~6个月
丝状真菌
一般用 PDA 琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等
4~6℃
精品课件
每4个月移植一次（每于推广；一
般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都适用。
缺点是——保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。
▪ 适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。
精品课件
液体石蜡对各类菌种保藏效果
菌
种菌株数
细菌
87
霉菌
586
酵母菌
400
放线菌
380
保存时间（年）
5 5 2 4
存活率（%）
20.9 83.6 88.9 91.3
精品课件
（3）特点：本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，
若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种。
精品课件
1.琼脂斜面低温保存法
▪ （1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3个月移种一次，继续进行保藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年 ~ 一年。有的甚至更长时间。
▪ （2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。
精品课件
大肠杆菌斜面斜面
金黄色葡萄球菌
精品课件
生孢梭菌白色念珠菌需气菌、厌气菌培养基
真菌培养基
精品课件
各类菌种保藏条件及时间