第一节凝集反应
凝集性试验
第十章凝集性试验学习要点：凝集试验的概念、原理、分类，以及常用的凝集试验类型。
沉淀试验的概念、原理、分类，以及常用的沉淀试验类由于所用抗原的性状不同，出现的现象也不同：1、细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等不溶性颗粒抗原,当与相应抗体结合，抗原与抗体结合形成凝集团块，即(agglutination)。
2、病毒、蛋白质等可溶性抗原与抗体结合，在两者比例合适时,可形成较大的不溶性免疫复合物，在反应体系中出现不透淀反应(precipitation reaction)。
第一节凝集试验（agglutination test）细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等不溶性的颗粒抗原,当与相应抗体结合，在有电解质存在时,抗原与抗体结合形凝集试验。
凝集试验中的抗原称为凝集原（agglutinogen），抗体称为凝集素（agglutinin）一、凝集试验的一般原理通常，细菌和红细胞等颗粒性抗原在悬液中带弱负电荷,周围吸引一层与之牢固结合的正离子，外面又排列一层松散的负子层，使颗粒相互排斥。
当特异抗体与相应抗原颗粒互补结合时，抗体的交联作用克服了抗原颗粒表面的电位，而使颗粒聚集在一起。
二、凝集试验的发生分两阶段1、抗原抗体的特异结合；2、在电解质的参与下，出现可见的凝集颗粒。
三、凝集试验的用途凝集试验方法简便，敏感度高，因而在临床检验中被广泛应用。
1、可用于定性的检测，即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性。
2、也可进行定量检测，即将标本作一系列倍比稀释后进行反应，以出现阳性反应的最高稀释度作为滴度。
四、凝集试验的分类1、直接凝集试验（direct agglutination）细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。
直接凝集试验分为：玻板凝集试验和试管凝集试验。
（1）玻板凝集试验：为定性试验方法①用已知抗体作为诊断血清、与待检颗粒抗原悬液各加一滴在玻板上，混匀；②数分钟后即可用肉眼观察凝集结果：出现颗粒凝集的为阳性反应此法简便、快速，适用于：细菌分离株的鉴定与分型；红细胞ABO血型的鉴定。
凝集反应和沉淀反应
自身红细胞凝集试验
RBC为未经致敏 的受检者新鲜红 细胞，试剂：抗 人O型红细胞的 单克隆抗体
临床应用： HIV检测 HBV检测
22
四、胶乳凝集试验
致 敏 于 胶 乳 颗 粒
23
24
五、明胶凝集试验
将病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色明 胶颗粒上，当致敏颗粒与样品血清作用 时，若血清含有抗病毒抗体则可形成肉 眼可见的粉红色凝集
抗体球蛋白
带负电荷较少，籍 ＋
电渗作用向负极泳
动
43
对流免疫电泳
结果分析： ✓ 无沉淀线出现则表明无相
应的抗原。 ✓ 沉淀线位于抗原抗体孔中
间，说明两者比例较适合 。 ✓ 沉淀线偏向抗原孔一方， 表示抗体浓度＞抗原，反 之，则是抗体浓度＜抗原 浓度。
44
二、火箭免疫电泳
+
Ab
-
单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术 注：只能测定ug/ml以上的含量
反应特点：
IgM 的作用比IgG大数百倍 IgG与抗原结合后，常不出现凝集反应，称不完全抗 体
5
可见反应形成
6
第二节 直接凝集反应和间接凝集反应
一、直接凝集反应(direct agglutination)： 颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作用
下，出现肉眼可见的凝集现象
常用的凝集试验有玻片法和试管法
25
第三节 抗球蛋白参与的血凝试验
抗球蛋白试验是 抗球蛋白参与的 间接血凝试验， 又称Coombs试验
直接Coombs试验 间接Coombs试验
26
（一）直接Coombs试验
抗球蛋白抗体
全血操作
检测红细胞上不完全抗体
应用：检测新生儿溶血症、自身免疫性溶血症、特发性自
凝集反应、沉淀反应
当抗原与相应抗体结合时，抗体的交联作 用克服了抗原颗粒表面的Z电位，而使颗粒 相互靠拢，聚集在一起。 当抗体的分子太少或分子量小，不能克服 相当厚度的离子云层时，则不能使颗粒聚 集。在凝集反应中IgM的作用远大于IgG。 为促使凝集现象的出现，可采取以下措施： 1、增加蛋白质和电解质，缩短颗粒间的距 离；2、增加溶液的黏稠度；3、用胰酶和 神经氨酸酶处理；4：以离心的方式克服颗 粒间的排斥力。
第五章
凝集反应
颗粒性抗原与特异性抗原结合后，在适当 的电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现 象，称为凝集反应。 可溶性抗原或抗体与载体颗粒结合形成致 敏颗粒后，与相应的抗原或抗体结合，也 能发生凝集反应。
1
第一节 凝集反应的特点 凝集反应的发生分为两个阶段：1、抗原抗 体的特异性结合阶段；2、出现肉眼可见的 凝集现象。 颗粒性抗原在悬液中带负电荷，周围吸引 一层与之牢固结合的正离子，外面又排列 一层松散的负离子，构成一个双层电子云。 在松散层内界和外界间的电位差形成Z电位。 溶液中负离子强度越大，Z电位也越大，Z 电位使颗粒间互相排斥。
示意图
标准品抗原浓度测定
抗原浓度 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找
不同病人抗原浓度测定
相应抗原浓度
35
单向扩散试验 （平板法）
沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法
Mancini曲线： 大分子抗原 时间扩散＞48h， 常数K＝C∕d2 普通坐标纸曲线
Fahey曲线： 小分子抗原 扩散时间24h 常数K＝logC∕d 半对数坐标纸曲线
C为抗原浓度， d为沉淀环直径
36
Mancini曲线
Fahey曲线
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以 上,可见T3为直线，T1为反抛物线
超敏反应
5.免疫印迹法（western blotting):
将电泳分区的蛋白质转移至固相载体，再用酶
免疫、放射免疫等技术测定。
6.免疫PCR（immuno-PCR, IM-PCR):
Western blot
SDS裂解病毒蛋白 SDS-PAGE（聚丙烯酰胺 凝胶电泳） 电转印至硝酸纤维素膜
浸于待检血清
加如酶标二抗
用于IgG、IgM、IgA、C3等检测
2.双向免疫扩散－双扩（定性检测）
抗原抗体的定性检测、组成、两种抗原的相关性 分析 3.对流免疫电泳（定性检测） 4.火箭电泳（定量检测）
5.免疫电泳 6.免疫比浊
用于血清蛋白种类分析 测定血清中Ig含量
(三)免疫标记技术
标记物：荧光素、酶、放射性核素
（二） 呼吸道过敏反应 吸入花粉、尘螨、真菌和毛屑等变应原引起， 过敏性鼻炎和过敏性哮喘是临床常见的呼吸道过 敏反应 （三） 消化道过敏反应
进食鱼、虾、蟹、蛋、奶等食物后可发生过敏 性胃肠炎，出现恶心、呕吐、腹痛和腹泻等症状。
（三） 皮肤过敏反应 荨麻疹、湿疹
药物过敏性休克（以青霉素为例）
青霉素（半抗原）
人工主动免疫：用疫苗接种机体，刺激机体产生特异
性免疫应答，预防感染。 疫苗(vaccine)：细菌性、病毒性制剂、类毒素 1.死疫苗： 伤寒、霍乱、百日咳、流脑、乙脑 优点：易制备，易保存，较稳定,可以联合应用 缺点：接种后效果较差, 剂量大，需多次注射才能
获得持久免疫力，局部、全身反应明显
2.减毒活疫苗
稳定 （2）酶免疫组化： 测定组织或细胞中抗原
3.放射免疫测定：用放射性核素标记抗原或抗体
进行免疫学检测
优点：灵敏度极高，(检测范围pg-ng) 缺点：放射性污染，设备昂贵 用于某些激素、药物的检测
凝集反应
质偶联在红细胞上，常用的偶联剂有戊二醛、CrCL3
和双偶氮联苯胺。
临床免疫学及免疫检验
2.胶乳颗粒载体及致敏
聚苯乙烯胶乳颗粒是人工合成的载体，它是一种大小均
一，直径为0.8μm大小的圆形颗粒，带有负电荷，可用物 制备成带有化学活性基团的颗粒(如带有羧化聚苯乙烯胶 乳)，抗原或抗体能以共价键交联在胶乳表面(通过缩合剂 碳化二亚胺将胶乳颗粒表面的羧基与被交联物上的氨基
的反应。1945年Coombs等根据抗体球蛋白对异种动物亦 是抗原的原理，把产生“不完全抗体”的机体正常血清球 蛋白，注射到异种动物使之产生抗球蛋白，这种抗球蛋 白加入表面结合有不完全抗体的红细胞的复合物中，就
能出现可见的凝集现象，称抗球蛋白试验。因为此反应是
Coombs首先建立的，故又称Coombs试验。
(1) 取细菌或红细胞悬液1滴，在玻片上 和1滴诊断血清混匀。 (2) 置室温，数分钟后即可用肉眼或低 倍显微镜观察凝集结果，出现颗粒凝 集者为阳性。
临床免疫学及免疫检验
3．方法评价 本试验是一种特异性强、简
便、快速的定性试验方法。 4．临床意义 适用于大量普查，未知菌种 的鉴定或分型，或用标准血清作红细胞 ABO血型的鉴定。有时也可用于定量检测 前的筛选试验(如布氏菌、土拉弗氏菌等 抗原)，初步观察病人血清中有无相应的 抗体，然后再对阳性标本作试管凝集试验 测定其效价。
间接凝集试验又称被动凝集试验(passive agglutination test)。所用的与免疫无关颗 粒称为载体，将抗原(或抗体)吸附或偶联 于颗粒表面的过程称致敏。而吸附有已 知抗原或抗体的颗粒称致敏颗粒。
临床免疫学及免疫检验
一、间接凝集技术类型
根据致敏载体用的是抗原或抗体以及 凝集反应的方式，间接凝集反应可分为：
教案第八章免疫学应用
抗原抗体反应的类型
1、凝集反应 ⑴直接凝集反应 ：颗粒性抗原与抗体直 接结合的反应。包括：玻片凝集反应、 试管凝集反应、微量凝集反应 抗原与抗体的含量用效价或滴度表示，抗原 抗体反应时， ⑵间接凝集反应 ：可溶性抗原与抗体的 结合不出现凝集现象，可事先将抗原或 抗体吸附在颗粒性载体表面，再与相应 抗体或抗原结合，就可出现凝集现象。
淋巴母细胞显微镜
2、体内免疫测定
1、Ⅰ型超敏反应皮 肤试验。 2、迟发型超敏反应 皮肤试验 阳性：机体免疫细胞正 常。阴性：细胞免疫 功能低下。 诊断结核、麻风、恶性 肿瘤细胞免疫检测、 疗效观察、预后等
A.速发型(Ⅰ型)
B.迟发型(Ⅳ型)超敏反应皮肤表现
第二节
一、免疫预防
自动免疫
免疫学防治
自然自动免疫：感染后获得 人工自动免疫：接种疫苗 自然被动免疫：经胎盘
比较项目 人工主动免疫 输入物质 抗原 生效时间 慢，1－4周 人工被动免疫 抗体 快，立即获得
维持时间 长，数月至数年 短，2周至3周 用途 主要用于预防 紧急预防或治疗
用于人工免疫的生物制品
1、疫苗 活疫苗：用量小、效果好、免疫时间长； 不易保存，效期短 死疫苗：用量大、多次接种、免疫时间短； 安全易保存。 自身疫苗：患者自身死疫苗 新疫苗： 2、类毒素：
1、了解抗原抗体检测法。 2、了解细胞免疫功能检测法。 3、掌握人工免疫。 4、了解计划免疫与免疫调节剂。
【重点难点】： 人工免疫 【学法指导】
1、自主学习 阅读教材本节课的内容，找出学习目标 中的答案。 2、合作探究 （1）人工免疫的原理、类型、用途。 （2）免疫学应用范围。
【自我检测】
一、填空题 1、抗原或抗体检测方法常见有——、——、—— 、——、——。 2、免疫ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ记检验技术常见的标记物有——、—— —--、——-。 3、鉴定细菌的抗原型别可采用————，诊断妊 娠的简易快速方法有————。 4、人工主动免疫常用的制剂有———和————。 5、人工被动免疫常用的制剂有———、———— 和————。
第十二章免疫检测原理及方法
第十二章 免疫检测原理(yuánlǐ)及 方法
免疫检测技术对于基础和临床兽医学发展以及在疾病诊断、 预防和治疗以及研究疾病起因、发生和发展的方面都有着极其 重要的意义。
免疫学技术的改进和发展，是建立在许多其他生物科学的 技术之上，如用生化和蛋白分离技术分离抗原和抗体、用分于 遗传学技术闸明免疫学上重要分子的基因序列。另一方面，免 疫学又形成了许多本学科的技术，尤其是依据于抗原-抗体反 应有高度(gāodù)特异性，作为检测手段胜过任何其他方法在这 方面的优势。
(hùnhé)，再使两者与定量的相应抗体(Ab)发生竞争性结合，也即 竞争抑制反应。
第八页，共十五页。
第二节 免疫细胞(xìbāo)的检测
参与免疫应答的细胞有多种，如负责体液免疫的B细胞， 执行细胞免疫的T细胞和沟通(gōutōng)体液免疫和细胞免疫的 其他细胞等。
T细胞、B细胞表面具有特异性抗原和多种受体，据此建立了 相应的检测方法，以鉴定和计数动物外周血液和淋巴样组织中的 T细胞、B细胞及其功能。
主要有两种方法：一是形态学检查法，即将加有PHA培 养淋巴细胞后涂片、染色、镜检以观察形态学变化，计算 淋巴细胞转化率；另一种(yī zhǒnɡ)是同位素标记物掺入法， 即当淋巴细胞受分裂原刺激发生转化时，将具有放射性的 3H-TdR(胸腺嘧啶核苷)加到培养液内，被DNA的原料摄入转 化中的细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量(以脉冲 数表示)，进而测定淋巴细胞的转化程度。
近年来，在上述基本反应基础上，采用荧光素、同位 素和酶标记技术，使抗原-抗体反应敏感度增加1,000倍以 上。这种免疫标记方法已广泛应用到医学、兽医学以及其 他生物学许多领域中。
第五页，共十五页。
二、抗原-抗体反应的基本(jīběn)类 型
兽医免疫学检测方法
第十八章免疫学检测方法第一节检测抗原抗体的体外方法第二节检测免疫细胞的方法第三节细胞因子的检测第四节分子生物学技术在免疫检测中的应用免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。
随着学科间的相互渗透，免疫学涉及的范围不断扩大，新的免疫学检测方法层出不穷。
免疫学方法的应用范围亦在日益扩大，不仅成为多种临床疾病诊断的重要方法，也为众多学科的研究提供了方便。
本章将从抗原、抗体、免疫细胞和细胞因子检测等方面概括介绍试验的基本类型、原理和主要用途，并对分子生物学技术(分子杂交、转基因、多聚酶链反应)在免疫学领域的应用作一简要介绍。
第一节检测抗原抗体的体外方法抗原与相应抗体相遇可发生特异性结合，并在外界条件的影响下呈现某种反应现象，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原(或抗体)检测未知抗体(或抗原)。
试验所采用的抗体常存在于血清中，因此又称之为血清学反应(serological reaction)。
一、抗原抗体反应的特点(一)抗原抗体结合的特异性抗原借助表面的抗原决定簇与抗体分子超变区在空间构型上的互补，发生特异性结合。
同一抗原分子可具有多种不同的抗原决定簇，若两种不同的抗原分子具有一个或多个相同的抗原决定簇，则与抗体反应时可出现交叉反应(cross reaction)。
(二)抗原抗体结合的可逆性抗原抗体结合除以空间构型互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等分子表面的非共价方式结合，结合后形成的复合物在一定条件下可发生解离，回复抗原抗体的游离状态。
解离后的抗原和抗体仍保持原有的性质。
抗原抗体复合物解离度在很大程度上取决于特异性抗体超变区与相应抗原决定簇三维空间构型的互补程度，互补程度越高，分子间距越小，作用力越大，两者结合越牢固，不易解离；反之，则容易发生解离。
(三)抗原抗体结合的比例性与结合物的可见性抗原与抗体的结合能否出现肉眼可见的反应，取决于两者的比例。
细菌的凝集试验原理
HRP 邻苯二胺 催化
显黄色
Ag OPD HRP
E
E
Ab
酶联免疫吸附试验(ELISA)
将抗原抗体反应在固相上进行,通过洗涤除去 游离成分.目前是应用最广的免疫酶技术。
双抗体夹心法
E
间接法
E
冲洗
待测为抗原
待测为抗体
（3）放射免疫技术(RIA)
定义：用放射性核素标记抗原或抗体进行 免疫检测的方法。 常用标记物：125I和131I
对流免疫电泳？
Ab1、2
（3）免疫电泳
待测Ag
+
Ag1
Ag2
Ag3
-
Ab槽
Ag’
已知Ag
（4）免疫比浊
根据不同量抗原抗体反 应所形成的浊度不同判断 样品中未知抗原的含量。
3 、免疫标记技术
免疫标记技术是用荧光素、酶、放射性 核素、胶体金或化学发光物质等标记抗体或抗 原，利用标记技术的高度敏感性进行抗原抗体 检测。 可见
Ag Ag Ag Ag AgAg Ag Ag Ag Ag Ag
胶体金
优点:灵敏度高、快速、可定性、定量、定位。
分类：根据标记物的不同，免疫标记技 术可分为免疫荧光技术、免疫酶技术、放射 免疫技术、胶体金和化学发光技术。
（1）免疫荧光技术
常用荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC ）和藻红蛋白（PE）。 直接法 间接法
+
激素抗体 凝集
（3）间接凝集抑制试验
+
+
激素分子
不凝集 用于：早孕的检测
2、沉淀反应
可溶性抗原与相应抗体在有适量电解质存在下，出 现肉眼可见的沉淀现象，称为沉淀反应。
该反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散 或免疫扩散，即可溶性抗原 与抗体在凝胶中扩散，在比 例合适处相遇形成可见的白 色沉淀现象。
免疫学基础与病原生物学重点总结
1.补体（C）系统是具有多种调控机制的蛋白质酶促反应系统，广泛存在于人和脊椎动物血清、组织液和细胞膜表面。
2.补体的组成：补体固有成分、补体受体、补体调节蛋白3.补体来源：肝细胞、巨噬细胞4.补体极不稳定，应保存在-20℃或冷冻干燥保存。
5.补体系统的激活：经典途径、凝集素途径、旁路途径经典途径（1）激活物与激活条件激活物：抗原-抗体免疫复合物（IC）条件：每一个C1q分子必须同时与IC中两个以上Ig分子的补体结合位点结合后才能活化，单个IgM即可激活（2）活化过程：【识别阶段】C1识别IC进而活化的过程【活化阶段】形成C3转化酶和C5转化酶阶段（3）膜攻击阶段：膜攻击复合物（MAC）在细胞膜上形成亲水性通道，能使可溶性小分子、离子和水分子自由通过细胞膜，导致胞内渗透压降低，细胞膨胀而被溶解。
6.补体的生物学作用（1）补体介导的溶细胞作用（2）调理作用（3）清除免疫复合物的作用（4）炎症介质作用（5）免疫调节作用第三节主要组织相容性复合体1.同一种属的不同个体进行组织移植时会发生排斥反应，编码此类抗原的基因群称为组织相容性复合体（MHC）。
2.人类的有关抗原在白细胞发现，称为人类白细胞抗原（HLA），编码这些抗原的基因群称为HLA复合体。
人类MHC分子一般指经典HLA基因编码产物，简称HLA分子（提呈抗原肽）。
3.HLAⅠ结构：肽结合区（信息传递）、Ig样区、跨膜区、胞浆区分布：各种有核细胞、血小板及网织红细胞表面，成熟红细胞和滋养层细胞表面不表达。
抗原肽与Ⅰ类分子的结合有一定的选择性，但并不像抗原抗体那样高度结合，只要多肽2~3个关键的氨基酸能恰当地连接而沟槽内相应位置，多肽即可与之结合。
4.HLAⅡ类分子的分布：主要表达于B细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞和活化的T细胞表面。
5.MHC分子的免疫学功能（1）参与抗原的加工与提呈（2）参与免疫应答的遗传控制（3）制约免疫细胞间相互作用TCR识别APC上抗原肽的同时还必须识别与抗原肽结合成复合物的自身MHC 分子，此现象为MHC限制性（4）参与T细胞分化成熟（5）参与调控自然杀伤细胞第四节其他免疫因子一、细胞因子细胞因子（CK）是指多种细胞受免疫原、丝裂原等刺激后合成分泌的，通过与细胞表面相应的受体结合而发挥多种生物效应的一类小分子蛋白质，是机体内细胞间信号传递的重要介质。
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第二十二章免疫学检测技术的基本原理第一节体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素（一）抗原抗体反应特点1．高度特异性抗原与抗体的结合具有高度特异性，这种特异性是由抗原表位与抗体分子中的超变区互补结合所决定的。
空间构型互补程度越高，抗原表位与抗体可变（V）区之间结合力越强，抗原抗体结合的特异性越强，亲和力也越高。
利用这一特点，在体外可以对许多未知的生物学物质进行特异性鉴定。
如利用抗伤寒杆菌的抗体检测伤寒杆菌；也可用已知的抗原（如乙型肝炎病毒）来检测相应的抗体（抗乙型肝炎病毒抗体）。
2．表面化学基团之间的可逆结合抗原抗体结合除了空间构象互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等分子表面的化学基团之间的非共价方式结合。
这种非共价键不如共价键结合稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离，解离后抗原和抗体仍具有原有的特性。
解离度主要取决于两个方面：一是抗体与抗原结合的亲和力（affinity）。
亲和力指抗体分子单一抗原结合部位与一个相应抗原表位之间互补结合的强度。
抗体亲和力越高，解离度越低；反之抗体的亲和力越低，解离度越高。
二是抗原抗体反应的环境因素如温度、酸碱度和离子强度。
因此在体外进行抗原抗体反应时，要求适当的温度、酸碱度和离子强度等条件。
2010-4-137K （亲和常数）=Ag+AbAg Ab3．适宜的抗原抗体浓度和比例抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应取决于两者适当的浓度和比例。
在反应体系中，如果抗原与抗体的浓度和比例适当则抗原抗体复合物体积大、数量多，出现肉眼可见的反应。
若抗原或抗体过剩，抗原-抗体复合物体积小、数量少，不能出现肉眼可见的反应。
故在具体实验过程中要适当稀释抗原或抗体，以调整两者浓度和比例，使其出现最大复合物，避免假阴性的发生。
2010-4-138抗原过剩抗体过剩抗原抗体比例合适4．抗原抗体反应的两个阶段抗原抗体反应可分为两个阶段：第一个阶段是抗原抗体特异性结合阶段。
抗原分子与抗体分子之间是互补的非共价结合，该反应迅速，可在数秒钟至几分钟内完成，一般不出现肉眼可见的反应。
免疫05 第五章 免疫凝集试验
本章小结
免疫凝集试验是指颗粒性抗原或覆盖了可溶性抗原（或 抗体）的致敏载体颗粒与相应抗体（或抗原）结合后，在适 宜的电解质条件下出现肉眼可见的凝集现象。包括直接免疫 凝集试验、间接免疫凝集试验等。
根据载体不同有多种试验类型，如协同免疫凝集试验、 间接免疫血凝试验、胶乳颗粒凝集试验、明胶颗粒凝集试验 、炭颗粒凝集试验、甲苯胺红颗粒凝集试验等。Coombs试验 也是临床常用的免疫凝集试验之一。
二、间接免疫凝集试验的临床应用
抗原的检测： 用于原体可溶性抗原的检测：如乙型肝炎病毒表面 抗原，细菌、腺病毒及流感病毒等的抗原鉴定和细菌可溶 性产物如外毒素等。 用于检测各种蛋白质成分：如尿液绒毛膜促性腺激素、纤 维蛋白原等血浆蛋白成分等。
间接免疫凝集试验的临床应用
抗体的检测： 用于检测细菌、病毒、螺旋体、寄生虫等感染后产生 的抗体：如抗人类免疫缺陷病毒抗体、抗溶血素O、梅毒螺 旋体抗体等。 用于检测自身免疫性疾病的抗体：如类风湿因子、抗 DNA抗体和抗甲状腺蛋白抗体等。 用于超敏反应患者的抗体测定：如青霉素抗体、某些 花粉抗体等。
（一）正向间接免疫凝集试验：测抗体
间接免疫凝集试验的类型
（二）反向间接免疫凝集试验：测抗原
间接免疫凝集试验的类型
（三）间接免疫凝集抑制试验：可测抗原，也可测抗体
间接免疫凝集试验的类型
（四）协同免疫凝集试验：测抗原，原理与反 向间接免疫凝集试验相似。
所用载体是细胞壁含有A蛋白（SPA）的金黄色 葡萄球菌，SPA具有与IgG（IgG3除外）的Fc段结合 的特性。
免疫凝集试验可作定性检测，也可进行半定量检测。 适当的室内质量控制措施可保证检测方法的有效性和检 测结果的可靠性。
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第一节凝集反应目的和原理颗粒性抗原与相应抗体在适当条件下发生友应，出现肉眼可见的凝集小块，称为直接凝集反应。
在操作方法上有玻片法和试管法两种。
本试验以细菌与其相应抗体反应为例，掌握玻片法和试管法凝集试验的原理，熟悉其方法和临床意义。
一、玻片凝集试验器材和试剂1·标本任一常见细菌的平板或斜面培养物。
2·试剂与细菌对应的诊断血清(可用生理盐水作适当稀释以免发生前带现象)、生理盐水等。
3·器材载玻片、接种环等。
步骤和方法1·于洁净载玻片的一端加生理盐水一滴，另一端加诊断血清一滴。
2·用接种环挑取细菌，分别涂于生理盐水和待检血清中，充分混匀。
3．室温下静置数分钟观察结果。
结果和评价生理盐水对照不发生凝集，为均匀混浊的乳状液。
在诊断血清中，细菌与相应抗体反应会出现肉眼可见的凝集块，为阳性结果。
如与对照相同则为阴性。
本方法为定性试验，敏感性较低。
但操作简便，反应迅速，目前仍然是细菌分型鉴定和ABO血型鉴定的常规实验。
二、试管凝集试验器材与试剂1．标本待检血清。
2·试剂伤寒沙门菌H诊断菌液(7×108／m1)、抗伤寒沙门菌H抗血清(用生理盐水做l：10稀释)、生理盐水。
3·器材恒温水浴箱、试管架、试管、吸管等。
步骤和方法-操作程序和加入成分——见表11．取洁净试管8支，排列于试管架上，依次编号并做好标记。
2·向各试管中均加人生理盐水0．5ml。
3·吸取1:10稀释的抗伤寒沙门菌H抗血清0．5ml，加入第一管中，充分混合,吸出0．5ml 放人第二管，混合后取出0·5ml于第三管中……，如此直至第七管，混匀后吸出0．5ml 弃去。
第八管不加血清，为生理盐水对照。
至此第1~~'7管的血清稀释度为：1：20、1 ：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280。
这种稀释方法称为连续倍比(2倍)稀释法，是免疫学试验中常用的一种稀释方法。
4·向每管加入诊断菌液0·5ml，此时每管的液体总量为1．0ml，血清稀释度又增加1倍。
5·摇匀置37℃ 2—4h，取出置4℃或室湿过夜后观察结果。
管号 1 2 3 4 5 6 7 8(对照)诊断菌液0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5终稀释度1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 —表1 试管凝集操作程序（单位：ml）结果和评价判断凝集试验的结果，要有良好的光源和黑暗的背景，先不振摇，观察管底凝集物和上清的浊度。
然后轻轻摇动试管，注意观察凝集颗粒的松软度、大小、均匀度等性状及液体的混浊程度。
1·盐水对照管应无凝集现象，轻轻摇动试管，细菌分散均匀混浊。
2·伤寒沙门菌O抗原凝集物呈颗粒状沉于管底，轻摇时不易散开；H抗原凝集物呈絮状，疏松而大块地沉于管底，轻摇易离散。
凝集程度通常以“+”表示强弱。
“4+”很强，细菌全部凝集，凝块全沉于管底，液体澄清。
“3+”强，细菌大部分凝集，液体稍混浊。
“2+”中等强度，细菌部分凝集，液体较混浊。
“+”弱，仅少量细菌凝集，液体混浊。
“一”不凝集，液体混浊度与对照管相同。
‘3·只要待测血清管出现“2+”以上的反应现象，就可判为反应阳性；以出现“2+”凝集的最大血清稀释度为待检血清的抗体效价。
、4·本试验是一经典的定量凝集试验，敏感性不高，但操作方法简单，至今仍在使用。
临床意义1．主要用于鉴定细菌的种和型。
2．ABO血型鉴定。
第二节沉淀反应三、凝胶双扩散试验目的和原理将对应的抗原与抗体放在琼脂凝胶板中的相应孔内，可各自向凝胶中自由扩散。
当二者相遇时发生特异性反应，在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线。
根据抗原与抗体的性质、纯度和比例的不同，沉淀线的形状、位置和数量不一。
要求掌握试验原理、方法和结果分析，熟悉其临床意义。
器材和试剂1．试验标本待检血清、人IgG血清。
2．主要试剂羊抗人IgG诊断血清、15g／L盐水琼脂等。
3．主要器材载玻片、吸管、打孔器、湿盒、微量加样器等。
步骤和方法1，浇板用粗孔吸管吸取熔化的1.5%盐水琼脂4.5ml,浇注于普通洁净载玻片上，要均匀、平整、无气泡、布满整个玻片。
2．打孔待琼脂凝固后(室温约需15～20min)，用直径3mm的打孔器打孔，使孔间距为4～5mm。
临床常用的孔型为梅花形，中间为抗体孔，四周等距排列6个抗原孔。
3．加样用微量加样器向中央孔加入抗体(人IgG诊断血清)，向周围孔加入待测抗原，其中第1~5孔加入阳性对照血清（羊抗人IgG诊断血清按1：2、1：4、1：8、1：16、1：32倍数稀释），第6孔分别加入待检血清。
如用于检测抗体特异性时，中央孔加抗血清，四周孔加入不同的有关抗原；如进行抗体效价滴定时，则在中央孔加入抗原，四周孔加不同稀释度的抗血清。
4．扩散将加好样的琼脂板放人湿盒中（内有5%的石炭酸湿纱布)，置室温或37℃1～2d，于24h和48h各观察和记录结果一次。
结果和评价如果凝胶中出现白色沉淀线，说明抗原与抗体相对应。
若抗原与抗体只含单一的对应成分，则形成一条沉淀线；若含多种对应成分，可形成多条沉淀线。
沉淀线的位置因抗原和抗体的分子量、浓度比例、扩散速度等因素的不同而异。
另外，若相邻抗原浓度相等，可出现对称相融的沉淀线；若不等，沉淀线移向低浓度一边。
在梅花孔型中，若相邻两条沉淀线完全融合，说明两孔内抗原完全相同，若相邻沉淀线部分融合，说明两抗原部分相同；若相邻沉淀线发生交叉，说明两抗原完全不同。
阳性结果多在24h以内出现，48h不出现沉淀线可判为阴性结果。
放置过久可使沉淀线消失。
此方法简便易行，结果稳定可靠；但灵敏度低，试验所需时间长，且只能定性，不能定量，仅适用于大量普查项目。
四、对流免疫电泳目的和原理在偏碱性的缓冲环境和适当的直流电场中，大部分抗原带有较多的负电荷，向正极移动；而抗体(尤其是IgG)在同样的环境中带负电荷较少，加上凝胶内较强的电渗作用，故抗体向阴极移动。
在一定时间内(约30～90min)，移动的抗原和相应抗体在两孔间相遇并发生反应，在浓度比例适当时形成沉淀线：本实验以测定血清中AFP为例，要求掌握实验原理、操作过程和结果分析；熟悉其临床应用及意义。
器材和试剂1．试验标本阴性血清、人IgG血清。
2．主要试剂羊抗人IgG诊断血清、pH8．6 0．05mol／L巴比妥缓冲液、15g ／L琼脂巴比妥溶液。
3．主要器材电泳槽、电泳仪、孔型模板、打孔器、载玻片、吸管、微量加样器、吸球、滤纸和纱布条等。
一步骤和方法1．配制试剂按本书后的附录配制pH8．6 O．05mol／L巴比妥缓冲液和15g／L琼脂巴比妥液并将后者加热熔化。
2．制板用粗孔吸管吸取已熔化好的巴比妥琼脂4．5ml，加到洁净载玻片上浇制成琼脂板。
3．打孔待琼脂凝固后成对打孔，孔径为3mm，孔距为10mm。
4．加样（无需稀释）做好抗原（阴性血清、人IgG血清）和抗体（羊抗人IgG诊断血清）的标记（例如在无关紧要的边缘打一小孔等)，按标记分别加入抗原、抗体及阳性对照。
5．电泳将加样完毕的琼脂板置电泳槽的支架上，抗原孔置阴极端，抗体孔置阳极端，电泳槽内加0．05mol／L pH8．6的巴比妥缓冲液，液面至槽高的2／3处，琼脂板两端用滤纸条和纱布条与缓冲液相连。
接通电源，控制电压在10~12v (3v／cm板宽)。
电泳40min后，切断电源，放置半小时后取出琼脂板观察结果。
结果和评价待测孔与抗血清之间出现沉淀线为阳性，否则为阴性。
阳性结果的沉淀线位置与抗原和抗体分子的电荷情况有关，也与抗原和抗体的比例有一定关系。
对流免疫电泳操作简便，观察结果快，敏感度比琼脂双扩散法高8～16倍。
制作琼脂板时必须选择高电渗作用的普通琼脂，还要选择高特异性、高亲和力的抗体，否则结果难以解释。
第三节酶免疫技术五、酶联免疫吸附试验目的和原理酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种固相酶免疫测定技术，先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，与待测样品中的抗原或抗体发生反应，再加入酶标抗体与免疫复合物结合，最后加人酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析。
该试验的检测类型有双抗体夹心法、间接法、双位点一步法、竞争法和捕获法等。
本试验以间接法为例。
要求掌握ELISA的原理、方法和应用。
一试剂器材1. 试剂(1) 1×包被缓冲液(2) 洗涤缓冲液(3) 抗体稀释液（KGP1241、12410、1250）(4) 底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):0.2M Na２HPO４(28.4克／L) 25.7ml0.1M 柠檬酸(19.2克／L)24.3ml 加蒸馏水50ml。
(5) 显色剂（KGP1251、12510）(6) 终止液（KGP1271、12710）二操作步骤（用于检测未知抗体的间接免疫吸附法）1. 包被：用1×包被缓冲液将抗原（人IgG）稀释200倍至蛋白质含量为10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用1×洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
2. 加样：加一定稀释的1抗（羊抗人IgG）(1:100 ,1:500,1:1000)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后用1×洗涤缓冲液洗涤。
(同时做空白孔，包被时加水；阴性对照孔，包被时加阴性血清；其余步骤相同)。
3. 加酶标抗体HRP：将2抗（兔抗羊IgG－HRP），于各反应孔中0.1ml。
37℃孵育1小时，用1×洗涤缓冲液洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液（显色剂）0.1ml，RT，10分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入中止液0.05ml。
（此步骤可省略，如显色反应不明显再加中止液）6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
7.可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
三注意事项1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。
有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。
其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。