胞内流式检测参考因素

合集下载

流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展

流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展【摘要】：细胞因子具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等多种生物学功能。

因此，细胞因子的研究成果为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学基础，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫性疾病等，具有非常广阔的应用前景[1]。

随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。

流式细胞术也成为了检测单细胞水平细胞因子表达能力的重要检测方法。

本文针对流式细胞术在胞内细胞因子检测中的研究进展作一综述。

【关键词】：流式细胞术；细胞内；细胞因子；检测技术引言：细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，能介导细胞之间的相互作用，并在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中起到重要作用。

细胞因子的检测方法一般分为生物学测定法、分子生物学测定法及免疫学测定法。

而目前用于检测单个细胞特定细胞因子表达的手段则包括：多参数流式细胞术，酶联免疫斑点法ELISPOT[2]、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR等生物分析技术。

相较于其它的检测方法，流式细胞术在细胞内细胞因子的检测上具有高效、简便、适应性广等优势。

一、流式细胞术的概述流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。

FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性，也可以定量，尤其适用于大量样品检测，已在临床检验工作中得到广泛应用。

流式细胞仪（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）的检测分析已涉及到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、血液学、微生物学等学科。

流式细胞报告单参考值

流式细胞报告单参考值流式细胞报告单是临床医学中常用的一种检测手段，用于分析和诊断疾病。

流式细胞测定技术是用于检查血液、骨髓、淋巴结、脾脏等样品中的细胞组成和数量的一种分析方法。

在流式细胞测定中，细胞样品经过特殊处理后，通过流过一系列光学器件的高速水平线流柱而被分离、分析、计数和分类，最终得出细胞类型和相应的数量。

概述1. 标本信息（样本号、姓名、性别、年龄、检测时间、医院、科室、医师）；2. 细胞分析结果（白细胞计数、百分比、细胞计数）；3. 表面标记结果；4. 细胞染色体分析（如骨髓细胞分析）。

细胞分析结果1. 白细胞计数（单位：×10^9/L）：正常值范围：成年男性：4.0-10.0×10^9/L参考值：低于正常值范围：百叶片样细胞增多、骨髓抑制、炎症、药物影响等。

高于正常值范围：感染症、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征等。

2. 百分比：百叶片样细胞：0-5%淋巴细胞：20-40%嗜碱性粒细胞：1-3%百叶片样细胞增多：过敏性疾病、传染性疾病、某些药物影响等。

嗜酸性粒细胞增多：过敏性疾病、寄生虫感染等。

淋巴细胞增多：感染症、慢性淋巴细胞白血病等。

嗜碱性粒细胞增多：特发性嗜碱性粒细胞增多症等。

1. CD45：白细胞常见的细胞表面分子，用于区分淋巴细胞、单核细胞和其他细胞。

2. CD19：B细胞的特定标记。

细胞染色体分析是一种用于分析染色体的流式细胞测定技术。

它是通过在细胞中利用染色体取样来确定染色体的组成和结构。

细胞染色体分析在诊断生殖异常、癌症、细胞遗传病和先天性畸形等方面发挥着重要作用。

流式细胞报告单中的细胞染色体分析通常包括：1. 骨髓细胞分析：它是一种检查骨髓细胞中染色体的分析方法，可帮助确诊白血病、骨髓增生异常综合征等血液疾病。

2. 染色体核型分析：它是一种检查染色体组成的分析方法，也就是确定染色体数量和结构的分析方法。

它常用于分析先天性染色体畸变和癌症等病症。

流式细胞检测内容

流式细胞检测内容
流式细胞检测是一种用于分析单个细胞的技术，通过流式细胞仪可以对细胞进行高通量的检测和分析。

流式细胞检测可以提供关于细胞的多个参数的信息，包括形态、大小、表面标记物的表达水平和分布、细胞周期状态等等。

流式细胞检测的内容主要包括以下几个方面：
1. 细胞计数和活力分析：通过测量细胞数量来评估样品中细胞的浓度，并通过活细胞染色来分析细胞的存活率。

2. 表面标记物分析：利用荧光标记的抗体或其他可特异性结合到细胞表面的分子来分析细胞表面标记物的表达水平和分布情况。

3. 细胞周期和DNA含量：通过核酸染色剂如荧光素染色剂或DNA特异性抗体来分析细胞的DNA含量、细胞周期和细胞增殖状态。

4. 免疫细胞功能分析：通过检测细胞的细胞因子分泌、胞外泌液和细胞内蛋白的表达来评估和分析细胞的免疫功能。

5. 细胞凋亡分析：通过核酸染色剂和特定的抗体来检测细胞凋亡的特征，如细胞核形态变化和磷酸化的蛋白质表达。

6. 细胞排序：根据细胞表面标记物的表达水平，可以使用流式细胞仪将特定类型的细胞分离、分选和收集。

通过对以上内容的分析，可以获得关于样品中细胞的多个参数和特性的信息，从而进行进一步的研究和分析。

流式细胞仪的参数

根据细胞dna含量的改变凋亡细胞dna的降解凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强使凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强使dna分裂成一些小片段这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外使凋亡细胞的分裂成一些小片段这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外使凋亡细胞的dna含量相对减少与荧光染料的结合减少与荧光染料的结合减少故细胞dna荧光强度降低
这一过程,成为流体动力学聚焦
FLOW CELL
Injector Tip
Sheath fluid
Hale Waihona Puke Fluorescence signals
Focused laser beam
excited electron ENERGY EMITS ENERGY AS LIGHT
ATOM
光路-荧光信号
每种荧光染料均有特定的激发波长,
2. FCM在免疫学中的应用:
(1) 各种免疫细胞的表面标志, 细胞分选等; (2) 细胞内各种细胞因子的检测;
(3) HLA群体分型; (4) 细胞增殖 CFSE法：活体染料羧基荧光素酰乙酸（Carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester， CFDA-SE）是一种非极性分子，可自由穿透细胞膜并在细胞内被酯酶转化成具有绿色荧光的氨基反应性羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）。CFSE只有当细胞发生分裂时，才会平均地分配到子代细胞中。因此 CFSE含量减少的细胞代表增殖的子代细胞。
Schematic representation of the Annexin V assay
FCM分析细胞周期和凋亡: 根据细胞DNA含量的改变凋亡细胞DNA的降解,凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强，使DNA分裂成一些小片段，这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡细胞的DNA含量相对减少，与荧光染料的结合减少,故细胞DNA荧光强度降低;DNA直方图上显示在G0/G1峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体或称亚G0/G1峰, 又称凋亡峰.通过DNA含量可同时研究凋亡细胞的周期特异性。

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。

在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。

目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。

随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。

下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。

早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。

尽管研究应用T 淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。

近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin 阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。

因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。

在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。

这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。

在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。

且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。

流式细胞分析技术

ü 光电倍增管（PMT）：
检测散射光和荧光；同时将光学信号转换成电脉冲信号。
14
滤光片
分色反光镜
15
PMT 滤光片
荧光和散射光检测系统
分色反光镜
激发光
激光聚光系统
16
数据处理系统
• 计算机及其软件组成 • 进行实验数据的分析、存储、显示
Photons/Detector (V)
光信号转化为电脉冲信号
特点：单细胞、快速、高通量、多参数、准确、灵敏
经典流式细胞仪（分析型和分选型）量化成像分析流式细胞仪质谱流式细胞仪
单激发光；4个荧光检测通道
经典流式细胞仪
双激发光；6个荧光检测通道
Coulter EPICS XL
6
量化成像分析流式细胞仪
美国merck millipore公司
质谱流式细胞仪
11
经典流式细胞仪
液流系统-液流聚焦原理
喷嘴
鞘液(Sheath）
喷嘴
荧光信号或侧向散射光
样本流
前向散射光单个细胞流
12
液流系统形成单个细胞流示意图
13
光路系统
ü 激发光：
常用的是空冷式的氩离子激光光源（488nm）；氦氖激光光源（633nm)；紫外光源
ü 各种光学镜片：
分色反光镜光束成形器；透镜滤光片：长通滤片；短通滤片；带通滤片
(一）标本采集、运输、保存和操作 l标本来源
l几乎所有组织细胞均可用于FCM检测 l免疫标本主要来源于外周血、骨髓、淋巴器官或组织等
l抗凝剂选择
l肝素钠(首选) lEDTA-Na2
l标本保存
标本制备
ü 外周血或骨髓样本

流式检测细胞内钙离子

用Furo-3/AM检测细胞内钙离子浓度FSC forward scatter 480nmSSC side scatter 480nmFL1 515-545nm 绿色FL2 564-606nm 橙色FL3 650- 红色1, 实验目的：检测不同细胞株中细胞质内钙离子浓度的差异，以检测钙离子浓度对癌细胞的迁移性的影响。

1，检测迁移性不同的FBJ-LL-H于S1-H 两株细胞中细胞内钙离子浓度的差异。

2，检测间质作用因子Stim1对细胞内钙离子浓度的影响包括对照组细胞，Stim1表达的几株单克隆细胞3，观察细胞ER钙离子释放之后的钙离子内流2, 样品处理：1.储备液配制F-127 5mg + 25uL DMSO 终浓度20%0.05mg Fluo-3/AM +22uL DMSOF127与Fluo-3/AM 以体积比1比1混合终浓度为2 μM2. 消化细胞3*10e6/mL-1*10e7/mL 细胞混悬液加入Fluo-3/AM，使之终浓度为4 μM3. 避光37℃45min4. PBS(-)清洗2遍5. 用PBS(-)重悬细胞，将浓度定为1*10e6/mL6. 当用毒胡萝卜素Thapsigargin（TG）排空细胞内质网钙池钙离子时, 用终浓度为3 μM的TG 孵育15min，上样20 s后加入钙离子使其终浓度为1 μM观察钙离子内流7, 为观察细胞在加入TG之后胞内钙离子的变化，将未经TG处理的细胞上样20s后加入TG观察钙离子浓度变化，正常情况下TG加入后因为钙池钙离子的释放胞内钙离子浓度会有一个上升的过程，随后因为钙泵失效，钙离子会逐渐降低。

流式细胞仪Coulter图·横轴时间time纵轴荧光强度（FL1）（40-秒baseline monitoring？）上样持续检测1-3min 激发光波长488nm 发取400uL混悬液，射波长530nm数据处理CellQuest software实验原理：Fluo-3-Am进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶的Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与细胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以上，当用480nm 波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比。

流式胞内细胞因子检测

流式胞内细胞因子检测流式胞内细胞因子检测是一种用于研究细胞因子在单个细胞水平上的表达和分泌的技术。

细胞因子是一类产生于免疫细胞和其他细胞类型中的小分子蛋白质，对于细胞的发育、增殖、分化和功能调节具有重要作用。

流式胞内细胞因子检测可以帮助科研人员了解细胞因子的表达模式、功能和调控机制，从而深入研究细胞免疫学、炎症反应、感染和免疫相关疾病等领域。

流式胞内细胞因子检测的原理是利用单克隆抗体与特定细胞因子结合，然后使用荧光标记的二抗检测这种结合。

首先，需要选取合适的抗体对细胞因子进行检测。

抗体通常选择单克隆抗体，因为其高度特异性和亲和性。

对于胞内细胞因子的检测，首先需要破坏细胞膜，使细胞内的细胞因子释放到胞外液中。

一般来说，可以通过细胞固定和渗透化处理来实现这一步骤。

接着，使用标记有荧光染料的二抗与细胞因子结合，产生荧光信号。

最后，使用流式细胞仪对细胞进行分析，并得到细胞因子的表达和分泌水平。

流式胞内细胞因子检测的优势之一是可以在单个细胞水平上进行分析。

通过研究单个细胞的细胞因子表达水平，可以得到更准确、具体的结果，避免了整体细胞群体的平均值的混淆。

此外，流式胞内细胞因子检测还可以同时分析多种不同细胞因子的表达和分泌水平，可以全面了解细胞因子的调控网络。

另外，流式胞内细胞因子检测还具有高灵敏度和高速度的特点，可以快速得到结果，并且对于微量样品的检测也有很好的表现。

流式胞内细胞因子检测在多个研究领域发挥了重要作用。

在免疫学领域，可以通过检测不同类型免疫细胞中细胞因子的表达水平，了解它们在免疫应答中的作用和调控机制。

在炎症反应研究中，可以检测炎症细胞中细胞因子的表达水平，从而了解炎症反应的机制，并寻找调控炎症的目标。

此外，流式胞内细胞因子检测还可以应用于感染和免疫相关疾病的研究，帮助科研人员了解疾病的发病机制和炎症信号通路。

然而，流式胞内细胞因子检测也存在一些局限性和挑战。

首先，流式胞内细胞因子检测需要选择合适的抗体对特定细胞因子进行检测。

流式细胞术检测胞内细胞因子的经验分析

流式细胞术检测胞内细胞因子的经验分析颜彩玲;张慧;周瑞祥【摘要】目的探讨流式细胞术检测胞内细胞因子的注意事项.方法制备小鼠脾脏淋巴细胞悬液.采用细胞表面抗原CD4、CD25及细胞核内因子FOXP3染色检测调节T细胞,胞内因子TNF-α的检测采用PMA/Iono-mycin,anti-CD3/CD28,PMA/Ionomycin与anti-CD3/CD28联合3种方案进行刺激,比较不同刺激条件下TNF-α胞内因子的表达情况,培养后各组细胞悬液采用固定破膜处理技术进行细胞表面抗原CD3、CD4及细胞内因子TNF-α染色.结果脾脏淋巴细胞悬液制备中研磨、裂解红细胞及染色过程中破膜等操作的不当,均导致前向/侧向(FSC/SSC)点图中目的细胞群模糊不清,从而影响后续分析.新鲜脾脏淋巴细胞得率、CD3+T淋巴细胞得率及TNF-α表达率与冻存的脾脏各类细胞比较,差别无统计学意义(P>0.05).胞内因子TNF-α检测结果显示,刺激组PMA/Ionomycin以及anti-CD3/CD28表达率显著高于未刺激组(P<0.05),PMA/Ionomycin与anti-CD3/CD28联合刺激组的表达率也显著高于未刺激组和独立刺激组(P<0.05).结论流式细胞术胞内细胞因子的检测有很多影响因素,包括脾脏细胞悬液制备中的研磨、裂解红细胞操作,染色处理过程中的破膜、固定,上机检测过程中补偿的调节、对照的设置等均影响实验结果,检测前应注意摸索选择适合待测胞内因子的测定条件.%Objective To investigate factors that may affect the detection of intracellular cytokines with flow cytometry . Methods Splenocytes from mice were disaggregated , and regulatory T cells (Treg) were detected by staining of CD4 ,CD25 ,and intranuclear transcription factor FOXP3 . Forthe detection of TNF-α,splenocytes were stimulated withPMA/Ionomycin ,anti-CD3/CD28 or PMA/Ionomy-cin plus anti-CD3/CD28 ,respectively . Following activation ,the cells were stained with anti-CD3 APC and anti-CD4 FITC ,then intracellularly stained to detect TNF-α after fixation and permeabilization . Controls were designed for both experiments . Results The improper operations in the grinding ,lysing erythrocytes ,fixing and perming the cells all leaded to indistinct target cells of interest in the FSC /SSC dot plots ,which affected the subsequent analysis . There were no significant differences in the percentages of lymphocytes ,CD3+ T lymphocytes ,and TNF-α p roducing cells between the fresh and frozen samples (P>0 .05) . Expression of TNF-αin cells stimulated by PMA/Ionomycin ,anti-CD3/CD28 ,or combined stimulation groups were significantly higher than controls (P<0 .05) . Conclusion Many factors may af-fect the detection of intracellular cytokines by flow cytometry ,including the spleen ,lysing erythrocytes in the preparation of splenocytes suspension ,fixing and perming the cells duringdyeing ,adjusting the com-pensation values ,designing controlled trials and so on . Therefore ,attentions should be paid to explore and select the suitable conditions for studying intracellular factors before testing .【期刊名称】《福建医科大学学报》【年(卷),期】2017(051)005【总页数】8页(P303-310)【关键词】流式细胞术;细胞因子类;小鼠【作者】颜彩玲;张慧;周瑞祥【作者单位】福建医科大学基础医学院 ,福州 350122;福建医科大学新药安全性评价中心,福州 350122;福建医科大学基础医学院 ,福州 350122【正文语种】中文【中图分类】R332;R341.1;R392.21;R977.6辅助性T淋巴细胞(T helper, Th)是人体内免疫系统的重要组成部分。

流式细胞项目参考值和意义

【参考范围】CD34+细胞在正常外周血中占有核细胞的0.00001～0.0001(0.001％～0.01%），骨髓0.005～0.015(0.5％～1.5%)，脐血0.005～0.035(0.5%～3.5%）。

【影响因素】骨髓或外周血白细胞要用PBS稀释至1×10^6/ml后进行免疫标记，并注意设立相应的同型对照。

【临床意义】1．外周血造血干细胞（PBSC）采集前CD34阳性细胞动员有效性的监测可以指导临床制定采集计划。

一般来说，外周静脉血有核细胞中CD34+细胞达到0.001(0.10%）以上时，可以考虑行PBSC单采术。

否则，应继续动员。

2．各种造血干细胞移植物的CD34+细胞剂量控制BMT、PBSCT的CD34+细胞剂量＞2×10^6/kg，脐血干细胞移植时，CD34+细胞剂量可少至BMT成PBSC的1/10，即2×10^5/kg。

3．化疗强弱的掌握化疗后血象的恢复快慢取决于对造血干／祖细胞损伤的强度。

CD34+细胞的测定可以判断化疗的强度。

要求化疗强度控制在杀伤一定比例而非所有CD34+细胞为度。

4．贫血的鉴别（如再障、缺铁性贫血）如果再障的原因属于细胞受累，则CD34+细胞可以明显降低（<0.01)，缺铁性贫血时，CD34+细胞数量应在正常范围之内。

5．基因治疗CD34+的HSC作为缺陷基因的靶细胞有它独特的优点，因为HSC具有自我更新的能力，因此，缺陷基因导入此类细胞后能维持终身，从而彻底治愈疾病。

显然，CD34+HSC 的精确测定显得非常重要。

【参考范围】CD19+:0.10～0.15(10%～15%）。

【影响因素】1．标本最好用EDTA抗凝，其次用肝素。

2．标本要新鲜采集，不能发生凝血。

3．制备细胞悬液时，使用标准溶血剂以使红细胞充分溶解。

4．血液采集后，应尽快进行免疫荧光染色和固定，最迟不能超过6h。

5．标记后的细胞应尽快上机检测，最迟不能超过72h。

流式胞内细胞因子检测

流式胞内细胞因子检测I.导言单细胞胞内细胞因子分析方法在持续不断改进中，分析技术包括ELISPOT，原位杂交(in situ hybridization)，免疫组织化学(immunohistochemistry)，有限稀释分析和单细胞PCR等。

相比较流式细胞术是一种强大的分析技术，可以同时分析单个细胞的多个参数，包括大小和粒度，以及由荧光抗体表征的表面和细胞内标记物的表达。

胞内细胞因子和趋化因子对应的荧光标记单克隆抗体应用已经非常成熟，也适用于混合细胞群内胞内染色和多色分析。

表面和胞内相结合的多色免疫荧光染色提供了一种高分辨率方法，用于鉴定表达特定细胞因子的细胞的性质和频率。

已经有非常多的应用案例如细胞因子表达受限制的（如，Th4与Th2样）或不受限制的（如，Th0）各种细胞类型的分析。

除了能够同时对单个细胞进行高特异性和高灵敏的多个参数同时测量外，该方法还能够快速收集大量细胞信息，进行统计学意义上的分析。

胞内细胞因子的染色取决于细胞因子特异性单克隆抗体的鉴定，及其与固定-透化过程的相容性。

已经报道了使用多聚甲醛固定和用去污剂皂苷对细胞膜透化的组合的最佳细胞内细胞因子染色。

多聚甲醛固定允许保持细胞形态和细胞内抗原性，同时还使细胞能够承受去污剂的透化作用。

皂苷的膜透化使细胞因子特异性单克隆抗体穿透内质网和高尔基体的细胞膜，胞质溶胶和膜。

细胞因子染色的关键参数包括：细胞类型和激活方案-活化后细胞收获的时间-细胞活化过程中包含蛋白质转运抑制剂-和抗细胞因子抗体的选择等。

II.一般方法A.刺激细胞已经报道了各种用于刺激细胞产生细胞因子的体外方法。

多克隆活化剂包括有：佛波酯和钙离子载体；植物血凝素;葡萄球菌肠毒素B；和针对TCR/CD3复合物亚基的单克隆抗体（有或没有针对共刺激受体如CD28的抗体）。

注意：据报道，单独使用PMA进行细胞活化会导致小鼠T细胞表面CD4表达的瞬时丧失；用PMA和钙离子载体一起活化细胞会引起CD4表达的更大和更持久的降低，以及小鼠胸腺细胞、小鼠和人外周T淋巴细胞中CD8表达的降低。

流式细胞术(免疫学检验课件)

Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群，是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞，主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性，在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围，有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底，获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数（散射光或荧光）而非细胞数
对复杂的细胞亚群观察更为直观、准确，但对其数据的统计分析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以获得所需的信息。
SSC信号的强弱与细胞内颗粒结构的质量成正比，用于检测细胞内部结构属性
前向散射光示意图细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生。

PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡的影响因素

基本内容
、特异性和自动化程度，从而为细胞凋亡研究提供更加可靠的工具。
谢谢观看
解决方法：熟练掌握流式细胞仪数据分析的方法和技巧，理解细胞凋亡的生物学过程。在数据分析中，应选择经验证的参数设置，并结合研究目的进行调整。对于结果的解读，应结合凋亡相关文献和实验数据进行综合分析，避免主观偏见。
4、数据分析与解读
总结：使用PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡时，需要注意多个影响因素。这些因素包括PI染料的浓度和作用时间、样本处理过程、流式细胞仪的操作和维护以及数据分析与解读等。为了获得准确的实验结果，需要对这些因素进行严格的控制和优化。
1、PI染料的浓度和作用时间
1、PI染料的浓度和作用时间
PI（Propidium Iodide）是一种常用的细胞凋亡染色剂，可以与DNA结合并使其发出红色荧光。然而，PI的浓度和作用时间对实验结果有很大影响。如果PI 浓度过低，则不能有效地染色细胞；而如果浓度过高，则可能导致细胞膜通透性改变，
基本内容
结果可以以图表形式展示，如散点图、柱状图和曲线图等，以便直观地反映细胞凋亡状态。
基本内容
总之，流式细胞术在细胞凋亡检测中具有广泛的应用价值，可以提供快速、准确和多参数的结果。随着生物学和医学研究的不断发展，流式细胞术在细胞凋亡检测中的应用将不断完善和拓展。未来，随着技术的进步，流式细胞术有望实现更高的灵敏度
第二部分：双脱氧核苷酸法
与DAPI、PMA-RPN和IBF-IP等其他几种方法相比，双脱氧核苷酸法在检测细胞凋亡方面具有较高的灵敏度和特异性。然而，双脱氧核苷酸法操作较为繁琐，且需要使用较多的双脱氧核苷酸，可能会增加实验成本。
第三部分：聚合酶链反应法
第三部分：聚合酶链反应法

流式细胞仪技术参数

流式细胞仪技术参数一、概述流式细胞仪是一种广泛应用于生物医学研究领域的分析仪器，可以实现对细胞的快速、准确的检测和分析。

它通过测量细胞在流动状态下的荧光、散射等信号，可以获取细胞的形态、大小、表面标记物和内部成分等信息。

而流式细胞仪的技术参数则是评估仪器性能的重要指标。

二、光源参数流式细胞仪的光源参数包括波长范围、光源类型和稳定性。

波长范围是指仪器能够发射或接收的光的波长范围，通常在350-850纳米之间。

光源类型有激光和氙气灯两种，其中激光具有单色性好、方向性强等优点，但成本较高。

而稳定性则衡量了光源输出的稳定程度，对于获得准确的实验结果非常重要。

三、散射光参数散射光是流式细胞仪中常用的检测信号之一，可以提供细胞的大小、形状和表面特征等信息。

散射光参数主要包括前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）。

FSC信号与细胞的大小和形状有关，而SSC信号则与细胞的复杂度和颗粒物含量相关。

这两个参数的灵敏度和分辨率决定了仪器对细胞的检测能力。

四、荧光参数荧光参数是流式细胞仪中应用最广泛的检测信号。

它通过检测细胞标记的荧光染料或荧光蛋白的发射光信号，可以获取细胞的表面标记物、细胞周期、细胞凋亡等信息。

荧光参数的关键指标包括激发波长、发射波长、滤光片类型和灵敏度。

激发波长是指激发光的波长范围，发射波长则是指检测荧光发射光的波长范围。

滤光片的选择对荧光信号的检测和分辨率有着重要影响。

五、速度参数速度参数是评估流式细胞仪性能的重要指标之一。

它包括流速和事件捕获率两个方面。

流速指的是细胞在流动状态下通过检测点的速度，一般在100-10000个细胞/秒之间。

事件捕获率则是指仪器每秒钟能够记录的细胞事件数，对于高通量实验非常重要。

六、采样参数采样参数是流式细胞仪中决定样本处理效率的重要因素。

它包括采样量、样本容量和样本稀释倍数等指标。

采样量是指每次采样的细胞数量，样本容量则是指样本室的最大容量。

样本稀释倍数是指样本在进入流式细胞仪之前是否需要进行稀释处理。

人体流式细胞术参数的正常参考值

人体流式细胞术参数的正常参考值人体流式细胞术是一种常用的细胞分析技术，可以用于研究细胞的表达、功能和亚群分布等方面。

在进行人体流式细胞术时，需要对一些参数进行测量和分析。

这些参数通常与细胞的大小、形状、表面分子的表达、染色质组的状态和细胞内分子的含量等相关。

下面将介绍一些常见的人体流式细胞术参数及其正常参考值。

1.前处理阶段参数：- 细胞溶胞：在进行流式细胞术之前，需要将细胞溶解，以获得单个细胞的悬浮液。

细胞溶解的参数包括细胞数、细胞浓度和细胞存活率等。

一般来说，细胞数应该在10^6-10^8个之间，细胞浓度应在1×10^6-1×10^8细胞/ml之间，而细胞存活率应在90%以上。

2.标记参数：-细胞表面分子标记：在流式细胞术中，常用的方法是利用细胞表面的特定分子进行标记，以区分不同细胞类型或细胞亚群。

例如，CD4和CD8是常用的淋巴细胞亚群标记物，CD45用来区分血细胞和非血细胞。

对于细胞表面分子标记的正常参考值，可以根据不同的标记物而有所不同。

-细胞内分子标记：除了表面分子标记外，还可以标记细胞内的分子，如细胞核中的DNA、细胞质中的蛋白质等。

常见的细胞内标记物包括细胞核标记物如Ki-67、PCNA，以及细胞质标记物如抗原检测物等。

对于细胞内分子标记的正常参考值，也需要具体根据不同标记物来确定。

3.光学参数：-前向散射（FSC）：FSC是衡量细胞大小和形状的参数，正常参考值应该根据细胞类型和具体实验条件来确定。

一般来说，FSC的数值越大，表示细胞越大。

-侧向散射（SSC）：SSC是衡量细胞内部复杂性的参数，与细胞内含物的多少和复杂程度有关。

正常参考值也应根据细胞类型和实验条件来确定。

一般来说，SSC数值较高的细胞表示其内含物较丰富。

4.异常细胞分析：- 细胞凋亡（Apoptosis）：细胞凋亡是一种正常的细胞死亡过程，其异常可以与多种疾病的发生和发展相关。

通过测量细胞的DNA含量和特定标记物的表达，可以评估细胞凋亡的程度。

细胞内细胞因子的流式检测讲解

刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和
刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测 IFN-γ 则可选择 PMA 和Ionomycin 同时刺激；如果用 CD4 做表面标记，由于多数病人的
CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，
4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析。
当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。 ③同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的
免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表减少非特异性的背景染色，保证结
果的准确性
① Fc 受体阻断：使用试剂阻断 Fc 受体可以有效减少非特异荧光染色，在
小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig 或血清。
② 表面结合的细胞因子的阻断：使用相同克隆的纯化的细胞因子抗体，
阻断细胞表面结合的细胞因子，阻断由于荧光抗体与表面细胞因子结合引起的背景。
荧光素的选择：检测相对低表达细胞因子如 IL-4时，应选用PE或APC
Monensin Brefeldin-A(BFA) 6、固定剂
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液
7、破膜剂
将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与相应的细胞因子结合。一般使用含1％皂甙、0.05％NaN2的Hanks溶液/HBBS
标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记
细胞内IL-1β的细胞内染色结果
未使用阻断剂
使用阻断剂
阴影部分代表的是同型对照染色结果；黑色代表的是未使用破膜剂的染色结果；灰色代表的是使用破膜剂的染色结果。

流式技术检测CD3、CD4、CD8 T细胞方法参考

流式技术检测CD3、CD4、CD8 T细胞方法参考1. 细胞复苏（针对上一次冻存的细胞）（1）提前打开37℃水浴锅，然后去-80℃冰箱从冻存盒取出冻存细胞，先放冰盒里。

（2）将冻存管插入水上漂，放入37℃水浴锅晃动2～3 min解冻。

擦干水渍后移入生物安全柜中，开酒精灯。

（3）15 mL离心管中提前加入7 mL培养基（1640）。

（4）用移液枪吹打混匀解冻后的细胞（冻存管中），然后将细胞（原则上将冻存管中细胞全加入，即1 mL；也可加一半，留一半）加入培养基（7 mL）中，颠倒混匀后400×g室温离心6 min（升降速分别为6和6）。

（5）倒掉上清（不需要倒干净），剩余部分吹打混匀（即所获的的细胞液）。

2. 细胞计数（1）小离心管（样品量大时，使用96孔血凝板）中加20 μL细胞染色液（2%台盼蓝，平时配制好后避光保存于4℃冰箱）。

（2）再加入20 μL上一步的细胞液，吹打混匀后加20 μL样品到细胞计数板中.（3）然后使用自动细胞计数仪（Count star，BioMed；1804443W）检测活细胞浓度。

计算加样体积：流式要求的活细胞量为1×106（标准为5×105），用此1×106（5×105）除以测得的活细胞浓度即为加样体积。

3. 细胞清洗（1）算好加加体积后将将细胞加入流式管中。

（2）再加入800 μL PBS（清洗液，总体积不要超过1 mL），400×g室温离心5 min（升降速分别为6和7）。

4. 细胞染色（染CD3、CD4、CD8的荧光抗体，保存于4℃冰箱）（1）先将上一步离心后的上清液弃掉（用移液器吸干，尽量不要有液体残留）。

（2）再加入50 μL PBS，在台上震一震混匀。

（3）3种荧光抗体分别加1 、1、2 μL（即稀释倍数分别为1:50、1:50和1:25），另外设置3个单人染的和一个不染色的对照。

（4）4℃静置染色30 min。

细胞内ROS的流式检测

细胞内ROS的流式检测引言细胞内ROS（活性氧物种）是一类高度活跃的有氧代谢产物，具有双重作用性。

正常细胞代谢过程中，ROS能够参与细胞信号传导、调节细胞增殖和凋亡等重要生理过程。

然而，当细胞内ROS的产生过剩时，会导致氧化应激，并对细胞结构和功能产生损害，甚至引发疾病。

流式检测（Flow Cytometry）是一种高效、快速、准确的细胞分析方法，被广泛应用于生命科学研究领域。

它通过荧光标记物和激光技术，可以定量测量细胞内荧光信号的强度，从而实现细胞的分类和分析。

流式检测在细胞内ROS的研究中具有重要意义，可以帮助科学家深入了解细胞内ROS的含量和分布情况，进而揭示ROS在不同生理过程和疾病中的作用机制。

在本文中，我们将介绍细胞内ROS的重要性以及流式检测技术的背景。

随着技术的不断进步和创新，流式检测在细胞内ROS研究中的应用越来越广泛，为我们深入了解细胞内ROS的生物学功能和疾病发生机制提供了强有力的工具和方法。

流式检测技术是一种用于研究细胞内分子表达和功能的强大工具。

它通过将细胞悬浮在流体中，并使用激光器来照射细胞，测量反射或散射光的性质，从而获得关于细胞的详细信息。

流式检测技术实现细胞内ROS的检测依赖于特定的荧光探针。

这些荧光探针可以与ROS反应产生荧光信号，从而标记ROS的存在。

常用的ROS探针包括二氧化氮、超氧化物和过氧化氢的荧光染料。

在流式检测中，细胞首先与特定的ROS探针共孵育。

荧光染料进入细胞内后，与ROS发生特定的反应，产生荧光信号。

这些荧光信号可以通过激光器和光散射器来检测和分析。

流式检测技术的优势在于其高通量性和高灵敏度。

它能够快速分析大量细胞，并提供准确和定量的数据。

流式检测可在不破坏细胞结构和功能的同时，实现对细胞内ROS的快速、高效的检测和分析。

细胞内ROS的流式检测对于研究细胞的氧化应激反应、细胞周期调控以及疾病发展机制具有重要意义。

通过流式检测技术，我们能够更好地理解ROS在细胞内的产生、作用机制以及其与疾病的关联，为疾病诊断和治疗提供重要的依据。