第一节凝集反应

第一节凝集反应

目的和原理

颗粒性抗原与相应抗体在适当条件下发生友应，出现肉眼可见的凝集小块，称为直接凝集反应。在操作方法上有玻片法和试管法两种。

本试验以细菌与其相应抗体反应为例，掌握玻片法和试管法凝集试验的原理，熟悉其方法和临床意义。

一、玻片凝集试验

器材和试剂

1·标本任一常见细菌的平板或斜面培养物。

2·试剂与细菌对应的诊断血清(可用生理盐水作适当稀释以免发生前带现象)、生理盐水等。

3·器材载玻片、接种环等。

步骤和方法

1·于洁净载玻片的一端加生理盐水一滴，另一端加诊断血清一滴。

2·用接种环挑取细菌，分别涂于生理盐水和待检血清中，充分混匀。

3．室温下静置数分钟观察结果。

结果和评价

生理盐水对照不发生凝集，为均匀混浊的乳状液。在诊断血清中，细菌与相应抗体反应会出现肉眼可见的凝集块，为阳性结果。如与对照相同则为阴性。

本方法为定性试验，敏感性较低。但操作简便，反应迅速，目前仍然是细菌分型鉴定和ABO血型鉴定的常规实验。

二、试管凝集试验

器材与试剂

1．标本待检血清。

2·试剂伤寒沙门菌H诊断菌液(7×108／m1)、抗伤寒沙门菌H抗血清(用生理盐水做l：10稀释)、生理盐水。

3·器材恒温水浴箱、试管架、试管、吸管等。

步骤和方法-

操作程序和加入成分——见表1

1．取洁净试管8支，排列于试管架上，依次编号并做好标记。

2·向各试管中均加人生理盐水0．5ml。

3·吸取1:10稀释的抗伤寒沙门菌H抗血清0．5ml，加入第一管中，充分混合,吸出0．5ml 放人第二管，混合后取出0·5ml于第三管中……，如此直至第七管，混匀后吸出0．5ml 弃去。第八管不加血清，为生理盐水对照。至此第1~~'7管的血清稀释度为：1：20、1 ：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280。这种稀释方法称为连续倍比(2倍)稀释法，是免疫学试验中常用的一种稀释方法。

4·向每管加入诊断菌液0·5ml，此时每管的液体总量为1．0ml，血清稀释度又增加1倍。

5·摇匀置37℃ 2—4h，取出置4℃或室湿过夜后观察结果。

管号 1 2 3 4 5 6 7 8(对照)

诊断菌液0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

终稀释度1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 —表1 试管凝集操作程序（单位：ml）

结果和评价

判断凝集试验的结果，要有良好的光源和黑暗的背景，先不振摇，观察管底凝集物和上清的浊度。然后轻轻摇动试管，注意观察凝集颗粒的松软度、大小、均匀度等性状及液体的混浊程度。

1·盐水对照管应无凝集现象，轻轻摇动试管，细菌分散均匀混浊。

2·伤寒沙门菌O抗原凝集物呈颗粒状沉于管底，轻摇时不易散开；H抗原凝集物呈絮状，疏松而大块地沉于管底，轻摇易离散。凝集程度通常以“+”表示强弱。

“4+”很强，细菌全部凝集，凝块全沉于管底，液体澄清。

“3+”强，细菌大部分凝集，液体稍混浊。

“2+”中等强度，细菌部分凝集，液体较混浊。

“+”弱，仅少量细菌凝集，液体混浊。

“一”不凝集，液体混浊度与对照管相同。‘

3·只要待测血清管出现“2+”以上的反应现象，就可判为反应阳性；以出现“2+”凝集的最大血清稀释度为待检血清的抗体效价。、

4·本试验是一经典的定量凝集试验，敏感性不高，但操作方法简单，至今仍在使用。

临床意义

1．主要用于鉴定细菌的种和型。

2．ABO血型鉴定。

第二节沉淀反应

三、凝胶双扩散试验

目的和原理

将对应的抗原与抗体放在琼脂凝胶板中的相应孔内，可各自向凝胶中自由扩散。当二者相遇时发生特异性反应，在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线。根据抗原与抗体的性质、纯度和比例的不同，沉淀线的形状、位置和数量不一。

要求掌握试验原理、方法和结果分析，熟悉其临床意义。

器材和试剂

1．试验标本待检血清、人IgG血清。

2．主要试剂羊抗人IgG诊断血清、15g／L盐水琼脂等。

3．主要器材载玻片、吸管、打孔器、湿盒、微量加样器等。

步骤和方法

1，浇板用粗孔吸管吸取熔化的1.5%盐水琼脂4.5ml,浇注于普通洁净载玻片上，要均

匀、平整、无气泡、布满整个玻片。

2．打孔待琼脂凝固后(室温约需15～20min)，用直径3mm的打孔器打孔，使孔间距为4～5mm。临床常用的孔型为梅花形，中间为抗体孔，四周等距排列6个抗原孔。

3．加样用微量加样器向中央孔加入抗体(人IgG诊断血清)，向周围孔加入待测抗原，其中第1~5孔加入阳性对照血清（羊抗人IgG诊断血清按1：2、1：4、1：8、1：16、1：32倍数稀释），第6孔分别加入待检血清。如用于检测抗体特异性时，中央孔加抗血清，四周孔加入不同的有关抗原；如进行抗体效价滴定时，则在中央孔加入抗原，四周孔加不同稀释度的抗血清。

4．扩散将加好样的琼脂板放人湿盒中（内有5%的石炭酸湿纱布)，置室温或37℃1～2d，于24h和48h各观察和记录结果一次。

结果和评价

如果凝胶中出现白色沉淀线，说明抗原与抗体相对应。若抗原与抗体只含单一的对应成分，则形成一条沉淀线；若含多种对应成分，可形成多条沉淀线。沉淀线的位置因抗原和抗体的分子量、浓度比例、扩散速度等因素的不同而异。另外，若相邻抗原浓度相等，可出现对称相融的沉淀线；若不等，沉淀线移向低浓度一边。

在梅花孔型中，若相邻两条沉淀线完全融合，说明两孔内抗原完全相同，若相邻沉淀线部分融合，说明两抗原部分相同；若相邻沉淀线发生交叉，说明两抗原完全不同。

阳性结果多在24h以内出现，48h不出现沉淀线可判为阴性结果。放置过久可使沉淀线消失。

此方法简便易行，结果稳定可靠；但灵敏度低，试验所需时间长，且只能定性，不能定量，仅适用于大量普查项目。

四、对流免疫电泳

目的和原理

在偏碱性的缓冲环境和适当的直流电场中，大部分抗原带有较多的负电荷，向正极移动；而抗体(尤其是IgG)在同样的环境中带负电荷较少，加上凝胶内较强的电渗作用，故抗体向阴极移动。在一定时间内(约30～90min)，移动的抗原和相应抗体在两孔间相遇并发生反应，在浓度比例适当时形成沉淀线：

本实验以测定血清中AFP为例，要求掌握实验原理、操作过程和结果分析；熟悉其临床应用及意义。

器材和试剂

1．试验标本阴性血清、人IgG血清。

2．主要试剂羊抗人IgG诊断血清、pH8．6 0．05mol／L巴比妥缓冲液、15g ／L琼脂巴比妥溶液。

3．主要器材电泳槽、电泳仪、孔型模板、打孔器、载玻片、吸管、微量加样器、吸球、滤纸和纱布条等。一

步骤和方法

1．配制试剂按本书后的附录配制pH8．6 O．05mol／L巴比妥缓冲液和15g／L琼脂巴比妥液并将后者加热熔化。

2．制板用粗孔吸管吸取已熔化好的巴比妥琼脂4．5ml，加到洁净载玻片上浇制成琼脂板。

3．打孔待琼脂凝固后成对打孔，孔径为3mm，孔距为10mm。

4．加样（无需稀释）做好抗原（阴性血清、人IgG血清）和抗体（羊抗人