微卫星多重PCR扩增技术

产物大小 290-320 200-250 140-170 360-400 290-330 200-250 140-180
4-5
• PCR程序：
• • • • • •
95 C 95 C Ta 72 C 72 C 4C
3 min 30 s 30 s 32 cycles 45 s 5 min for ever
注：对Ta进行梯度优化，设置4个温度梯度－50，54，58，62。
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聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 溶液配置：
• 5×TBE：54 g Tris 碱，27.5 g硼酸，20 ml 0.5
mol/L EDTA （pH 8.0），加ddH2O定容至1000 ml 。 • 40％丙烯酰胺：380 g 丙烯酰胺，20 g甲叉-丙烯酰 胺，加ddH2O定容至1000 ml。
鱼类育种学实验
内容：微卫星多重PCR扩增技术
实验目的
• 掌握SSR分子标记技术的原理与分析方法；
• 学习多重PCR技术，了解体系优化的方法；
• 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法；
• 掌握银染的实验方法。
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实验一 PCR反应及体系优化
• 实验材料与仪器 • 材料：团头鲂DNA模板（浓度：100 ng/μl ） • 仪器用具：PCR仪，制冰机，紫外反射投射检测仪，微量 移液器，冰箱，天平，电泳仪，电泳槽，烧杯，量筒，
200 ul PCR管，Taq酶，dNTPs，引物，PCR缓冲液，石蜡
油，电泳所需试剂，溴酚蓝，琼脂糖，硼酸，Tris碱，蒸 馏水，离心管。
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实验步骤
• PCR反应液配置－PCR扩增－产物检测－程序优化 －PCR扩增－产物检测－结果分析
多重PCR扩增体系为20 μl：包括100 ng基因组 DNA，1 × PCR 缓冲液，Mg2+ (1.5 mmol/L)，1 U Taq 酶， dNTPs 0.2 mmol/ L，多重PCR扩增体系内各位点上、
下游引物分别为0. 25 μmol/L
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体积 试剂 三重PCR体系 (μl) H2O Buffer Mg2+ 13.7 2.0 1.2 四重PCR体系(μl) 13.2 2.0 1.2
dNTP
Primer-1 (F/R) Primer-2 (F/R) Primer-3 (F/R) Primer-4 (F/R) Taq 酶 DNA (100 ng/μl)
• 固定液－10％冰醋酸
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• 银染步骤： • 1. 取下凝胶用去离子水冼胶2 min； • 2. 0.1% 硝酸银染色10－15 min； • 3. 弃去染色液, 蒸馏水洗胶30 s；
• 4. 显色液显色15秒, 换用新的显色液, 显清条带为止；
• 5. 显色后用固定液（冰乙酸）终止显色，2 min； • 6. 用去离子水洗涤2遍。
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• 作业 • 完成实验报告，分析检测步骤和结果，探索 微卫星多重PCR优化程序的控制因素对反应 的影响,分析SSR带型。
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0.4
0.25+0.25 0.25+0.25 0.25+0.25 -0.2 1
0.4
0.25+0.25 0.25+0.25 0.25+0.25 0.25+0.25 0.2 1
Total
20 μl
20 μl
5
体系名称 3-7
引物组合 Mam_EST811 Mam_EST129 Mam_EST64 Mam_EST179 Mam_EST11 Mam_EST90 Mam_EST37
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•
5×TBE
14 ml
650 μl 65 μl
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• 10％ APS • TEMED
• 染色液－0.1％ AgNO3：0.5 g AgNO3，加ddH2O 定容至 500 ml，置于4 C。 • 显色液：10 g NaOH，0.2 g NaCO3， ddH2O 定容至500
ml，置于4 C保存，用时加 2 ml 37％ formaldehyde。
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• 0.5 mol/L EDTA （pH 8.0）：186.1 g EDTA•Na•2H2O，800 ml ddH2O，NaOH调pH至8.0 （about 20 g NaOH），加
ddH2O定容至1000 ml，高压灭菌。
• 10％ APS：1 g APS，加ddH2O 定容至10 ml，置于4 C。 • 8% non-denaturing PAGE gel: • 40% 丙烯酰胺 • ddH2O 14 ml 41 ml