细胞因子检测方法课件
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《细胞因子的检测》课件
干细胞治疗
干细胞分泌的细胞因子具有促进组织再生和修复的作用，可用于治 疗多种疾病。
基因治疗
通过将具有治疗作用的基因导入细胞，调控细胞因子的表达，达到治 疗遗传性疾病和罕见病的目的。
04
细胞因子检测的挑战与展望
检测灵敏度与特异性
检测灵敏度
提高检测方法的灵敏度，降低检测限，以便更早地发现细胞 因子的存在。
挑战
面临的挑战包括如何提高检测方法的 实用性和可靠性，以及如何降低检测 成本，使其更易于在临床推广应用。
05
案例分析
案例一：肿瘤细胞因子检测
总结词
肿瘤细胞因子检测是利用细胞因子作为生物标志物，对肿瘤进行早期诊断、病情监测和疗效评估的方 法。
详细描述
肿瘤细胞因子检测通过检测肿瘤细胞分泌的细胞因子，如肿瘤坏死因子、白介素等，来判断肿瘤的存 在、发展阶段和预后情况。该方法具有无创、灵敏度高、特异性强等优点，有助于提高肿瘤的诊断准 确性和治疗效果。
案例三：感染性疾病细胞因子检测
总结词
感染性疾病细胞因子检测是利用细胞因子作 为生物标志物，对感染性疾病进行诊断和病 情监测的方法。
详细描述
感染性疾病细胞因子检测通过检测患者体内 异常升高的细胞因子，如白介素-1、白介素 -6等，来判断感染性疾病的类型和严重程度 。该方法有助于早期发现感染源，为患者提 供及时有效的治疗，同时有助于评估治疗效 果和预后情况。
药物研发
药物筛选
通过检测细胞因子水平的变化，可以筛选出具有潜在治疗作用的 候选药物。
药物疗效评估
在药物研发过程中，检测细胞因子水平的变化可以评估药物的疗 效和作用机制。
个体化治疗
根据患者细胞因子表达水平的差异，可以制定个体化的治疗方案 ，提高治疗效果。
干细胞分泌的细胞因子具有促进组织再生和修复的作用，可用于治 疗多种疾病。
基因治疗
通过将具有治疗作用的基因导入细胞，调控细胞因子的表达，达到治 疗遗传性疾病和罕见病的目的。
04
细胞因子检测的挑战与展望
检测灵敏度与特异性
检测灵敏度
提高检测方法的灵敏度，降低检测限，以便更早地发现细胞 因子的存在。
挑战
面临的挑战包括如何提高检测方法的 实用性和可靠性，以及如何降低检测 成本，使其更易于在临床推广应用。
05
案例分析
案例一：肿瘤细胞因子检测
总结词
肿瘤细胞因子检测是利用细胞因子作为生物标志物，对肿瘤进行早期诊断、病情监测和疗效评估的方 法。
详细描述
肿瘤细胞因子检测通过检测肿瘤细胞分泌的细胞因子，如肿瘤坏死因子、白介素等，来判断肿瘤的存 在、发展阶段和预后情况。该方法具有无创、灵敏度高、特异性强等优点，有助于提高肿瘤的诊断准 确性和治疗效果。
案例三：感染性疾病细胞因子检测
总结词
感染性疾病细胞因子检测是利用细胞因子作 为生物标志物，对感染性疾病进行诊断和病 情监测的方法。
详细描述
感染性疾病细胞因子检测通过检测患者体内 异常升高的细胞因子，如白介素-1、白介素 -6等，来判断感染性疾病的类型和严重程度 。该方法有助于早期发现感染源，为患者提 供及时有效的治疗，同时有助于评估治疗效 果和预后情况。
药物研发
药物筛选
通过检测细胞因子水平的变化，可以筛选出具有潜在治疗作用的 候选药物。
药物疗效评估
在药物研发过程中，检测细胞因子水平的变化可以评估药物的疗 效和作用机制。
个体化治疗
根据患者细胞因子表达水平的差异，可以制定个体化的治疗方案 ，提高治疗效果。
细胞因子检测技术ppt课件
本法常用于IFN等的测定，IFN可诱导细胞产生抑制 病毒RNA和DNA合成的酶，保护细胞不受病毒感染，产 生细胞病变效应（CPE）。
4、趋化活性测定法
趋化因子诱导细胞移动的方式
趋化性(c趋化因子高浓度处作 定向移动的特性,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。
2、细胞毒活性测定
• 对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细 胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因 子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以 检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细 胞数量与细胞因子的活性呈正比。应用系列稀 释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系 的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定 的基础。
结果客观易于自动化； 适用于大标本量的测定
方法的特异性受依赖细 胞株影响；放射性污染
(2) MTT 比色法
特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关
与同位素掺入法相比
测定步骤类似
掺入物：MTT而非3H-TdR； 反应条件：选用的细胞及其浓度、 培养时间不同
一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑 点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子 量相关
（二）免疫学检测
细胞因子(或受体)与相应的特异性抗体( 单 克隆抗体或多克隆抗体)结合，通过同位素、 荧光或酶等标记技术加以放大和显示， 从 而定性或定量显示细胞因子(或受体)的水平。 1、ELISA法 2、酶联免疫斑点实验 3、流式细胞分析法
1、ELISA方法
ELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一 步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISA的基 本步骤，可作定性或定量分析。ELISA法不仅可以用于细 胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘 附因子的测定
细胞内因子的流式检测(共10张PPT)
所需试剂
1、细胞表面染色用的荧光标记的单抗试剂 如CD3、CD4、CD8、CD25等
2、荧光标记的细胞因子抗体： 如IFN-g、TNF-a、IL-2、IL-4等
3、溶血素：裂解红细胞
4、激活剂：
如PMA、Ionomycin，可以刺激T细胞活化并分泌细胞因子
所需试剂
5、阻断剂
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细胞免疫检测I细胞因子的检测.ppt
实验三 细胞免疫检测I： 细胞因子的检测
实验任务
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用， 请设计一个方案证实之（从细胞因子的角 度考虑
方案归纳
人体免疫包括细胞免疫和体液免疫。本次 实验从T细胞分泌的细胞因子着手检测细胞 免疫功能。
确定研究对象，给药途径，剂量，样本量。 给药后检测血清中细胞因子的含量。
竞争法 双抗体夹心法 改良双抗体夹心法 抑制性测定法 抗体夹心法
抑制性测定法
间接法测抗体
本次实验操作步骤
每孔加用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的IL-2 抗体，4℃过夜。
封闭：用10%小牛血清封闭，37℃孵育20 分钟，洗涤3次。
于每孔内分别加不同稀释度（如1:5，1:10， 1:20…1:80）的待测血清，PBS空白对照， 阴性对照血清，阳性对照血清各0.1毫升。 37℃孵育30分钟，洗涤3次
金免疫技术
金免疫技术的特点是以胶体金作为示踪标 记物 ，应用于抗原抗体反应的一种新型免 疫标记技术。
酶联免疫分析法
酶联免疫分析法是当前应用最广泛的免疫检测方法。 本法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化 作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变 化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏 感度可达ng水平。
免疫荧光技术免疫荧光技术放射免疫分析法放射免疫分析法酶联免疫分析法酶联免疫分析法化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法金标记技术金标记技术免疫荧光技术是用化学方法使荧光素标记免疫荧光技术是用化学方法使荧光素标记的抗体或抗原与组织或细胞中的相应的抗体或抗原与组织或细胞中的相应抗原或抗体结合进行定性定位检查抗原或抗体结合进行定性定位检查抗原或抗体的方法
常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附 法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原；后者 主要测定可溶性抗原或抗体。
实验任务
市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用， 请设计一个方案证实之（从细胞因子的角 度考虑
方案归纳
人体免疫包括细胞免疫和体液免疫。本次 实验从T细胞分泌的细胞因子着手检测细胞 免疫功能。
确定研究对象，给药途径，剂量，样本量。 给药后检测血清中细胞因子的含量。
竞争法 双抗体夹心法 改良双抗体夹心法 抑制性测定法 抗体夹心法
抑制性测定法
间接法测抗体
本次实验操作步骤
每孔加用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释的IL-2 抗体，4℃过夜。
封闭：用10%小牛血清封闭，37℃孵育20 分钟，洗涤3次。
于每孔内分别加不同稀释度（如1:5，1:10， 1:20…1:80）的待测血清，PBS空白对照， 阴性对照血清，阳性对照血清各0.1毫升。 37℃孵育30分钟，洗涤3次
金免疫技术
金免疫技术的特点是以胶体金作为示踪标 记物 ，应用于抗原抗体反应的一种新型免 疫标记技术。
酶联免疫分析法
酶联免疫分析法是当前应用最广泛的免疫检测方法。 本法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化 作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变 化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏 感度可达ng水平。
免疫荧光技术免疫荧光技术放射免疫分析法放射免疫分析法酶联免疫分析法酶联免疫分析法化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法金标记技术金标记技术免疫荧光技术是用化学方法使荧光素标记免疫荧光技术是用化学方法使荧光素标记的抗体或抗原与组织或细胞中的相应的抗体或抗原与组织或细胞中的相应抗原或抗体结合进行定性定位检查抗原或抗体结合进行定性定位检查抗原或抗体的方法
常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附 法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原；后者 主要测定可溶性抗原或抗体。
细胞因子检测方法 ppt课件
分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供 有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。
影响因素
原理与方法 灵敏度 准确度和特异性 精密度 ：免疫分析法的精密度较其生物分析
法有较大提高 ；批内变异通常为20%～25%， 因此有必要进行2次或3次检测 标准化
生物分析法和免疫分析法结合使用
用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区 分表达特定细胞因子的细胞亚群。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志 组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用 特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞 的最小荧光背景。
特点： 快速
简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也 可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境 更准确反映了体内状况。
测定
生物分析法
（一）依赖性细胞株
一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能 在体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDCPL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于 人IL-3和人GM-CSF，因而可利用这些依赖细 胞株检测相应的细胞因子。这种方法敏感性高， 特异性也不错，但可异的是并非所有细胞因都 能找到相应的细胞株，因而限制了它的应用。
免反复冻融 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干
燥剂沿四周封口展
高通量细胞因子检测
CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来 捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、 EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其 采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技 术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已 知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样 本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而 且可以得到一个样本的多个数据。
影响因素
原理与方法 灵敏度 准确度和特异性 精密度 ：免疫分析法的精密度较其生物分析
法有较大提高 ；批内变异通常为20%～25%， 因此有必要进行2次或3次检测 标准化
生物分析法和免疫分析法结合使用
用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区 分表达特定细胞因子的细胞亚群。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志 组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用 特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞 的最小荧光背景。
特点： 快速
简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也 可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境 更准确反映了体内状况。
测定
生物分析法
（一）依赖性细胞株
一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能 在体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDCPL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于 人IL-3和人GM-CSF，因而可利用这些依赖细 胞株检测相应的细胞因子。这种方法敏感性高， 特异性也不错，但可异的是并非所有细胞因都 能找到相应的细胞株，因而限制了它的应用。
免反复冻融 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干
燥剂沿四周封口展
高通量细胞因子检测
CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来 捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、 EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其 采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技 术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已 知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样 本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而 且可以得到一个样本的多个数据。
细胞因子与粘附因子检测PPT课件
族、肿瘤坏死因子受体超家族、免疫球蛋白 受体超家族、趋化因子受体家族。
齐齐哈尔医学院免疫
齐齐哈尔医学院免疫
二、 黏附分子的特性与功能
掌
➢黏附分子（AM）
握
是介导细胞间或细胞与细胞外 基质间相互结合的分子。
齐齐哈尔医学院免疫
了
1.黏附分子的特性 解
黏附分子均为跨膜糖蛋白，由胞 膜外区、跨膜区和胞质区三部分组 成，根据其结构特点可分为免疫球 蛋白超家族、整合素家族、选择素 家族和钙黏蛋白家族。
临床应用
齐齐哈尔医学院免疫
第一节 概 述
掌 握
➢细胞因子(cytokine) 是由免疫细胞及组织细胞表达
并分泌，通过结合细胞表面的相应 受体，在细胞间发挥相互调控作用 的一类小分子蛋白质或多肽。
齐齐哈尔医学院免疫
一、细胞因子及其受体的特性与
功能
熟
1.细胞因子的种类
悉
白细胞介素（IL）
干扰素（IFN）
第十六章 细胞因子与黏附分子检
测
医学技术学院免疫教研室
齐齐哈尔医学院免疫
复习
1.T细胞增殖试验的原理、刺激物？ 2.T细胞增殖试验的主要方法？ 3.T细胞介导的细胞毒试验主要方 法？
掌握：细胞因子、粘附分子概念； 临床常用的测定方法
熟悉：细胞因子的特性与功能； 了解：其他
齐齐哈尔医学院免疫
第一节 概述 第二节 临床常用的测定方法 第三节 细胞因子与黏附分子测定的
齐齐哈尔医学院免疫
第二节 临床常用的测定方法掌握
基因水平：PCR技术。
检测水平
生物活性测定
蛋白水平
免疫学测定
齐齐哈尔医学院免疫
第二节 临床常用的测定方法掌握
齐齐哈尔医学院免疫
齐齐哈尔医学院免疫
二、 黏附分子的特性与功能
掌
➢黏附分子（AM）
握
是介导细胞间或细胞与细胞外 基质间相互结合的分子。
齐齐哈尔医学院免疫
了
1.黏附分子的特性 解
黏附分子均为跨膜糖蛋白，由胞 膜外区、跨膜区和胞质区三部分组 成，根据其结构特点可分为免疫球 蛋白超家族、整合素家族、选择素 家族和钙黏蛋白家族。
临床应用
齐齐哈尔医学院免疫
第一节 概 述
掌 握
➢细胞因子(cytokine) 是由免疫细胞及组织细胞表达
并分泌，通过结合细胞表面的相应 受体，在细胞间发挥相互调控作用 的一类小分子蛋白质或多肽。
齐齐哈尔医学院免疫
一、细胞因子及其受体的特性与
功能
熟
1.细胞因子的种类
悉
白细胞介素（IL）
干扰素（IFN）
第十六章 细胞因子与黏附分子检
测
医学技术学院免疫教研室
齐齐哈尔医学院免疫
复习
1.T细胞增殖试验的原理、刺激物？ 2.T细胞增殖试验的主要方法？ 3.T细胞介导的细胞毒试验主要方 法？
掌握：细胞因子、粘附分子概念； 临床常用的测定方法
熟悉：细胞因子的特性与功能； 了解：其他
齐齐哈尔医学院免疫
第一节 概述 第二节 临床常用的测定方法 第三节 细胞因子与黏附分子测定的
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第二节 临床常用的测定方法掌握
基因水平：PCR技术。
检测水平
生物活性测定
蛋白水平
免疫学测定
齐齐哈尔医学院免疫
第二节 临床常用的测定方法掌握
细胞因子检测方法ppt课件
用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区 分表达特定细胞因子的细胞亚群。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志 组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用 特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞 的最小荧光背景。
特点： 快速
简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也 可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境 更准确反映了体内状况。
小结
生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能， 是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门 最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测 耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定 的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感 度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。
免反复冻融 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干
燥剂沿四周封口。2-8℃可以1个月左右
检测方法的进展
高通量细胞因子检测
CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来 捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、 EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其 采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技 术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已 知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样 本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而 且可以得到一个样本的多个数据。
夹心ELISA
缺点：不能显示出单个细胞产生细胞因子的同 一性和频率性的直接信息
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志 组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用 特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞 的最小荧光背景。
特点： 快速
简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也 可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境 更准确反映了体内状况。
小结
生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能， 是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门 最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测 耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定 的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感 度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。
免反复冻融 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干
燥剂沿四周封口。2-8℃可以1个月左右
检测方法的进展
高通量细胞因子检测
CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多 用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来 捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、 EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其 采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技 术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已 知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样 本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而 且可以得到一个样本的多个数据。
夹心ELISA
缺点：不能显示出单个细胞产生细胞因子的同 一性和频率性的直接信息
《细胞因子检测概述》课件
化学发光法
化学发光法是一种利用化学发光反应来检测细胞因子的方 法。这种方法具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点， 适用于痕量细胞因子的检测。
化学发光法主要包括酶促化学发光和直接化学发光等方法 。这些方法在临床诊断、药物研发和环境监测等领域有广 泛应用。
荧光定量PCR法
荧光定量PCR法是一种基于PCR技术 的细胞因子检测方法。通过荧光染料 或探针标记的特异性引物，实现对细 胞因子基因的定量检测。这种方法具 有高灵敏度、高特异性和可定量等优 点。
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细胞因子在免疫应答、炎症反应、造 血等生理和病理过程中发挥重要作用 。
细胞因子种类
白细胞介素（IL）
如IL-1、IL-2、IL-6等，具有调节免疫和炎 症反应的功能。
干扰素（IFN）
如IFN-α、IFN-β、IFN-γ等，具有抗病毒、 抗肿瘤和免疫调节作用。
肿瘤坏死因子（TNF）
如TNF-α、TNF-β等，具有抗肿瘤和免疫调 节作用。
案例二：自身免疫性疾病细胞因子检测
总结词
自身免疫性疾病细胞因子检测是利用细胞因子作为生物标志物，对自身免疫性疾病进行诊断和病情监测的方法。
详细描述
自身免疫性疾病细胞因子检测通过检测患者体内异常升高的细胞因子，如IL-17、IL-23等，来判断自身免疫性疾 病的存在、发展阶段和治疗效果。这种检测方法有助于提高自身免疫性疾病的诊断准确性和治疗效果，为患者提 供更好的治疗选择。
05
细胞因子检测案例分析
案例一：肿瘤细胞因子检测
总结词
肿瘤细胞因子检测是利用细胞因子作为生物标志物，对肿瘤进行早期诊断、病情监测和疗效评估的方 法。
详细描述
肿瘤细胞因子检测通过检测肿瘤细胞分泌的细胞因子，如IL-6、TNF-α等，来判断肿瘤的存在、发展 阶段和治疗效果。这种检测方法具有无创、灵敏度高、特异性强的优点，有助于提高肿瘤的诊断准确 性和治疗效果。
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• 特点：
• 快速 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可 根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更 准确反映了体内状况。
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夹心ELISA
• 第1步，包被捕获抗体到96孔板中，BSA阻断后加 入标准品或者标本
• 第2步，加入酶标的抗体，结合被捕获的细胞因子 • 第3步，加入酶的底物显色，酶标仪或者化学发光
议读取结果（OD：optical density） • 第4步，绘制标准曲线，计算标本中细胞因子的含
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生物分析法
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（一）依赖性细胞株
• 一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在 体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDC-PL细胞 株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于人IL-3和人 GM-CSF，因而可利用这些依赖细胞株检测相应的 细胞因子。这种方法敏感性高，特异性也不错， 但可异的是并非所有细胞因都能找到相应的细胞 株，因而限制了它的应用。
• 免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定 的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感 度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。
• 分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供 有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。
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影响因素
• 原理与方法 • 灵敏度 • 准确度和特异性 • 精密度 ：免疫分析法的精密度较其生物分析法有
较大提高 ；批内变异通常为20%～25%，因此有必 要进行2次或3次检测 • 标准化
生物分析法和免疫分析法结合使用
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免疫分析法
• ELISA • 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 • ELISPOT
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ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
细胞因子检测方法
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1
背景
• 细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指 标
• 疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治 疗监测等
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2
• （一）依赖性细胞株 ：生物分析法 • （二）功能检测 ：生物分析法 • （三）免疫测定 ：免疫分析法 • （四）功能测定与抗体抑制 • （五）分子杂交技术 ：mRNA的测定 • （六）多聚酶链反应技术（PCR）：mRNA的测定
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夹心ELISA
• 缺点：不能显示出单个细胞产生细胞因子的同一 性和频率性的直接信息
• 细胞内细胞因子的免疫荧光检测 • ELISPOT • 原位杂交 • 单一细胞PCR
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细胞内细胞因子的流式细胞仪 检测
• 原理：Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔 基体介导的转运方法，使得细胞因子聚集、蓄积， 增强细胞因子信号，可被流式细胞仪检测。
• 用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区分 表达特定细胞因子的细胞亚群。
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细胞内细胞因子的流式细胞仪 检测
• 方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组 合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊 的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小 荧光背景。
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（二）功能检测
• 利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的活 性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应，肿 瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。这样的方 法敏感性高，但特异性不够，容易受一些扰因素 的影响。
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6
免疫分析法
（1）放免实验（RIA） （2）酶联免疫吸附实验（ELISA）
反复冻融 • 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干燥
剂沿四周封口。2-8℃可以1个月左右
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检测方法的进展
• 高通量细胞因子检测
• CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多用途检 测分析技术，它由一系列的微珠组合来捕获并结 合流式细胞仪技术检测细胞培养液、EDTA血浆、 血清样本中被检测物质的量。其采用夹心法分析 策略，与传统的ELISA分析技术相比，此方法可以 同时检测多项指标。用已知的标准品和对照标准 曲线就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不 受样本量的限制，而且可以得到一个样本的多个 数据。
• 1． 间接ELISA（Indirect ELISA）：用于筛检抗体（抗 特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体最常 用的方法。
• 2． 夹心ELISA（Sandwich ELISA）：用于检测目的抗 原的量。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记， 但增加了操作步骤和测定时间。
• 3． 竞争ELISA（Competitive ELISA）用于确定抗原特 异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验的 特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未标 记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要用 于测定小分子抗原。
免反复冻融 。使用前将标本平衡至室温，不能用 水浴锅 • 细胞培养上清液：1500g离心10～15分钟去除细胞 和细胞残渣。
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注意事项
试剂盒贮存条件和有效期 • 未开封试剂盒：贮存在2-8℃ • 开封/复溶试剂 ：2-8℃可以1个月左右 • 标准品：分装并贮存在-20℃以下，1个月，避免
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7
mRNA的测定
（1）分子杂交实验 （2）逆转录PCR（RT-PCR）
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小结
• 生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能， 是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门 最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测 耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
量
Байду номын сангаас
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注意事项
实验前： • 确定试剂盒在有效期内 • 仔细阅读说明书 • 按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积） • 根据检测标本数量确定所需试剂的量 • 按说明书将所用试剂平衡至室温，配制所需试剂
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注意事项
标本的制备和贮存 ： • 血清、血浆标本 ：尽快分装 ，贮存在-70℃ ，避
• 快速 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可 根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更 准确反映了体内状况。
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夹心ELISA
• 第1步，包被捕获抗体到96孔板中，BSA阻断后加 入标准品或者标本
• 第2步，加入酶标的抗体，结合被捕获的细胞因子 • 第3步，加入酶的底物显色，酶标仪或者化学发光
议读取结果（OD：optical density） • 第4步，绘制标准曲线，计算标本中细胞因子的含
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生物分析法
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（一）依赖性细胞株
• 一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在 体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDC-PL细胞 株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于人IL-3和人 GM-CSF，因而可利用这些依赖细胞株检测相应的 细胞因子。这种方法敏感性高，特异性也不错， 但可异的是并非所有细胞因都能找到相应的细胞 株，因而限制了它的应用。
• 免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定 的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感 度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。
• 分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供 有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。
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影响因素
• 原理与方法 • 灵敏度 • 准确度和特异性 • 精密度 ：免疫分析法的精密度较其生物分析法有
较大提高 ；批内变异通常为20%～25%，因此有必 要进行2次或3次检测 • 标准化
生物分析法和免疫分析法结合使用
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免疫分析法
• ELISA • 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 • ELISPOT
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ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
细胞因子检测方法
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背景
• 细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指 标
• 疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治 疗监测等
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• （一）依赖性细胞株 ：生物分析法 • （二）功能检测 ：生物分析法 • （三）免疫测定 ：免疫分析法 • （四）功能测定与抗体抑制 • （五）分子杂交技术 ：mRNA的测定 • （六）多聚酶链反应技术（PCR）：mRNA的测定
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夹心ELISA
• 缺点：不能显示出单个细胞产生细胞因子的同一 性和频率性的直接信息
• 细胞内细胞因子的免疫荧光检测 • ELISPOT • 原位杂交 • 单一细胞PCR
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细胞内细胞因子的流式细胞仪 检测
• 原理：Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔 基体介导的转运方法，使得细胞因子聚集、蓄积， 增强细胞因子信号，可被流式细胞仪检测。
• 用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区分 表达特定细胞因子的细胞亚群。
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细胞内细胞因子的流式细胞仪 检测
• 方法：用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组 合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊 的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小 荧光背景。
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（二）功能检测
• 利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的活 性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应，肿 瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。这样的方 法敏感性高，但特异性不够，容易受一些扰因素 的影响。
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免疫分析法
（1）放免实验（RIA） （2）酶联免疫吸附实验（ELISA）
反复冻融 • 微孔板：将未使用的板条用箔纸包好，加上干燥
剂沿四周封口。2-8℃可以1个月左右
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检测方法的进展
• 高通量细胞因子检测
• CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多用途检 测分析技术，它由一系列的微珠组合来捕获并结 合流式细胞仪技术检测细胞培养液、EDTA血浆、 血清样本中被检测物质的量。其采用夹心法分析 策略，与传统的ELISA分析技术相比，此方法可以 同时检测多项指标。用已知的标准品和对照标准 曲线就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不 受样本量的限制，而且可以得到一个样本的多个 数据。
• 1． 间接ELISA（Indirect ELISA）：用于筛检抗体（抗 特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体最常 用的方法。
• 2． 夹心ELISA（Sandwich ELISA）：用于检测目的抗 原的量。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记， 但增加了操作步骤和测定时间。
• 3． 竞争ELISA（Competitive ELISA）用于确定抗原特 异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验的 特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未标 记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要用 于测定小分子抗原。
免反复冻融 。使用前将标本平衡至室温，不能用 水浴锅 • 细胞培养上清液：1500g离心10～15分钟去除细胞 和细胞残渣。
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注意事项
试剂盒贮存条件和有效期 • 未开封试剂盒：贮存在2-8℃ • 开封/复溶试剂 ：2-8℃可以1个月左右 • 标准品：分装并贮存在-20℃以下，1个月，避免
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mRNA的测定
（1）分子杂交实验 （2）逆转录PCR（RT-PCR）
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小结
• 生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能， 是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门 最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测 耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
量
Байду номын сангаас
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注意事项
实验前： • 确定试剂盒在有效期内 • 仔细阅读说明书 • 按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积） • 根据检测标本数量确定所需试剂的量 • 按说明书将所用试剂平衡至室温，配制所需试剂
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标本的制备和贮存 ： • 血清、血浆标本 ：尽快分装 ，贮存在-70℃ ，避