CHIP SEQ分析常见问题集锦

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ChIP-Seq分析和作用

ChIP-Seq分析和作⽤1：ChIP-Seq数据是基因组特异性富集的序列的测序结果，包括组蛋⽩修饰ChIP-Seq(H3K4me3/启动⼦相关/narrowpeak、H3K4me1/增强⼦相关/narrowpeak、H3K27ac/增强⼦相关/broadpeak)、转录因⼦ChIP-Seq(CTCF/绝缘⼦相关/narrowpeak、pol II/转录起始/narrowpeak)、DNA富集序列(DNase-Seq/弱DNA酶消化/活性区域、MNase-Seq/强DNA酶消化/核⼩体不活跃区域、ATAC-Seq//前两者的结果的集合)。

通过互补染⾊质分析实验分析的基因组位点揭⽰了染⾊质结构的不同⽅⾯：ChIP-seq显⽰特异性转录因⼦（TF）的结合位点; DNase-seq，ATAC-seq和FAIRE-seq显⽰开放染⾊质的区域;和MNase-seq鉴定良好定位的核⼩体。

在ChIP-seq中，特异性抗体⽤于直接或通过包含靶因⼦的复合物中的其他蛋⽩质提取结合⾄靶蛋⽩的DNA⽚段。

在DNase-seq中，染⾊质被DNA酶I内切核酸酶轻微消化。

⼤⼩选择⽤于富集在DNA对DNA酶I攻击⾼度敏感的染⾊质区域产⽣的⽚段（在初期会⽣成包含各种长度的DNA⼩⽚段，但是⼀般来书保留100~300bp长度的⼩⽚段建库测序）。

ATAC-seq是DNase-seq的替代⽅法，其使⽤⼯程改造的Tn5转座酶来切割DNA并将引物DNA序列整合到切割的基因组DNA中（即，标记）。

微球菌核酸酶（MNase）是内切核酸外切酶，其连续地消化DNA直到达到阻塞（和DNA酶相⽐（DNase-seq），属于强切，开放的区域全部都被消化），例如核⼩体。

在FAIRE-seq中，甲醛⽤于交联染⾊质，并且苯酚 - 氯仿⽤于分离剪切的DNA。

2：ChIP-Seq数据的作⽤：a:构建物种的epigenome，利⽤chromHMM将基因组分成⼀个⼀个的区域；b:与交互数据(HiC/chia-pet)联合分析；c:和RNA-Seq联合分析(chirp-seq)。

ChIP-seq实践（H3K27Ac,enhancer的筛选和enhancer相关基因的GO分析）

ChIP-seq实践（H3K27Ac,enhancer的筛选和enhancer相关基因的GO分析）转自简书生信start_site在实践之前，我先查找了一下有关组蛋白修饰的知识点：（参考文章：https:///p/8aca72809c5c）组蛋白修饰能预测染色质的类型（异染色质或常染色质）、区分基因组功能元件（启动子、增强子、基因主体）以及检测决定这些元件处于活性状态或是抑制状态。

例如H3K4me2和H3K4me3修饰大多数富集在转录起始位点附近的启动子上激活基因表达，而H3K27me2和H3K27me3与基因抑制相关。

因此可通过CHIP-seq 分析组蛋白修饰的分布寻找基因的启动子区和增强子区域及其是激活或抑制基因表达。

H3K4me1可作为增强子的标志，H3K4me3作为启动子标志。

研究表明，H3K4me1和H3K4me3与基因激活相关，H3K4me3主要富集在转录起始位点附近的启动子区域，而大多数H3K4me1修饰富集在增强子区域；H3K27ac与基因激活相关，主要富集在增强子和启动子区域，当增强子区只有H3K4me1修饰富集时，该增强子处于平衡状态，而当增强子区域同时富集H3K4me1和H3K27ac修饰时，该增强子就处于激活状态促进基因表达；H3K27的甲基化是可逆的过程，H3K27me1显示出对转录具有正向影响,启动子区域的H3K27me3甲基化修饰时抑制基因的转录,而H3K27me2广泛分布并且在沉默非细胞类型特异性增强子中起作用。

下表为常见的组蛋白修饰的主要分布及功能：image异染色质是染色质的浓缩，转录无活性状态，H3K9甲基化是异染色质的标志。

H3K27me1和H3K9me3存在于着丝粒异染色质区域，而H3K27me3和H3K9me2共同存在于抑制的常染色质区域中。

H3K9ac也与H3K14ac和H3K4me3高度共存共同作为活性基因启动子的标志。

本次实践文章：Targeting super-enhancer-associated oncogenes in oesophageal squamous cell carcinoma用不同浓度的OSCC抗癌物THZ1处理两种OSCC细胞系：KYSE510和TE7。

想做ChIP-seq的你，必须要避免的“坑”（一）

想做ChIP-seq的你，必须要避免的“坑”（⼀）ChIP-seq必须要避免的“坑”ChIP全称是染⾊质免疫共沉淀，就是⽤抗体吊取⽤甲醛交联过的染⾊质中的特异转录因⼦或者发⽣修饰的组蛋⽩，然后，⽤磁珠，琼脂糖珠，或者抗体包被板等策略将转录因⼦或组蛋⽩上交联上的DNA洗脱下来，然后去测序。

说起来很简单，但是，这⾥边有很多“坑”，我们⼀⼀细数⼀下。

ChIP实验最初是为细胞开发的，所以细胞⽔平的ChIP实验体系较为成熟，可以⾃⼰配试剂，也可以买成熟的试剂盒，国产的进⼝的都有很多选择，效果都差不多。

但是组织⽔平就不⼀样了，如果你选择的是⽤组织去做ChIP-seq，那么你要⾸先评估⼀下⾃⼰的组织是什么质地的：组织的质地1.如果是蛋⽩分泌器官，那么，你就需要很⼤的起始量，⽽且做处理组织的时候，要彻底匀浆分多次将⽬标组织悬液洗脱下来。

2.如果你是很纯的组织，⽐如⼀些脏器，没有太多的细胞核以外的蛋⽩质，那么只需要匀浆⼀次，⼀次性就可以洗脱下来⾜够数量的组织悬液。

材料新鲜组织材料是否新鲜也对实验有⼀定影响。

冷冻过的组织，可以做ChIP吗？答案是，可以。

我试过⽤冻了4年的组织去做ChIP依然ChIP下来DNA，但是，这种还是不建议的，ChIP下来的DNA量会变少，⽽且需要3-5倍于新鲜组织的组织起始量。

最好选⽤新鲜的组织去做ChIP，不要冷冻最好了。

想想我们提取核蛋⽩推荐的是什么材料。

时间⼩技巧ChIP实验步骤⾮常多，周期较长，1-3天不等吧。

因此，要涉及到哪⼏步是可以停下来的，毕竟我们都是凡夫俗⼦，不可能不吃不喝连⼲好⼏天吧？不论是⾃⼰配的试剂还是⽤的试剂盒，可以停下来的时间节点分别是：1. ⽢氨酸终⽌交联以后，最好是⽤清洗buffer把含有甲醛和⽢氨酸的溶液换掉以后。

2. 破碎过后的组织悬液可以在-80℃保存3个⽉左右这两步停顿的时间应该基本够我们去吃个饭之类的，还有就是抗体孵育，⼀般是过夜，因为通常情况下，做到这⼀步应该就晚上了，不过经过测试，孵育4个⼩时，和过夜⼏乎没有差别。

20个测序常见的问题

20个测序常见的问题20个测序常见的问题1．为什么需要新鲜的菌液？首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。

2．如何提供菌液？如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4～5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。

同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。

3．如何制作穿刺菌？用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4度保存。

4．PCR产物直接测序有什么要求？（1)扩增产物必须特异性扩增，条带单一。

如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；(2）必须进行胶回收纯化；(3）DNA纯度在1.6—2.0之间，浓度50ng/ul以上。

5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰，这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。

大多所谓的PCR“纯化试剂盒”实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。

对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。

6．如何进行PCR产物纯化？PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。

使用凝胶回收试剂盒回收，产物用ddH2O溶解。

7．PCR产物直接测序的好处？（1) PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况；（2) 省去克隆的实验费用和时间；（3) PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障；（4) 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变。

8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？对测序模板DNA的一般要求：（1)DNA纯度要求高，1.6—2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；（2)溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。

ChIP实验常见问题解析

ChIP实验常见问题解析ChIP实验常见问题解析1.染色质免疫共沉淀(ChIP)实验中使用超声方法断裂染色质温度不易控制，可能会使蛋白变性，如何进行优化？染色质免疫共沉淀(ChIP)实验中超声的优化一般从如下几个方面考虑:（1）重复已发表文献中的剪切方案时建议进行优化。

尤其是当仪器不同于文献中所使用的仪器时。

（2）使用基于探头的超声破碎仪时，探头要适于样品体积。

（3）在任何情况下，剪切参数都应当根据样品体积、细胞密度和细胞类型而优化。

（4）优化应当包括功率设置（超声时间 vs. 间隙时间/休息时间）以及获得长度为200 – 1000 bp的DNA片段所需的剪切循环数，每个优化实验只优化一种参数；（5）注意时间和功率设置。

过度破碎和太高功率设置会损害在免疫沉淀步骤中的表位。

降低染色质免疫共沉淀（ChIP）信号。

（6）始终保持裂解液冰冷，间断超声（而非连续），因为超声处理产生热量会使染色质变性。

（7）在超声破碎过程中避免气泡。

泡沫会导致蛋白质的表面变性，可能使染色质损失在气泡中。

为了避免这种情况，一开始设为较低功率，再逐步提高。

（8）在优化条件时，每个超声破碎循环后通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段的长度。

剪切不足所产生大的不溶复合物可能堵塞琼脂糖凝胶的孔，并延缓电泳过程。

通过消化蛋白质、逆转交联、酚:氯仿提取和沉淀来纯化DNA。

2.染色质免疫共沉淀（ChIP）实验研究转录因子，调控因子结合的DNA和组蛋白结合的DNA操作上最大的区别是什么？染色质免疫共沉淀（ChIP）实验中由于组蛋白在染色质中表达相对较高且较稳定，转录调控因子表达水平很低，往往是瞬时表达。

所以组蛋白相对研究起来更为容易，一般需要105-106个细胞即可完成一个染色质免疫共沉淀（ChIP）反应。

研究起始样本量（细胞，组织）要是组蛋白的10倍，一般每个反应至少需要107个细胞。

另外有些转录因子比较大，往往结合多个核小体，因此在染色质断裂的时候，不太适合使用酶法的处理方式，建议使用超声断裂染色质的方法。

带你读懂ChIP-seq的优点和局限

带你读懂ChIP-seq的优点和局限ChIP-seq或染色质免疫沉淀和测序是一种技术，允许研究人员通过在全基因组范围内绘制蛋白质-DNA相互作用和表观遗传标记来理解转录调控。

与以前的方法相比，ChIP-seq具有几个优点，例如ChIP 芯片，但与所有技术一样，ChIP-seq也有其局限性。

ChIP-seqChIP-seq是下一代测序的首批应用之一，该测序是在2000年代中期开发的。

其前体ChIP芯片通过与微阵列杂交分析片段，显示DNA-蛋白质相互作用。

使用下一代测序的ChIP-seq可以直接测序目标片段，而不是将它们杂交在阵列上。

简而言之，ChIP-seq涉及用甲醛处理细胞以在体内将结合蛋白与DNA交联。

然后使用超声处理将染色质剪切成200-600bp范围内的较小片段。

对靶蛋白特异的抗体用于免疫沉淀DNA-蛋白质复合物。

最后一步涉及逆转交联和DNA的释放，其在任何下一代平台上测序以鉴定蛋白质结合的序列。

ChIP-seq的优点与ChIP芯片相比，ChIP-seq技术可实现单碱基对的分辨率，更少的伪像，更好的覆盖范围和更大的动态范围。

优异的碱基对分辨率是最重要的优势之一，因为阵列在杂交过程中具有基本的不确定性，这限制了分辨率。

虽然ChIP芯片的分辨率因阵列而异，但通常在30-100bp范围内，但ChIP-seq具有单核苷酸分辨率。

绕过杂交过程对ChIP-seq有额外的好处。

在ChIP芯片的杂交过程中，不完全匹配的序列之间可能存在交叉杂交，这增加了信号噪声。

由于直接测序方法，ChIP-seq本质上不受这些噪声源的影响。

但是，可以使用ChIP-seq接收一些GC偏差。

与其他方法相比，ChIP-seq提高了分辨率。

阵列的强度信号可能不完全是线性的，并且阵列的动态范围限制在饱和点之外。

这导致它们在ChIP芯片中被遮挡，但不是ChIP-seq实验。

与ChIP芯片的检测下限相反，ChIP-seq没有有限的动态范围。

(整理)ChIP-seq数据分析流程_上海丰核信息科技有限公司.

ChIP-seq技术及数据分析宣传画册一、ChIP-seq技术概览ChIP-seq技术是一种以研究蛋白质与染色体DNA的相互作用为主要目的的高通量数据分析手段，其实验部分主要包含染色质免疫共沉淀（ChIP）样本制备和深度测序（Deep Sequencing）两个部分。

1、ChIP实验基本步骤（1）甲醛交联整个细胞系（组织），即将目标蛋白与染色质连结起来；（2）分离基因组DNA，并用超声波将其打断成一定长度的小片段；（3）添加特异性识别目标蛋白质的抗体，该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀免疫结合复合体；（4）去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本，准备测序。

2、深度测序当我们准备好片段化的DNA样本后，需要通过专业的高通量reads测序仪进行碱基读取的步骤。

之后把这些reads回贴到参考染色体序列上从而间接确定蛋白因子在染色体上的位置分布以及每个结合位点上蛋白因子的结合强度。

二、ChIP-seq数据的生物信息学分析流程展示ChIP-seq数据的生物信息学分析步骤包括：测序饱和度估计、测序后reads的质控和筛选、cleanreads比对、蛋白因子结合位点检测、结合位点周围候选靶基因注释、样本组间数据比较和差异结合位点的确定、特定基因的功能富集分析、个性化下游分析。

三、应用领域四、ChIP-seq数据分析在医学研究中的应用通过对ChIP-seq数据进行系统化的生物信息学分析，我们能够获得如下结果：1、通过检测疾病相关转录调控原件确定该转录调控原件的下游靶基因集合或观察病灶部位内部的表观遗传状态异常；2、比较疾病样本和正常样本中转录调控原件在染色体上结合位置的差异，选取疾病特异性的转录调控原件结合位点，观察这些位点周围的基因，缩小候选研究基因范围；3、结合基因表达谱数据和GSEA分析技术判断转录调控原件对下游靶基因的调控方向（激活基因表达为正调控，抑制基因表达为负调控）；4、通过检测转录调控原件结合位点周围的基序特征（Motif），预测与该转录调控原件发生共定位的潜在转录因子，通过数据挖掘尝试找出其他与疾病发生相关的调控基因；5、基于GeneOntology和基因功能分类知识库，帮助我们了解候选研究基因和共调控因子的具体功能，从而了解目标转录调控原件在疾病发生过程中所起的生物学作用，帮助我们认识疾病发生过程的分子机制。

多个基因的共同转录因子检测方法

多个基因的共同转录因子检测方法随着生物技术的不断发展，人们对基因调控的研究日益深入，共同转录因子在基因调控中扮演着至关重要的角色。

共同转录因子是一类能够同时调控多个基因转录的蛋白质，它们通过结合到多个基因的启动子区域，协同调控这些基因的表达。

发展一种可靠、高效的方法来检测多个基因的共同转录因子对于揭示基因调控网络的机制具有重要意义。

本文将介绍一些常用的多个基因的共同转录因子检测方法，并探讨它们的优缺点。

一、ChIP-seq技术ChIP-seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）技术是目前最为常用的转录因子结合位点检测方法之一。

该方法通过将特定的抗体与转录因子结合后，利用染色质免疫沉淀技术富集转录因子结合的染色质片段，再结合高通量测序技术对富集的染色质片段进行测序，从而获得转录因子结合的基因组位置信息。

在多个基因的共同转录因子检测中，研究人员可以利用ChIP-seq技术分析多个基因启动子区域上的转录因子结合情况，进而筛选出共同调控这些基因的转录因子。

ChIP-seq技术还可以通过比较不同条件下的样品来鉴定共同转录因子的动态结合情况，进一步揭示基因调控的机制。

ChIP-seq技术也存在部分缺点，如对实验条件的要求较高、数据分析复杂等。

二、RNA-seq技术除了ChIP-seq技术外，RNA-seq技术也可以用于检测多个基因的共同转录因子。

RNA-seq技术是一种利用高通量测序技术对RNA进行定量和质量分析的方法，可以全面、准确地检测基因的表达情况。

研究人员可以利用RNA-seq技术分析在不同条件下多个基因的表达模式，通过寻找共同上调或下调的基因来筛选可能存在的共同转录因子。

RNA-seq 技术还可以通过分析基因的剪接异构体来揭示共同转录因子对于基因的剪接调控作用。

RNA-seq技术在检测转录因子结合位点以及动态结合情况方面相对ChIP-seq技术来说存在局限性。

chip seq通路富集分析流程

chip seq通路富集分析流程英文版Chip Seq Pathway Enrichment Analysis Workflow1. IntroductionChromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-Seq) is a powerful technique used to study protein-DNA interactions in vivo. It involves immunoprecipitating DNA fragments bound to a specific protein, followed by sequencing to identify the DNA sequences present. ChIP-Seq data analysis often requires enrichment analysis to understand the biological processes and pathways affected by the protein of interest.2. Alignment and Quality ControlThe raw sequencing data is first aligned to the reference genome using bioinformatics tools such as Bowtie or BWA. Alignment quality is assessed using metrics like mapping rate and read distribution.3. Peak CallingPeak calling identifies regions of the genome where the protein of interest binds. Tools like MACS2 or HOMER are commonly used for this purpose. The identified peaks are annotated with respect to known genes and genomic features.4. Pathway Enrichment AnalysisThe annotated peaks are then used for pathway enrichment analysis. This involves mapping the peaks to known biological pathways and identifying those that are significantly enriched. Tools like GREAT or ChIPseeker can be used for this analysis.5. Interpretation and VisualizationThe enriched pathways are interpreted to gain insights into the biological processes affected by the protein of interest. Visualization tools like IGV or UCSC Genome Browser help in visualizing the ChIP-Seq data and the enriched pathways.6. ConclusionThe Chip Seq Pathway Enrichment Analysis Workflow provides a systematic approach to understanding the biological implications of ChIP-Seq data. By integrating alignment, peakcalling, and pathway enrichment analysis, it offers a comprehensive view of the protein-DNA interactions studied.中文版芯片测序通路富集分析流程1. 引言染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）是一种强大的技术，用于研究体内的蛋白质-DNA相互作用。

chip-seq实验质控步骤 -回复

chip-seq实验质控步骤-回复Chip-seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）是一种用于研究染色质上蛋白质与DNA相互作用的技术。

在进行Chip-seq实验之前，需要进行一系列的质控步骤，以确保实验结果的准确性和可靠性。

下面将详细介绍chipseq实验质控的步骤。

1. 样本制备和处理：在进行chipseq实验之前，首先需要准备和处理样本。

这包括细胞培养、组织切片或从体内收集样本等。

样本处理的关键是要保证DNA和蛋白质的一致性，避免样本中的污染和降解。

2. 交联和固定：细胞或组织中的染色质和蛋白质需要通过交连（cross-linking）来固定。

通常使用甲醛交联，以使蛋白质与DNA的相互作用被稳定下来。

这样可以防止在后续的实验过程中蛋白质和DNA的分离。

3. 组织裂解和核提取：交联后，需要对细胞或组织进行裂解以释放染色质。

这需要使用特定的裂解缓冲液，并且应该充分裂解细胞或组织。

裂解结束后，需要用溶解裂解液中的核酸结合蛋白质（例如鞘氨醇）来固定DNA。

4. DNA切碎：为了进行chipseq实验，需要将DNA切碎成适当的片段。

通常使用超声波或酶来切割DNA。

切割后的DNA片段应该具有合适的长度，以便与后续步骤中的抗体结合。

5. 免疫沉淀（immunoprecipitation）：在免疫沉淀步骤中，需要使用适当的抗体来沉淀与之结合的蛋白质-DNA 复合物。

这需要在适当的温度和时间下进行，以确保抗原和抗体的结合。

6. 沉淀后的DNA回收：在沉淀后，通过去除非特异性结合的DNA和蛋白质，可以有效地从免疫沉淀复合物中回收纯化的DNA。

这通常通过使用蛋白酶K对复合物进行消化，并使用盐溶液、马尿酸和异丙醇等来沉淀DNA。

7. DNA测序：回收的DNA需要进行测序以确定DNA片段的序列。

目前，高通量测序技术（如Illumina测序）被广泛应用于chipseq实验。

Chip-Seq项目结题报告

3 / 231 生物实验流程染色体免疫共沉淀（ChIP, chromatin immunoprecipitation）是一种用于研究蛋白质与DNA的体内相互作用的经典实验技术。

采用特异性抗体将目的蛋白进行免疫沉淀，由此可以把目的蛋白所结合的基因组DNA片段也富集下来。

通过与高通量测序技术的结合，对ChIP后的DNA产物进行测序分析，从全基因组范围内寻找目的蛋白的DNA结合位点，以高效率的测序手段得到高通量的数据结果。

1.1 ChIP免疫沉淀实验流程目前主要有两种不同的ChIP实验方法，大致流程如下（均以细胞样品的处理过程为例）：Cross-liking Chromatin Immunoprecitation (X-ChIP)1.甲醛处理细胞，使 DNA-protein 的相互结合作用被交联固定。

2.裂解细胞，得到全细胞裂解液。

3.超声处理，将基因组 DNA 打断至 100-500bp。

4.抗体免疫沉淀：在细胞裂解液中加入一抗和 beads，并进行孵育。

5.采用合适的实验条件进行洗脱，并解交联。

6.通过 qPCR 对 ChIP 结果进行验证。

7.准备好的 ChIP 后的 DNA 样品可以用于 ChIP Sequencing 建库。

Native Chromatin Immunoprecipitation (N-ChIP)1.通过非变性的方式得到核裂解液。

2.微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease）消化染色质，得到单核小体或核小体寡聚体。

3.抗体免疫沉淀：在细胞裂解液中前后加入一抗和 beads，并进行孵育。

4.DNA 分离。

5.通过 qPCR 对 ChIP 结果进行验证。

6.准备好的 ChIP 后的 DNA 样品可以用于 ChIP Sequencing 建库。

1.2 ChIP文库构建流程文库构建流程主要有以下步骤：1.DNA片段末端修复、3’端加A碱基，连接测序接头（详细步骤请参考Illumina公司Paired-End DNA SamplePrep kit）。

转录因子ChIP-seq数据分析方法进展

转录因子ChIP-seq数据分析方法进展一、转录因子ChIP-seq数据分析方法概述转录因子ChIP-seq数据分析是一种重要的生物信息学技术，它通过分析转录因子与DNA的相互作用来揭示基因表达调控的分子机制。

ChIP-seq技术自2009年被引入以来，已经在基因组学研究中发挥了巨大的作用。

本文将探讨转录因子ChIP-seq数据分析方法的进展，分析其重要性、挑战以及未来的发展方向。

1.1 ChIP-seq技术的核心原理ChIP-seq技术的核心原理是利用染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）技术结合高通量测序技术（Sequencing）。

通过这种方法，研究人员可以识别转录因子在基因组中的结合位点，进而分析其对基因表达的调控作用。

ChIP-seq技术的关键步骤包括：样品准备、染色质免疫沉淀、DNA片段的纯化和测序。

1.2 ChIP-seq技术的应用场景ChIP-seq技术的应用场景非常广泛，涵盖了从基础生物学研究到临床诊断的多个领域。

主要应用包括：- 基因表达调控研究：通过分析转录因子的结合位点，研究其对基因表达的调控机制。

- 疾病机制研究：识别疾病相关基因的转录因子结合位点，揭示疾病的分子机制。

- 药物靶点发现：通过分析药物对转录因子结合位点的影响，发现新的治疗靶点。

- 细胞分化和发育研究：研究不同细胞类型或发育阶段转录因子的结合模式，揭示细胞分化和发育的调控机制。

二、转录因子ChIP-seq数据分析的关键技术转录因子ChIP-seq数据分析的关键技术是将测序数据转化为生物学意义的信息，这需要多步骤的数据处理和分析。

以下是一些关键技术：2.1 数据质量控制数据质量控制是ChIP-seq数据分析的第一步，目的是确保测序数据的准确性和可靠性。

常见的数据质量控制技术包括：- 测序错误校正：通过比对原始测序数据与参考基因组，校正测序过程中产生的误差。

- 重复序列过滤：去除测序数据中的重复序列，提高数据的特异性。

ChIP常见问题汇总

ChIP常见问题汇总1． ChIP是什么？答：染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，简称ChIP）是研究体蛋白质与DNA相互作用的一种技术。

它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体蛋白因子与基因组DNA结合的状况。

2． ChIP有哪些应用？答：近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用，发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用；从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用，发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用；从研究启动子区域的组蛋白的修饰，发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。

3． ChIP技术的原理？答：生理状态下把细胞的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。

染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA 的纯化，以及DNA的鉴定。

因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。

4．做ChIP试验，必须做甲醛固定么？答：不一定，视样品及试验方案而定。

做甲醛固定的为X-ChIP，而不需要固定的为N-ChIP。

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞组分的重新分布。

甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。

甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

5．为什么必须将DNA切碎至少于1000bp大小（大约3个核小体~400-500bp）?答：为确保ChIP实验有良好精度。

若您的平均片段长度大于1000bp，您将会分离获得包含您目标序列的DNA，但所要研究的蛋白会离您目标序列有700个核苷酸的距离。

6．为什么使用鲑鱼精子DNA来封闭琼脂糖珠子？为什么我的样品中鲑鱼精子DNA不会发生PCR反应？答：鲑鱼精子用于降低降低染色质DNA与琼脂糖珠子的非特异性结合。

ChIP-Seq分析常见问题集锦

ChIP-Seq分析常见问题集锦染色质免疫共沉淀测序（ChIP-Seq）是指对染色质免疫共沉淀（ChIP）获得的DNA片段进行大规模测序，并能把所研究蛋白的DNA结合位点精确定位到基因组上。

Roche GS FLX Titanium 、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4 这3种测序技术均可以用于ChIP-seq，其中采用Illumina Solexa GA IIx进行ChIP-Seq已有较多文献报道。

ChIP-Seq技术高质量、高通量、低成本的数据产出，为表观遗传组学研究奠定了技术基础。

研究者可以在以下几方面展开研究：（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；（2）检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；（4）CTCF转录因子研究。

ChIP-Seq有什么样品要求？答：（1）请提供浓度≥10 ng/ul、总量≥200 ng、OD260/280为1.8~2.2的DNA样品；若单次ChIP后DNA量不够，建议将2~3次ChIP的DNA合并在一起。

（2）请提供DNA打断时检测胶图，要求打断后DNA电泳主带在200-500bp范围内；请对于ChIP 获得DNA设计引物进行QPCR验证和定量，能够提供检测位点的检测报告。

附阳性和阴性对照。

（3）样品请置于1.5 ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。

在运输前将所有样品管固定于50ml带盖离心管中，再将50ml管放在封口袋中。

ChIP-Seq相比ChIP-chip有哪些优势？答：第一，ChIP-Seq 能实现真正的全基因组分析。

目前所能获得的芯片上固定的探针只能代表全基因组部分序列，所获得的杂交信息具有偏向性；第二，对于结合位点分析，ChIP-Seq 通过寻找“峰”，结合分辨率可精确到10~30 bp，而芯片上探针由于长度所限，无法精确定位，即使目前最高水平的商业芯片都无法提供可与ChIP-Seq 媲美的分辨率；第三是所需样本数量。

ChIP-seq核心分析下游分析

ChIP-seq核⼼分析下游分析【怪⽑匠⼦整理】ChIP-seq【核⼼分析下游分析】Core Analysis : Peak detection: thenCore Analysis : Quality Control: for the raw reads (after )Core Analysis : Gene-level annotation of peaks (Exons/introns/promoters/downstream extremities) and genomic distribution using Core Analysis : Quick promoters summary of peaks usingCore Analysis : Create data tracks for the UCSC Genome BrowserVisualize peak locations in UCSC Genome Browser usingCreate a read density track for the UCSC Genome Browser usingCore Analysis : Use if you want to run the 3 first steps of the Core Analysis (QC, Split in reads-Peak detection, Gene annotation) fast with a single command.Extended Analysis : Nongenic annotation usingExtended Analysis : RNAGenes annotation usingExtended Analysis : Motif discoveryDe novo regulatory element discovery using andFind peak matches to known transcription factor binding sites usingExtended Analysis : Pathways analysisLook for enriched pathways using andFind pathway matches to peaks/genes usingExtended Analysis : Evaluate conservation of peaks usingExtended Analysis : Estimate average read density profiles in genes or peak regions usingExtended Analysis : Extract (maximum/average) reads count for peak regions across multiple ChIP-seq datasets usingExtended Analysis : Cluster and visualize the detected peak regions usingExtended Analysis - Compare datasets : Compare two lists of peaks; (e.g., Which peaks overlap ? Are there any peaks in the first list with no overlap in the second one?)Extended Analysis - Compare datasets : Compare two lists of RefSeq genes (e.g., Which genes are common in the two lists?) Extended Analysis - Compare datasets : Make a similarity coefficient matrix (based on ) to see which TFs are similar in terms of peaks overlapping, usingExtended Analysis - Compare datasets : Make one matrix for each genepart (promoters/exons/introns/distal etc) from multiple peak files in order to find e.g., genes promoters where most of the TFs bind.Other supplementary tools can be found。

转录因子 chip-seq金标准

ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）是一种用于研究转录因子与基因启动子区域相互作用的实验方法。

它通过免疫沉淀技术富集与特定转录因子结合的DNA片段，然后进行高通量测序，从而揭示转录因子在基因组中的分布和结合模式。

ChIP-seq已经成为研究转录因子功能和调控网络的金标准。

以下是ChIP-seq实验的主要步骤：
1. 染色质免疫沉淀：通过使用特定抗体识别并结合目标转录因子，将其与染色质DNA 一起沉淀下来。

2. 逆转录：将沉淀的DNA进行逆转录，生成cDNA文库。

3. 高通量测序：将cDNA文库进行高通量测序，获得测序数据。

4. 数据分析：通过生物信息学方法，将测序数据与基因组参考序列比对，计算转录因子与基因启动子区域的结合概率。

5. 结果解读：根据结合概率，推断转录因子与基因启动子区域的相互作用，进而分析转录因子的功能和调控网络。

ChIP-seq实验的优点：
1. 高灵敏度：即使转录因子在基因组中的表达水平较低，ChIP-seq也能有效地检测到其结合位点。

2. 高特异性：由于使用特定抗体识别目标转录因子，ChIP-seq实验具有较高的特异性。

3. 全局视角：ChIP-seq可以揭示转录因子在整个基因组中的结合模式，有助于研究转录因子在不同生理条件下的功能。

4. 适用于不同类型生物：ChIP-seq实验不仅适用于真核生物，还可以应用于原核生物。

ChIP-seq数据分析学习笔记

ChIP-seq数据分析学习笔记因为有朋友看了这两天发的笔记。

私信我说有些看不出来，为什么一个搞生物的要做数据分析。

所以我决定打乱一下进程，先将后面的在生物领域的应用分享给大家。

我就以SRA数据库中一个癌细胞的ChIP-seq数据做展示。

ChIP-seq的数据是以read的方式存储的。

一个数据集大约翰几百万个read。

对于ChIP-seq数据的分析主要应用到包GAlignments，这个包要调用python下的Bioconductor至于怎么用这个包将Raw数据转化成可以操作的read我在今后会分享给大家，如果感兴趣的也可以一些生物信息学论坛找人交流。

我们先看看一个可以分析的ChIP-seq数据长什么样子start(reads)[1]#查看第一个read的位置end(reads)[length(reads)] #查看最后一个read的位置coverage(reads) #查看测序的覆盖度在测序完成之后read是散在分布在基因组上的，但是呢。

如果是结合了蛋白质的基因片段，在建库是就会被富集。

被富集的片段，在测序中会被多次测，产生多个重叠的信号。

而在将read比对到基因组的时候。

会引起read覆盖基因组时引起coverage产生一个峰值（Peaks）。

这些峰值有两个关键的参数，一个是峰的强度，一个是峰在基因组上的坐标。

一个Peak数据大概长这样可以看到刚才说的两个重要的参数就是强度：score，位置rangesmax_idx <- which.max(score(peaks))="">当我们找到了这个最强的峰的位置怎么锁定他在基因组上的位置呢？我们这时候可以用两个函数chrom(),rangs()分别锁定其在染色体上的位置和在染色体上的区段max_peak_chrom <->max_peak_range <->我们可以看一下输出：综合来看我们可以看到我们的峰read是在十一号染色体，从114049848到114050447覆盖600bp左右但是呢，我们只是选了最高的峰，那么在一个测序结果里往往会有多个峰。

[实验方法篇]Chip实验常见问题汇总

[实验方法篇]Chip实验常见问题汇总1：ChIP实验研究转录因子，调控因子结合的DNA和组蛋白结合的DNA操作上最大的区别是什么？ChIP实验中由于组蛋白在染色质中表达相对较高，也较稳定，所以组蛋白研究起来更为容易，一般需要105-106个细胞即可完成一个ChIP反应。

转录调控因子表达水平很低，往往是瞬时表达，起始样本量（细胞，组织）要是组蛋白的10倍，一般每个反应至少需要107个细胞。

另外有些转录因子比较大，往往结合多个核小体，因此在染色质断裂的时候，建议使用超声断裂染色质的方法。

因为酶法是化学处理，消化的位点往往比较均一，多是在核小体的连接处，酶消化有可能将核小体断裂的同时打断转录因子与DNA的结合。

2：ChIP实验中使用超声方法断裂染色质温度不易控制，可能会使蛋白变性，影响ChIP结果，有没有较好的优化方案？ChIP实验中超声的优化一般从如下几个方面考虑1不建议重复已发表的剪切方案而不进行优化。

当仪器不同于文献中所使用的仪器时，尤其如此。

2目前有各种超声破碎仪器，水浴和基于探头的。

在使用基于探头的超声破碎仪时，选择一个适用于您的样品体积的探头。

3在任何情况下，剪切参数都应当根据您的样品体积、细胞密度和细胞类型而优化。

4优化应当包括功率设置（超声时间vs. 间隙时间/休息时间）以及获得长度为200 –1000 bp的DNA片段所需的剪切循环数，每个优化实验只优化一种参数；5注意时间和功率设置。

过度破碎和太高功率设置会损害在免疫沉淀步骤中的表位。

降低ChIP信号。

6始终保持裂解液冰冷，间断超声，而不是连续，因为超声处理产生热量会使染色质变性。

7在超声破碎过程中避免气泡。

泡沫会导致蛋白质的表面变性，可能使染色质损失在气泡中。

为了避免这种情况，一开始设为较低功率，再逐步提高。

8在优化条件时，每个超声破碎循环后通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段的长度。

剪切不足所产生大的不溶蛋白质:DNA:RNA复合物可能堵塞琼脂糖凝胶的孔，并延缓电泳过程。

一篇文章学会ChIP-seq分析（下）

一篇文章学会ChIP-seq分析（下）写在前面：《一篇文章学会ChIP-seq分析（上）》《一篇文章学会ChIP-seq分析（下）》为生信菜鸟团博客相关文章合集，共九讲内容。

带领你从相关文献解读、资料收集和公共数据下载开始，通过软件安装、数据比对、寻找并注释peak、寻找motif等ChIP-seq分析主要步骤入手学习，最后还会介绍相关可视化工具。

第五讲：测序数据比对比对就很简单的了，各种mapping工具层出不穷，我们一般常用的就是BWA和bowtie了，我这里就挑选bowtie2吧，反正别人已经做好了各种工具效果差异的比较，我们直接用就好了，代码如下：## step5 : alignment to hg19/ using bowtie2 to do alignment## ~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2-build ~/biosoft/bowtie/hg19_index /hg19.fa~/biosoft/bowtie/hg19_index/hg19## cat >run_bowtie2.shls *.fastq | while read id ;doecho $id#~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2 -p 8 -x ~/biosoft/bowtie/hg19_index/hg19 -U $id -S ${id%%.*}.sam 2>${id%%.*}.align.log;# -F 0x4 remove the reads that didn't matchsamtools sort ${id%%.*}.bam ${id%%.*}.sort ## prefix for the output# samtools view -bhS a.sam | samtools sort -o - ./ > a.bamsamtools index ${id%%.*}.sorted.bamdone这个索引~/biosoft/bowtie/hg19_index/hg19需要自己提取建立好，见前文初步比对的sam文件到底该如何过滤，我查了很多文章都没有给出个子丑寅卯，各执一词，我也没办法给大家一个标准，反正我测试了好几种，看起来call peaks的差异不大，就是得不到文章给出的那些结果！！一般来说，初步比对的sam文件只能选取unique mapping的结果，所以我用了#samtools view -bhS -q 30，但是结果并没什么改变，有人说是peak caller这些工具本身就会做这件事，所以取决于你下游分析所选择的工具。