第十五章基因工程现代遗传学优秀课件

第二节 目的基因的制备
一、化学合成法：
1979年Khorana首先成功地合成了tRNA基因。
在体外，可以合成一系列长约几百ｂｐ的寡聚 核苷酸链，然后按照基因的顺序将这些短的核苷酸 链连接起来。
第十五章基因工程 现代遗传学
所谓的遗传工程就是在分子水平上，用人工方法提取 （或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重 新组合。然后通过载体把重组ＤＮＡ分子引入受体细胞， 使外源ＤＮＡ在受体细胞中进行复制和表达。按人们的需 要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳 定地遗传给下一代。所以基因工程（gene engineering）也 称为遗传工程（genetic engineering）、基因操作（gene manipulation ） 、 Ｄ Ｎ Ａ 重 组 技 术 （ recombination DNA techniques）。有时人们还称它为基因克隆（gene cloning） 或分子克隆（molecular cloning）。
同裂酶（isoschizomers)：
指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。 同裂酶进行切割，产生同样或不同的末端（视切割 位点而定）。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性 不同。
同尾酶（isocaudamer）：
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘 性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的 选择余地更大。
七、碱性磷酸酶：
来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase CIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸 根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷 酸作用。当需要5’端同位素标记（脱P后利用T4多 核苷酸激酶磷酸化）或为了避免DNA片段自身连 接（或环化）时可进行脱磷反应。
二、末端转移酶（terminal transferase）
（ terminal deoxynucleotidyl transferase），它所催化的反应与 DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可 以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段为引物，在３’－ ＯＨ端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在 平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性 末端。
遗传工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制备， 载体的选择，体外ＤＮＡ重组，重组ＤＮＡ引入受体细胞， 克隆转化子的筛选，重组ＤＮＡ的检测等。
第一节 基因工程的酶学基础
一、限制性核酸内切酸（restriction endonuclease）：
（ restriction enzyme）。限制性内切酶本来是微生 物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功 能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细 胞中的一种防御机制。
、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ 的特点，可以将限制性内切酶分为三类：
Ⅰ型酶：分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨 酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特 异的切割位点，所以在基因工程中应用不大。
Ⅱ型酶：分子量较小（105Da），反应只需Mg++的存在， 并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得 到广泛的应用。
限制性核酸内切酶的命名原则：
第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的 第一个字母。
第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的 第一、二个字母。
其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌 株号。
罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。
例：EcoR I: 来自于Escheria coli RY13的第一个限 制酶。
Klenow片段：DNA pol I 用枯草杆菌蛋白酶水解成两个片 段，小片段（36KD）具有5’ 3’ 核酸外切酶活性，大片段 （76KD）称为Klenow片段，具有DNA链聚合及3’ 5’核酸 外切酶的活性。
Kl谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用 于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的 处理。
平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker） 进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工 合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特 征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文 结构。如： BamH I 或Sau3A
Hpa II
Hpa II
CCGGATCCGG GGCCTAGGCC
将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限 制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。
这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。
三、ＤＮＡ连接酶（DNA ligase）
该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由 Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用 的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二 脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合 起来。
五、DNA pol I及Klenow片段
该酶常用于制备放射性比度比活体标记高得多的ＤＮ Ａ 探 针 ， 探 针 的 制 备 方 法 是 采 用 所 谓 的 缺 口 平 移 （ nick translation）法制备的。
该酶还用于裂口（gap）修补、反转录第二条链的合成 （ Klenow ）、隐蔽末端的填平反应（ Klenow ）等。
•识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一 回文对称结构上。
•许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端， 有利于ＤＮＡ片段的重组。
Ⅲ 型 酶 ： 这 类 酶 可 识 别 特 定 顺 序 ， 并 在 这 一 顺 序 的 3’ 端 24~26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异 性的。
DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退 火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以 进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。
四、反转录酶（reverse transcriptase）
这类酶来自于反转录病毒，它可以ＲＮＡ为模板，催 化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（MMLV）反转录酶两种。