革兰染色

• 4 水洗时， 不要直接冲洗涂面，而应 使水从载玻片的一端流下，水流不宜过 急，以免涂片薄膜脱落。
二、细菌因素
• 1 细菌培养时间 细菌的典型形态、染色 性是在对数生长期，取这时的细菌做革兰染色 可以反应细菌的真实的染色性。一般选用培养 18-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌培养时间 太长，细菌太老，由于菌体死亡或自溶，染色 性就会发生变化，可能会使革兰阳性菌染成革 兰阴性菌。
细菌革兰染色 及形态鉴定
细菌标本染色检查法
细菌染色
活 菌染色
死菌染色
正染色
负染色
普通染色
特殊染色
简单染色法
复杂染色法
芽孢染色法
荚膜染色法 细胞壁染色法
抗酸染色 革兰氏染色
• 细菌微小、半透明，在普通光 学显微镜下不易识别。
• 将细菌染色，增加反差，便于 观察。
• 革兰氏染色法是细菌学中广泛 使用的一种鉴别染色法。
初染
媒染
脱色
复染
冲洗
冲洗
冲洗
结晶紫 1’ 碘液 1’ 95% 乙醇 30” 复红 30’’
冲洗
滤纸干燥 油镜观察
革兰染色
甲
紫紫色色（（GG＋＋））
菌
wenku.baidu.com初染 媒染 脱色 复染
革结兰晶氏紫 染碘色液步骤乙示醇 意图稀释复红
乙
红色（G-）
菌
革兰染色步骤示意图
革兰染色步骤小结
滴水 取菌 涂片 固定 结晶紫（1min）
• 革兰染色在临床上有助于细菌 致病性分析及抗菌药物选择。
革兰染色
革兰染色法是微生物 学中常用的一种染色 方法，该染色法由丹 麦医生Gram于1884年 首创，故名。
Hans Christian Gram
细菌染色方法中最经典应用最广泛的
染色方法革 兰 染 色
革兰阳性细菌 革兰阳性细菌
2、在微生物检验中的地位
• 3 酒精 酒精作为脱色剂，革兰染色的 脱色酒精浓度为95% ，在此浓度下革 兰阳性菌染上的结晶紫不易被脱去，保 留紫色，革兰阴性菌染上的结晶紫容易 被脱去，最后呈红色。但当酒精的浓度 为70% 时，它的脱色能力最强，可能 使革兰阳性菌染上的结晶紫也被脱去， 使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
• 除外所述影响染色的其他因素，还有菌 体细胞的构造和其外膜的通透性，如细 胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构 完整与否，在染色上都起一定作用。此 外，染色液中的电介质含量和pH、温 度、药物的作用等，也都能影响细菌的 染色，所以我们在染色时要注意当染色 结果与预想的结果出现不一致时，要考 虑到这些因素的影响 .（阴阳性对照）
• 是贯穿于微生物检验始终的一项
• 是保证细菌鉴定结果的 首项工作
• 故是检验工作者
基本技能
必备技能
原理
1、细胞壁通透性学说 2、等电点学说 3、化学学说
通透性学说
G+菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚 ，脂质含量少，乙醇不易进入。
G-菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄 ，含大量脂质，乙醇易渗入。
等电点学说
3. 固定 手持载玻片的一端，菌膜
面向上，在火焰最热部分快速通 过3次，待玻片冷却后方可染色。
固定的目的：
• 使细菌的细胞凝固，固定其细胞 结构；
• 使菌体与玻片粘得更牢固，以免 水洗时被冲掉；
• 可改变菌体对染料的通透性，一 般死细胞原生质容易着色；
• 加热固定可杀死细菌，比较安全 。
革兰染色
• 1 碘液 碘液作为媒染剂能增加 染料与被染物的亲和力。如果碘液 放置时间太长，或经日光照射失效 ，失去媒染剂的作用，就可能使结 晶紫与细菌结合的不牢固，容易被 脱色，使革兰阳性菌染成革兰阴性 菌。
• 2结晶紫 结晶紫的浓度太高，就 会使染上的颜色不容易被酒精脱色 ，可能会使革兰阴性菌染成革兰阳 性菌。
G+菌等电点（pI2~3） G-菌等电点（pI4~5）
在相同pH条件下G+菌所带负电荷 比G-菌多，所以与带正电荷的结 晶紫染料结合较牢固，不易脱色 。
化学学说
G+菌菌体内含有大量核糖核酸镁盐，可
与碘、结晶紫等染料牢固结合，使已着 色的细菌不易被乙醇脱色
G-菌 菌体内含核糖核酸镁盐很少，故易 被脱色
• 2脱色时间 阳性菌透性小，不易被脱 色，阴性菌透性大，易脱色；但这是在 固定的时间条件下的结果，如果延长脱 色时间，也会使脱色剂渗透进阳性菌的 细胞壁中，使染上的结晶紫脱去颜色， 最后染上复红的颜色，变成革兰阴性菌 。而脱色时间太短的话又会使阴性菌染 上的结晶紫不能完全脱色，出现紫色， 误认为革兰阳性菌。
显微镜下的杆菌
弧菌
细菌荚膜示意图
荚膜的观 察：
负染色
谢 谢！
细菌形态鉴定
细菌的三种基本形态
• 球菌：葡萄球菌。 • 杆菌：大肠杆菌。 • 螺形菌：霍乱弧菌。
细菌的三种基本形态示意图
⊕
葡萄球菌：
Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells.
杆菌(bacillus)
Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells
• 3 固定方法 固定不仅能杀死细菌，改 变细菌对染料的通透性，还能使细菌吸 附在玻片上，保持原有的形态结构。固 定方法是将干燥后的细菌涂片以快速通 过火焰三次，以玻片触及手背皮肤热而 不烫为宜，自然冷却。但在实际操作中 如果将玻片在火焰上烤的太久，改变了 细菌原有的通透性，会使细菌的染色性 发生变化，影响染色结果。
乙醇脱色 水洗 30s
水洗 复红30s
紫碘酒红
碘液 （1min）
水洗
水洗 干燥 镜 检
分分半半
结果
• 细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌； • 而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；
阳性菌——紫色 阴性菌——红色
革兰染色的影响因素
• 1操作因素 • 2细菌因素 • 3染液因素
操作因素
• 1. 涂片太厚 在涂片时细菌挑的 太多，没法分开，在脱色时就不能 将第一步染上的结晶紫的颜色脱去 ，可能会使革兰阴性菌也出现紫色 ，误认为革兰阳性菌。
• 2 培养基的成分 一般认为革兰阳性菌 体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的 复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合 很牢，不易脱色。但是如果培养基中缺 乏核蛋白质镁盐就不能合成菌体成分的 核蛋白质镁盐，细菌与碘和结晶紫的复 合物结合就不牢固，容易脱色，可能会 使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
三、染液因素
革兰染色步骤
染色标本制备
染色标本制备
1. 涂片 在载玻片上标记名称或者编
号，然后滴加1滴生理盐水，将接 种环在火焰上烧红，待冷却后挑取 少量菌种与玻片上的水滴混匀后， 在载玻片上涂布成一均匀的薄层， 菌膜直径在0.5~1cm。
2. 干燥
涂好的菌膜在室温下自然干 燥，或将标本面向上，置于离酒精 灯火焰约16cm高处缓慢烘干，切 不可放在火焰上烧干。