本科实验4 PFC试验

灌注小室
制作小室
取洁净载玻片两张
实
验
流
用双面胶在中间和两端各粘一条，将 两张玻片黏在一起即成2个小室
程
配制小室灌注液
实
实验管（μl） 对照管 （μl）
验
Hank’s液
500
600
流 脾细胞悬液
100
100
程
15%SRBC
100
100
补体
100
-
混匀，灌注小室，石蜡封口，37度，40min.
灌注
实验四
一、PFC实验 二、免疫学实验考核
7A208 蒋朋飞
一、实验目的
掌握PFC试验的基本原理及实验方法； 了解PFC试验的意义。
二、实验原理
➢ 抗原刺激B细胞活化分泌特异性抗体 ➢ 抗原抗体复合物经典途径激活补体系统
小鼠B细胞溶血空斑形成试验
➢ 溶血空斑试验是基于抗原抗体反应可活化补体，溶 解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外试验 方法，用于检测动物的抗体产生功能的经典的试验。
3、制备小室：用双面胶将2张载玻片两端及中间粘起，形成两 个小室
4、制备灌注液：
试管1：Hank’s液500 μl＋脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋补体100 μl
试管2：Hank’s液600 μl＋脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl
5、灌注小室: 2管分别灌注2个小室，每个小室约100 μl，石蜡 密封小室的两侧
实
实验组
验
流
程
对照组
三、材料与器材
1、小鼠，5％和15％SRBC，补体，Hank’s液 2、解剖器械，试管，载玻片，石蜡，100目不锈钢
网，双面胶带 3、37℃培养箱
四、实验方法
1、免疫小鼠：4天前0.5ml的5％SRBC腹腔注射免疫小鼠
2、制备单个脾细胞悬液：颈椎脱臼处死小鼠，取脾在不锈钢 网上研磨（8ml Hank’s液），1000 rpm离心5 min，去上清， 加5 ml Hank’s液悬浮脾细胞
6、 孵育： 37℃培养箱中40min
五、注意事项
（1）研磨完成立刻冲洗净钢网 （2）离心时要成批进行 （3）制作小室要注意防止手指污染，产生气泡 （4）各试管及小室要做好标记 （5）小室注入液体时要一气呵成，灌满，不要留有气泡； （6）小室边缘需用石蜡封严； （7）37℃孵箱孵育时，必须放平，不可倾斜；
➢ 将SRBC免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一定 量的SRBC混合，在补体参与下，使抗体产生细胞周 围的SRBC溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主 要用于测定B细胞抗体产生能力。
B细胞 浆细胞
SRBC 免疫小鼠
4d后
实
脾细胞悬液的制备
验
流 处死小鼠，取脾脏，研磨，制备单个脾细胞悬液
程
Байду номын сангаас
脾细胞悬液 + 15%SRBC + 补体
六、实验结果
计数溶血空斑数，1个溶血空斑代表1个抗体 形成细胞。
区分： 溶血空斑：圆形暗区，折光性差，边缘不整齐。 气泡：边缘整齐，折光性好。
七、实验结论
结果：
实验组出现无数个透明的溶血空斑，而对照组无。 溶血空斑边缘不规则，而气泡透亮、边缘规则。
实验组
对照组
气泡 空斑