胞内流式检测参考因素

流式细胞术胞内因子检测的关键控制因素

前言：

由于胞内分析步骤复杂，涉及变异因素多，可能会出现结果不稳定，较难重复等问题。我们提出这些分析关键因素，希望能帮助大家排除实验过程中一些问题，这些控制因素不仅适用于细胞因子分析，也可扩展到其他细胞生物学研究领域，如胞内信号传导，凋亡等。

1、刺激与收获细胞

许多胞内与胞外蛋白的表达的调控都与细胞激活有关，细胞因子更为突出，因为通常情况下，未刺激的白细胞不表达细胞因子或表达量极微无法检测，研究者必须采用体外激活以刺激细胞因子的表达。多克隆激活剂可以诱导多种细胞因子分泌细胞，这些细胞经荧光染色可在流式细胞仪上定群检出。使用蛋白转运抑制剂至关重要因为它有助于细胞因子聚集，提高检出率。每个研究者都应根据实验系统慎重选择激活方法（刺激剂类型、反应时间曲线等）。

●蛋白转运抑制剂的选择

蛋白转运抑制剂可以通过增强胞内细胞因子聚集因而使胞内染色信号增强。常用蛋白转运抑制剂有两种：

Monensin , 一种离子载体，可以破坏跨膜离子梯度。

Brefeldin A ，一种真菌代谢物，可以干扰囊泡自粗面内质网至高尔基体的转运。

研究者应依据研究目的选择适宜的蛋白转运抑制剂。

2、 Fc受体阻断

使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色。在小鼠可以应用纯化的抗小鼠

CD16/32（Clone2.4G2）直接作用于FcγII/III受体。在大鼠可以用纯化的抗大鼠CD32 直接作用于Fcγ受体。在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。

3、细胞表面荧光染色

特异的荧光标记抗体与细胞孵育标记细胞表面抗原,最好用含NaN 3及蛋白（FBS或BSA）的染色缓冲液稀释抗体。可按 PBS+1%FBS+0.1%NaN 3 pH7.4，配制洗涤缓冲液。

4、细胞固定及通透

细胞胞内染色前必须固定通透，细胞通透同时或之前必须固定以保持细胞结构的完整性。固定剂主要成分为多聚甲醛，通透剂主要成分为皂素。这是两个比较重要的试剂，实验中最好设置阳性对照以验证这两个试剂的有效性。

5、荧光结合抗体胞内染色

胞内抗原染色取决于正确选用及确认与固定通透过程相容的特异性单抗，这些可供选择的单抗有多种形式，FITC，PE，APC，为研究者进行多色分析提供可能。每一抗体都经过特殊测试确保其对胞内抗原染色最佳适于流式细胞分析。胞内染色的质量极大程度取决于每个荧光标记抗体的最适反应浓度，应尽量选择预先滴定好的抗体以减少实验操作时间，保证细胞因子的有效

检测。

●荧光素的选择

会有最强荧光信号。

●检测相对低表达细胞因子（如 IL-4）时，应选用 PE 或 APC。

●单染某一细胞因子时最好也选用 PE 或 APC。

●同时染多种细胞因子时，弱表达的应选用 PE 或 APC。FITC 标记最好用于高表达细胞因子（如TNF-α）。

◆抗细胞因子抗体滴度的调试

固定和通透后的细胞会出现与荧光抗体相关的较高的非特异染色，因此最好选用预先调试到适宜滴度的抗体进行胞内染色。胞内染色抗体适宜滴度的变化范围很大，从 0.5μg/test 低至0.015μg/test。

6、胞内抗原染色对照

◆纯化抗体阻断对照

固定通透前，使用同种纯化抗体与细胞孵育后再用荧光标记抗体染色作为阻断对照以区分细胞因子特异性染色由于非特异背景染色。我们发现 5.0μg/test 纯化抗体可以完全阻断细胞因子特异性染色。

◆重组细胞因子蛋白阻断对照

荧光标记细胞因子抗体染色前使用纯化重组细胞因子抗体可以阻断细胞因子染色，区分特异染色与背景染色。我们发现 0.25μg/test 纯化重组抗体可以完全阻断细胞因子特异性染色。注意，不是所有重组细胞因子蛋白都可以用于胞内染色阻断。某些重组细胞因子会增加样本中所有细胞的非特异染色（如重组小鼠与人的 IL-12 [ p40 / p70 ] 和 IFN-γ），这种情况下最好采用两种以上细胞因子特异性抗体或其他对照（如比较激活与静止群体）以确定细胞因子的表达与检测相符。

◆荧光标记的同型对照

与特异性无关的荧光标记的 Ig 同型对照染色显示了特定荧光标记细胞因子抗体固有的非特异染色，可以作为阴性对照。从抗细胞因子抗体染色中减去同型对照染色即可确定细胞因子阳性细胞百分数。我们推荐使用与细胞因子抗体浓度相同的同型对照。

◆胞内细胞因子阳性对照

已知细胞因子阳性率细胞群体是非常有用的实验染色对照。它可以确证染色过程及使用的细胞因子抗体的特异性。此外还可用于调试实验细胞因子抗体染色/阻断的适宜浓度。我们推荐实验中

每个要研究的细胞因子都采用对照群体，如果实验室自行制备对照细胞群体，应预筛其类型与细胞因子表达水平。最好选用商品化试剂。