间接凝集反应

2.致敏 2.致敏
致敏用的抗原或抗体要求纯度高，并保持 致敏用的抗原或抗体要求纯度高， 良好的免疫活性。 良好的免疫活性。 用蛋白质致敏红细胞的方法有直接法和间 接法。直接法只须在低pH，低离子浓度下， 接法。直接法只须在低pH，低离子浓度下， 用醛化红细胞直接吸附即可。 用醛化红细胞直接吸附即可。间接法则需 用偶联剂将蛋白质结合到红细胞上。 用偶联剂将蛋白质结合到红细胞上。常用 偶联剂为双偶氮联苯胺和氯化铬。 偶联剂为双偶氮联苯胺和氯化铬。
一、载体的种类及处理方法
常用载体有：红细胞（ 型人红细胞， 常用载体有：红细胞（O型人红细胞，绵羊 红细胞）、聚苯乙烯胶乳颗粒、明胶颗粒、 ）、聚苯乙烯胶乳颗粒 红细胞）、聚苯乙烯胶乳颗粒、明胶颗粒、 离子交换树脂、活性炭、火棉胶等。 离子交换树脂、活性炭、火棉胶等。 处理方法：颗粒表面的处理（醛化、鞣化、 处理方法：颗粒表面的处理（醛化、鞣化、 化学处理） 化学处理）
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（二）抗体的检测
可用于检测细菌、病毒、 可用于检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产 生的抗体。 生的抗体。 例如间接血凝试验或明胶颗粒凝集试验用于 检测抗人免疫缺陷病毒（HIV）抗体以诊断 检测抗人免疫缺陷病毒（HIV） 艾滋病、胶乳凝集试验用于检测抗溶血素O 艾滋病、胶乳凝集试验用于检测抗溶血素O 也有用于检测自身免疫性疾病的抗体， 等。也有用于检测自身免疫性疾病的抗体， 例如类风湿因子胶乳凝集试验、 DNA抗体 例如类风湿因子胶乳凝集试验、抗DNA抗体 和抗甲状腺球蛋白抗体的间接血凝试验等。 和抗甲状腺球蛋白抗体的间接血凝试验等。
间接凝集抑制反应原理示意图
4．协同凝集反应
协同凝集反应与间接凝集反应的原理相类似， 协同凝集反应与间接凝集反应的原理相类似， 但所用载体既非天然的红细胞， 但所用载体既非天然的红细胞，也非人工合 成的聚合物颗粒，而是一种金黄色葡萄球菌。 成的聚合物颗粒，而是一种金黄色葡萄球菌。 它的菌体细胞壁中含有A蛋白SPA具有与 它的菌体细胞壁中含有A蛋白SPA具有与 IgG的Fc段结合的特性 IgG的Fc段结合的特性，因此当这种葡萄球 段结合的特性， 菌与IgG抗体连接时 抗体连接时， 菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗 粒载体。如与相应抗原接触， 粒载体。如与相应抗原接触，即出现反向间 接凝集反应。 接凝集反应。协同凝集反应也适用于细菌的 直接检测。 直接检测。
醛化红细胞具有较强的吸附蛋白质抗原或 抗体的能力， 抗体的能力，血凝反应的效果基本上与新 鲜红细胞相似。 鲜红细胞相似。如用两种不同醛类处理效 果更佳。也可先用戊二醛，再用鞣酸处理。 果更佳。也可先用戊二醛，再用鞣酸处理。 醛化红细胞能耐60℃加热， 醛化红细胞能耐60℃加热，并可反复冻融 不破碎， 可保存3 个月， 不破碎，在4℃可保存3～6个月，在－ 20℃可保存一年以上。 20℃可保存一年以上。
第四节 自身红细胞凝集试验
自身红细胞凝集试验（autologous red 自身红细胞凝集试验（ cell agglutination assay）与一般间接 assay） 血凝试验不同之处为反应中的红细胞是未经 致敏的受检者新鲜红细胞。 致敏的受检者新鲜红细胞。主要试剂材料为 抗人O型红细胞的单克隆抗体， 抗人O型红细胞的单克隆抗体，这种抗体能 与不论何种血型的红细胞结合， 与不论何种血型的红细胞结合，但不引起凝 集反应。 集反应。这种抗体与另一特异性抗体连接成 的双功能抗体可用于检测标本中的抗原； 的双功能抗体可用于检测标本中的抗原；如 与特异性抗原连接， 与特异性抗原连接，则可用于检测标本中的 抗体。 抗体。 反应中的标本为受检者的全血。 反应中的标本为受检者的全血。
二、间接血凝试验
血凝试验是红细胞凝集试验的简称。 血凝试验是红细胞凝集试验的简称。间接 血凝试验是以红细胞作为载体的间接凝集 试验，在临床检验中应用广泛， 试验，在临床检验中应用广泛，其操作过 程如下： 程如下：
1.载体 1.载体
红细胞是大小均一的载体颗粒，最常用的为绵羊、 红细胞是大小均一的载体颗粒，最常用的为绵羊、 家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞。 家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞。新鲜红细胞能 吸附多糖类抗原， 吸附多糖类抗原，但吸附蛋白质抗原或抗体的能力 较差。致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、 较差。致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、 溶血和污染，只能使用2 溶血和污染，只能使用2～3天。为此一般在致敏 前先将红细胞醛化，可长期保存而不溶血。 前先将红细胞醛化，可长期保存而不溶血。 常用的醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。 常用的醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。红细胞经 醛化后体积略有增大，两面突起呈圆盘状。 醛化后体积略有增大，两面突起呈圆盘状。
间接凝集反应
信阳职业技术学院 药学与检验系
间接凝集反应
将可溶性抗原（或抗体） 将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大 小的颗粒性载体的表面， 小的颗粒性载体的表面，然后与相应抗体 或抗原）作用， （或抗原）作用，在适宜的电解质存在的 条件下，出现特异性凝集现象， 条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝 集反应或被动凝集反应。
直接Coombs试验 （一）直接Coombs试验
将含球蛋白的试剂直接加到红细胞表面结 合抗体的细胞悬液中， 合抗体的细胞悬液中，即可见细胞凝集可 用玻片法定性测定， 用玻片法定性测定，也可用试管法作半定 量分析。常用于新生儿溶血症、 量分析。常用于新生儿溶血症、自身免疫 性溶血症、 性溶血症、特发性自身免疫性贫血和医源 性溶血性疾病等的检测。 性溶血性疾病等的检测。
自身红细胞凝集试验原理示意图
自身红细胞凝集试验的特点是受检标本为 全血，不需分离血清， 全血，不需分离血清，采指血或耳垂血进 行试验，受检者即刻可知检测结果。 行试验，受检者即刻可知检测结果。此试 验已成功地用于抗HIV抗体的检测 抗体的检测。 验已成功地用于抗HIV抗体的检测。也有 检测HBsAg的试剂供应 的试剂供应， 检测HBsAg的试剂供应，其敏感度与间接 血凝试验相仿。 血凝试验相仿。
直接Coombs试验 直接Coombs试验
间接Coombs试验 （二）间接Coombs试验
用以检测游离的血清中的不完全抗体。 用以检测游离的血清中的不完全抗体。将 受检血清和具有待测不完全抗体相应抗原 性的红细胞相结合。 性的红细胞相结合。再加入抗球蛋白抗体 就可出现可见的红细胞凝集（ 15就可出现可见的红细胞凝集（图15-7）。 此试验多用于检测母体Rh（ 抗体， 此试验多用于检测母体Rh（D）抗体，以 便及早发现和避免新生儿溶血症的发生。 便及早发现和避免新生儿溶血症的发生。 亦可对红细胞不相容的输血所产生的血型 抗体进行检测。 抗体进行检测。
3.血凝试验 3.血凝试验
可在微量滴定板或试管中进行，将标本倍比稀释， 可在微量滴定板或试管中进行，将标本倍比稀释， 一般为1:64，同时设不含标本的稀释液对照孔。 一般为1:64，同时设不含标本的稀释液对照孔。 在含稀释标本1滴的板孔（或试管） 在含稀释标本1滴的板孔（或试管）中，加入 0.5％致敏红细胞悬液1 0.5％致敏红细胞悬液1滴，充分混匀，置室温 充分混匀， 1～2小时，即可观察结果。凡红细胞沉积于孔 小时，即可观察结果。 集中呈一圆点的为不凝集（ ）。如红细胞 底，集中呈一圆点的为不凝集（—）。如红细胞 凝集，则分布于孔底周围。 凝集，则分布于孔底周围。根据红细胞凝集的程 度判断阳性反应的强弱（ 15- ），以＋＋凝 度判断阳性反应的强弱（图15-4），以＋＋凝 集的孔为滴度终点。 集的孔为滴度终点。
血凝反应强度示意图
三、胶乳凝集试验
胶乳凝集试验也是一种间接凝集试验， 胶乳凝集试验也是一种间接凝集试验，所用 的载体颗粒为聚苯乙烯胶乳， 的载体颗粒为聚苯乙烯胶乳，是一种直径约 0.8µm大小的圆形颗粒 带有负电荷， 大小的圆形颗粒， 为0.8µm大小的圆形颗粒，带有负电荷， 可物理性吸附蛋白分子，但这种结合牢固性 可物理性吸附蛋白分子， 也可制备成具有化学活性基团的颗粒， 差。也可制备成具有化学活性基团的颗粒， 如带有羧基的羧化聚苯乙烯胶乳等， 如带有羧基的羧化聚苯乙烯胶乳等，抗原或 抗体以共价键交联在胶乳表面。 抗体以共价键交联在胶乳表面。化学交联一 般通过缩合剂碳化二亚胺将胶乳上的羧基与 被交联物上的氨基缩合在一起。 被交联物上的氨基缩合在一起。这种用交联 致敏的胶乳试剂性能稳定，保存期长。 致敏的胶乳试剂性能稳定，保存期长。
3．间接凝集抑制反应
诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体和相应的抗体， 诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体和相应的抗体， 用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。 用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。 检测方法为将标本先与抗体试剂作用， 检测方法为将标本先与抗体试剂作用，然后再加 入致敏的载体，若出现凝集现象， 入致敏的载体，若出现凝集现象，说明标本中不 存在相同抗原，抗体试剂未被结合， 存在相同抗原，抗体试剂未被结合，因此仍与载 体上的抗原起作用。如标本中存在相同抗原， 体上的抗原起作用。如标本中存在相同抗原，则 凝集反应被抑制。 凝集反应被抑制。
二、间接凝集反应的类型： 间接凝集反应的类型：
1.（正向间接凝集反应） 1.（正向间接凝集反应） 2. 反向间接凝集反应 3. 间接凝集抑制反应 4. 协同凝集反应
1．（正向）间接凝集反应 ．（正向） 正向
用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体 15（图15-1）。
2．反向间接凝集反应
用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相 应抗原。 应抗原。
四、间接凝集反应的应用
间接凝集反应具有快速、敏感、操作简便、 间接凝集反应具有快速、敏感、操作简便、 无需特殊的实验设备等特点， 无需特殊的实验设备等特点，而且能用于 抗原或抗体的测定， 抗原或抗体的测定，因此在临床检验中广 为应用。 为应用。
（一）抗原的检测
反向间接凝集试验可用于检测病原体的可 溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。 溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。 间接凝集反应的敏感度虽较沉淀反应高， 间接凝集反应的敏感度虽较沉淀反应高， 但低于新发展的各种标记免疫测定。 但低于新发展的各种标记免疫测定。 例如检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg） 例如检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg） 的间接血凝试验敏感度一般在2 的间接血凝试验敏感度一般在2～ 5ng/ml，对献血员的筛检已不符合要求。 5ng/ml，对献血员的筛检已不符合要求。
间接Coombs试验 间接Coombs试验
第五节 抗球蛋白参与的血凝试验
抗球蛋白参与的血凝试验由Coombs于1945年 抗球蛋白参与的血凝试验由Coombs于1945年 建立，故又称为Coombs试验 试验， 建立，故又称为Coombs试验，是检测抗红细胞 不完全抗体的一种很有用的方法。 不完全抗体的一种很有用的方法。所谓不完全抗 多半是7S的IgG类抗体 类抗体， 体，多半是7S的IgG类抗体，能与相应的抗原牢 固结合，但在一般条件下不出现可见反应。 固结合，但在一般条件下不出现可见反应。 Coombs利用抗球蛋白抗体作为第二抗体 Coombs利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接 利用抗球蛋白抗体作为第二抗体， 与红细胞表面抗原结合的特异抗体， 与红细胞表面抗原结合的特异抗体，使红细胞凝 集。 经常用作试验的有两类方法。 经常用作试验的有两类方法。