培养基适用性验证ppt课件
药典增补本 培养基适用性检查-控制菌
菌悬液制备
金黄色葡萄球菌
菌种→胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤(30～35℃/18～24小时)→用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液
铜绿假单胞菌
大肠埃希菌
乙型副伤寒沙门菌
白色念珠菌
菌种→沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤中(20～25℃/2～3天)→用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液
生孢梭菌
菌种→接种于梭菌增菌培养基中(置厌氧条件下30～35℃/24～48小时)→用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液
适用性检查
控制菌检查
培养基
试验菌株
特性
菌液量
培养温度及时间
耐胆盐革兰阴性菌
肠道菌增菌肉汤
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
促生长能力
≤100cfu
(30～35℃/不超过3天)
促生长能力+指示特性
≤100cfu
(30～35℃/不超过3天)
大肠埃希菌
抑制能力
≤100cfu
(30～35℃/不少于3天)
梭菌
梭菌增菌培养基
生孢梭菌
促生长能力
≤100cfu
(30～35℃/不超过3天)
哥伦比亚琼脂
生孢梭菌
促生长能力
≤100cfu
(30～35℃/不超过3天)
白色念珠菌
沙氏葡萄糖肉汤
白色念珠菌
麦康凯琼脂
大肠埃希菌
促生长能力+指示特性
≤100cfu
(30～35℃/不超过3天)
沙门菌
RV沙门菌增菌肉汤
乙型副伤寒沙门菌
促生长能力
≤100cfu
(30～35℃/不超过3天)
培养基适用性检查
培养基适用性检查▪计数实验的培养基适用性➢该部分内容均为新增➢规定了该内容的应用范围➢采用标准菌种计数，回收率以及形态比较的判定方法➢标准菌种为：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；规定了稀释后的工作菌液的保存条件和保存期限➢引入了对照培养基的概念➢判定的依据：回收率大于70％，且形态一致▪控制菌检查的培养基适用性➢该部分内容均为新增➢规定了该部分内容的应用范围以及检查的项目➢采用标准菌种比较的判定方法➢根据培养基的用途不同，分为增菌培养基的促生长能力、固体培养基的促生长能力、培养基的抑制能力、固体培养基的指示能力、液体培养基的指示能力等5种检查方法➢在检查中引入了涂布接种的概念1.概述培养基质量是影响微生物检验结果的重要环节。
计数测定用培养基的促生长能力是微生物限度检查结果判断的重要影响因素，控制菌检查用培养基也可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异，从而对菌落颜色、形态等指标存在较大差异，影响结果判断的客观性。
培养基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价拍段检验用培养基是否符合检验要求。
微生物限度检查用培养基主要分为细菌、霉菌及酵母菌计数测定用培养基和控制菌检查用培养基两部分。
2010《版中国药典》微生物限度检查法中收载了“适用性检查”对培养基质量进行控制。
2、培养基适用性检查实验的一般要求2.1培养基适用性检查适用范围2010版《中国药典》规定微生物限度检查中成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
培养基使用性检查试验可用于确定实验室所用培养基(包括购置的不同批号的成品培养基、不同批号的脱水培养基干粉、按处方自行配制培养基不同批次的原材料等)、制备程序（包括水质控制、配制方法、灭菌程序等）、保存条件（温度、湿度、时间及盛装培养基的容器条件等）等是否满足微生物限度检查用要求。
即上述影响培养基质量的各关键控制点应通过培养基使用性检查试验确定，如果任一控制点发生变化应重新进行培养基适用性检查。
纯化水R2A培养基适用性验证
编号：FAL-YZ-005.1R2A培养基适用性验证报告科技发展有限公司目录R2A培养基适用性验证报告1.目的因2015版药典纯化水检验用培养基变更,依1105 非无菌产品微生物限度检查方法,通过此次实验对所更换的R2A琼脂培养基进行适用性检查，以证明该方法及所采用的培养基适用于纯化水微生物限度检查日常检测。
2.范围适用于本公司纯化水的微生物限度检查。
3．依据中华人民共和国药典（2015年版）4. 职责权限5. 验证方法5.1R2A培养基的适用性检查5.1.1R2A培养基应进行培养基的适用性检查。
5.1.2菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代,试验用菌种应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
5.1.3菌液制备铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的微生物培养基质控品,使用前注入1.1ml稀释液充分溶解后,在漩涡混合器上振荡混匀,制成1ml(相当于10～100cfu/0.1ml)菌悬液。
5.1.4适用性检查取铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌各10～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注R2A琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养不少于5天，计数；5.1.5结果判定被检定的固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值在0.5～2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
判该培养基的适用性检查符合规定。
5.1.6实验前的准备5.1.6.1仪器设备确认人: 日期:5.1.6.2操作环境微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
5.1.6.3器具无菌培养皿：（直径90mm）1ml注射器5.2计数方法的验证5.2.1当建立纯化水微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。
培养基适用性验证
培养基适⽤性验证.培养基适⽤性验证⽅案起草⼈：⽅案审核⼈：⽅案批准⼈：XXXXX药业股份有限公司⽬录1. 验证⽬的 (2)2. 参照标准 (2)3. 验证项⽬ (2)4. 验证⼩组⼈员及职责 (3)5. 验证可接受的标准 (3)6. 验证步骤 (3)7. 菌液制备 (6)8. 适⽤性检查 (6)9. 控制菌检查 (7)10. 操作⽅法 (8)11.结论 (11)1. 验证⽬的：需氧菌、霉菌及酵母菌计数⽤的培养基及控制菌培养基应进⾏培养基的适⽤性检查。
本次验证的⽬的是确认胰酪⼤⾖胨琼脂培养基和沙⽒葡萄糖琼脂培养基适合需氧菌、霉菌及酵母菌总数及测定和控制菌适⽤性检查。
2. 参照标准：2015版中国药典微⽣物限度检查法。
3. 验证项⽬：营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基的适⽤性检查和控制菌适⽤性检查。
4.验证⼩组⼈员及职责：4.1验证⼩组⼈员:4.2验证⼈员职责及要求4.2.1按验证⽅案及相关⽂件实施验证。
4.2.2认真观察并做好验证原始记录。
4.2.3对实施验证的结果负责。
4.3验证中各部门的职责4.3.1验证领导组职责4.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证⼯作的管理。
4.3.1.2确定验证项⽬及验证项⽬负责⼈。
4.3.1.3负责验证⽅案的批准⼯作。
4.3.1.4负责验证资料及结果的审核⼯作。
4.3.1.5负责验证报告的批准⼯作。
4.3.2验证⼯作⼩组职责4.3.2.1负责验证⽅案的起草⼯作。
4.3.2.2参与验证⽅案的讨论、确认⼯作。
4.3.2.3负责验证⽅案的实施。
4.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告⼯作。
4.3.2.5参与验证结果的评价⼯作。
4.3.3质量部职责4.3.3.1负责验证⽅案的审核⼯作。
4.3.3.2负责验证过程中仪器、仪表、计量器具的校验⼯作。
4.3.3.3负责验证中各项检测⼯作，提供验证的检验记录、检验报告，对验证过程中的各项检验⼯作负责。
4.3.3.4负责验证资料和报告的审核⼯作。
微生物限度检查——培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验.
制作人：王丽娟 重庆医药高等专科学校
控制菌检查—— 培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验
提纲
一、控制菌种类 二、培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验 三、对照试验
一、控制菌种类
耐胆盐革兰阴性菌
白色念珠菌
大肠埃希菌
控制菌检查项目 梭菌 沙门菌
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
二、培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验
1.控制菌检查用培养基的适用性检查 控制菌检查用培养基包括成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应进 行培养基的适用性检查，检查项目包括培养基的促生长、抑制能力和指示特性。
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
大肠埃希菌
乙型副伤寒沙门菌
白色念珠菌 生孢Fra bibliotek菌2.检查方法的适用性试验 检查方法及流程同“微生物计数法适用性检查” 所用阳性对照菌液不同 结果判断不同：控制菌检查用培养基制药检出阳性对照菌即可判为无抑菌性
三、对照试验
阳性对照试验 • • • 目的：检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜 操作：同供试品操作，仅加入了不超过100cfu的阳性对照菌 结果要求：应呈阳性 阴性对照试验 • • • 目的：检查操作环境、试验物品、操作技术是否无菌 操作：用稀释剂代替供试品，其余同供试品。 结果要求：应呈阴性
RA培养基适用性检查方案
R A培养基适用性检查方案文件排版存档编号：[UYTR-OUPT28-KBNTL98-UYNN208]批准页目录1.验证目的2. 参照标准3. 验证项目4. 验证人员及职责5. 判定标准6. 实验材料7. 菌液制备8. 菌液计数9. 适用性检查10.阴性对照附件1.检测记录1.验证目的纯化水微生物计数用的培养基应进行培养基的适用性检查。
本次验证的目的是确认R2A培养基适合纯化水中总需氧菌总数测定。
2.参照标准2015版中国药典二部1105微生物限度检查法。
3.验证项目R2A培养基的适用性检查。
4.验证小组人员及职责：验证小组人员:验证人员职责及要求Array验证中各部门的职责负责验证资料及结果的审核工作。
负责验证报告的批准工作。
验证工作小组职责负责验证方案的起草工作。
参与验证方案的讨论、确认工作。
负责验证方案的实施。
负责验证结果的分析、统计、报告工作。
参与验证结果的评价工作。
质量部职责负责公司验证日常管理工作。
负责验证方案的审核工作。
负责验证过程中仪器、仪表、计量器具的校验工作。
证过程中的各项检验工作负责。
5.判定标准被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在的范围内，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。
6.试验材料被验证产品：R2A琼脂培养基仪器设备压力蒸汽灭菌器HF1200LC型生物安全柜DNP-9160BS型培养箱DHG90型鼓风干燥箱微波炉. 验证用培养基. 验证用菌株：(第代)7. 菌液制备分别取铜绿假胞杆菌、与枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养不超过18-24h。
取经30～35℃培养18-24h的铜绿假单胞菌、与枯草芽孢杆菌的新鲜培养物1ml加入到%无菌氯化钠溶液中，倍稀释获得约为50~100cfu∕ml的菌悬液备用。
8.菌液计数：（每种菌液接种2个平皿）分别取铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌菌悬液1ml分别注入无菌平皿中，立即倾注R2A琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，置30～35℃培养不少于5天；菌落计数结果（2个平皿计数取平均值）见下表菌落计数结果（cfu∕ml）9.适用性检查分别取铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌菌悬液1ml分别注入无菌平皿中，立即倾注R2A琼脂对照培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，置30～35℃培养不不少于5天；菌落计数结果（2个平皿计数取平均值）见下表菌落计数结果（cfu∕ml）10.阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
培养基适用性检查
培养基适用性检查沙氏葡萄糖琼脂培养基适用性检査接种不大于lOOcfu白色念珠菌菌液及黑曲霉泡子悬液至沙氏衙萄糖琼脂培养基，至20~259培养不超过5天，每一试验菌株平行制备2个半1111。
同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5~2范困内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
检验时间: 对照培养基批号: 被检配制批培养基批号:检验人/日期: 复核人/日期:胰酪大豆腺琼脂培养基适用性检査接种不大于lOOcfu的金黄色葡简球菌、铜绿假单胞菌.枯草芽砲杆菌各51至胰酪大豆腺琼脂培养基平板上.30、35'C培养不超过3天：接种不大于lOOcfu 的白色念珠菌菌液及黑曲霉砲子悬液各lml至胰酪大豆腺琼脂培养基平板上.30~35C培养不超过5天，每一试验菌株平行制备2 个平1111：同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0. 5、2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致检验时间: 对照培养基批号: 被检配制批培养基批号:R2A琼脂培养基适用性检査取不大于lOOcfu的铜绿假胞杆菌液及枯草芽抱杆菌液各lml,分别注入无菌平UI1中，立即倾入R2A琼脂样品培养基，每一试验菌株平行制备2个平皿，混匀，凝固，S35-C培养120小时，计数。
同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范困内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
检验时间: 对照培养基批号: 被检配制批培养基批号:胰酪大豆淼液体培养基适用性检査接种不大于lOOcfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假取胞菌、枯草芽他杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌至胰酪大豆腺裁体培养基中，至3OT5C培养18・24小时，每一试验菌株平行制备2管：同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
06 培养基模拟灌装验证精品PPT课件
➢设备装配、转移 ➢装量调整、测定 ➢加胶塞 ➢加料 ➢扶瓶 ➢环境监测 ➢中控取样
2021/2/21
张晓明
31
八、干扰因素设计
干扰的次数应大于或等于正常生产时发生 的次数
干扰操作时应是在培养基有灌装时进行 所有的干扰都应是预先设定，指定人员在
过程中记录
2021/2/21
张晓明
32
九、监测计划
2021/2/21
张晓明
5
一、法规要求
培养基模拟灌装试验的首次验证，每班次应当连 续进行3次合格试验。空气净化系统、设备、生产 工艺及人员重大变更后，应当重复进行培养基模 拟灌装试验。培养基模拟灌装试验通常应当按照 生产工艺每班次半年进行1次，每次至少一批。
2021/2/21
张晓明
6
一、法规要求
无菌分装工艺：具有与产品流动性能相似的无菌 培养基干粉或无菌产品替代粉末（乳糖,甘露醇…)
2021/2/21
张晓明
19
六、培养基和替代产品
无菌产品替代粉末（空白粉末）
可以在干粉状态下灭菌，无菌性可达到药典标准
稳定\ 惰性物质 流动性好
可溶于液体培养基，对目视检查无影响
在试验的浓度下无抑菌性(甘露醇对白色念珠菌有 轻微的抑菌性)
2021/2/21
张晓明
18
六、培养基和替代产品
适宜宽菌谱范围的微生物生长，如大豆酪蛋白消 化培养基（胰蛋白酶大豆肉汤，TSB）
对于会形成严格厌氧环境的工艺：硫乙醇酸盐培 养基(FTM)能够支持真正的厌氧菌的生长（如果 在环境监测样品或无菌试验中检出厌氧菌，要考 虑采用这种培养基）
液体灌装工艺：具有较好的澄明度和较小的粘度
2021/2/21
培养基适用性验证方案-wm
培养基适用性验证方案编制人：________________ 日期：_________________ 审核人：________________ 日期：_________________批准人：________________ 日期：_________________目录1. 概述2. 验证目的3. 验证依据4. 验证项目5. 验证小组成员及职责6. 验证时间7. 验证材料8. 验证内容8.1.无菌检查用培养基适用性验证8.2.计数用培养基适用性验证9. 验证方案的评定与建议10. 验证方案的最终审核意见培养基适用性验证报告1.概述培养基是无菌检查和微生物限度检查的关键物品之一，培养基的是否符合检验要求，影响着检验结果的准确性、有效性。
2.验证目的验证培养基是否符合检验要求3.验证依据《中国药典》2015版通则1101生物检查法4.验证项目无菌检查用培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、营养肉汤；计数用培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基、沙式葡萄糖琼脂培养基、R2A琼脂培养基、大豆酪蛋白琼脂培养基5.验证小组成员6.验证时间本次验证于2016年1月18日开始进行，将于2016年1月22日完成7.验证材料7.1.仪器设备手提式压力蒸汽灭菌器、生物安全柜、生化培养箱、霉菌培养箱、电热鼓风干燥箱、净化工作台7.2.对照培养基胰酪大豆胨琼脂对照培养基、沙式葡萄糖琼脂对照培养基、R2A琼脂对照培养基、大豆酪蛋白琼脂对照培养基7.3.其他器具酒精灯、试管、75%乙醇、灭菌刻度吸量管(1ml)、灭菌硼硅酸玻璃培养皿(© 90mr K 15mm)、锥形瓶，移液器，无菌吸头等。
7.4. 菌种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、黑曲霉、白色念珠菌；8. 验证内容8.1.无菌检查用培养基适用性验证8.1.1. 无菌性验证随机选取灭菌后硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基各5 瓶，并对培养基分别编号。
控制菌培养基适用性实验
控制菌培养基适用性实验
（促生长能力、抑制能力和指示特性）
控制菌检查用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查。
1.菌种
大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]
金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]
铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]
2.菌液制备；验用菌种；取经30～35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物1ml，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液10倍稀释至10-5－10-7，含菌数50～100cfu/ml，备用。
3.适用性检查
3.1计数培养基适用性检查：取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌或铜绿假单胞菌各50～100cfu，分别注入被检培养基管（皿），每株试验菌平行制备2管（皿），混匀，置30～35℃培养3天，观察结果。
3.2同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行试验。
4.结果判断：
4.1促生长能力和指示特性检查合格判断标准：被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好，且被检培养基与对照培养基生长的菌落大小，形态特征应一致。
4.2抑制能力检查合格判断标准；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应不生长。
接种不少于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检査规定的培养温度及不小于规定的最长培养时间下培养，试验菌应不生长。
培养基适用性检查
培养基适用性检查▪计数实验的培养基适用性➢该部分内容均为新增➢规定了该内容的应用范围➢采用标准菌种计数，回收率以及形态比较的判定方法➢标准菌种为：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；规定了稀释后的工作菌液的保存条件和保存期限➢引入了对照培养基的概念➢判定的依据：回收率大于70％，且形态一致▪控制菌检查的培养基适用性➢该部分内容均为新增➢规定了该部分内容的应用范围以及检查的项目➢采用标准菌种比较的判定方法➢根据培养基的用途不同，分为增菌培养基的促生长能力、固体培养基的促生长能力、培养基的抑制能力、固体培养基的指示能力、液体培养基的指示能力等5种检查方法➢在检查中引入了涂布接种的概念1.概述培养基质量是影响微生物检验结果的重要环节。
计数测定用培养基的促生长能力是微生物限度检查结果判断的重要影响因素，控制菌检查用培养基也可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异，从而对菌落颜色、形态等指标存在较大差异，影响结果判断的客观性。
培养基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价拍段检验用培养基是否符合检验要求。
微生物限度检查用培养基主要分为细菌、霉菌及酵母菌计数测定用培养基和控制菌检查用培养基两部分。
2010《版中国药典》微生物限度检查法中收载了“适用性检查”对培养基质量进行控制。
2、培养基适用性检查实验的一般要求2.1培养基适用性检查适用范围2010版《中国药典》规定微生物限度检查中成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
培养基使用性检查试验可用于确定实验室所用培养基(包括购置的不同批号的成品培养基、不同批号的脱水培养基干粉、按处方自行配制培养基不同批次的原材料等)、制备程序（包括水质控制、配制方法、灭菌程序等）、保存条件（温度、湿度、时间及盛装培养基的容器条件等）等是否满足微生物限度检查用要求。
即上述影响培养基质量的各关键控制点应通过培养基使用性检查试验确定，如果任一控制点发生变化应重新进行培养基适用性检查。
版药典培养基适用性验证之欧阳歌谷创编
欧阳歌谷创编 2021年2月1培养基验证文件制药有限公司制药有限公司验证立项申请表验证方案的审批验证方案目录1、概述2、验证目的3、验证范围4、验证项目小组成员及职责5、验证合格标准6、试验材料7、菌液制备8、适用性检查9、验证记录10、验证结论及综合评价计数培养基适用性检查的验证方案1. 验证目的：需氧菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查。
本次验证的目的是确认胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基是否适合需氧菌、霉菌及酵母菌总数测定。
2. 参照标准：《中国药典》2015年版四部1105非无菌产品微生物限度检查法。
3. 验证项目：胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基的适用性检查。
5. 合格标准：被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。
6. 试验材料：6.1. 被验证产品：胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基。
6.2. 仪器设备：6.2.1. YXQ-LS-100G型立式压力蒸汽灭菌器6.2.2. GHT-00双人净化工作台6.2.3. BSC-110011A2-X 生物安全柜6.2.4.MJ-250I型霉菌培养箱 (20～25℃)6.2.5.LRH-250生化培养箱 (30～35℃)6.2.6.电热恒温干燥箱6.2.7微波炉6.4. 验证用菌株：(第代)7. 菌液制备按6.4规定程序培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成约为50~100cfu∕ml的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成约为50~100cfu∕ml的黑曲霉孢子悬液。
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b．适用性检查：接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯 草芽孢杆菌各50-100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾 入营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备3个平皿，混匀， 凝固，置30~35℃培养48h，计数；取白色念珠菌、黑曲 霉各50-100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红 钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备3个平皿，混匀，凝 固，置23~28℃培养72h，计数。同时，用相应的对照培 养基替代被检培养基进行上述试验。
5）黑曲霉菌液的制备
接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁培养基上, 30℃、 150\min培养2天
4.2 适用性检查 4.2.1 试验步骤 a．菌液制备：按稀释度10-5,10-6,10-7等依次类推稀释
菌悬液，接种培养后取50～100cfu计数。接种金黄色葡 萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营 养琼脂培养基上；至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35℃， 培养18~24小时；接种白色念株菌的新鲜培养物至改良马 丁培养基上25~28℃，培养24~48小时，上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为50~100CFU的菌 悬液，备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂 斜面培养基上，23~28℃，培养5~7天，加入3-5ml0.9%无 菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用 管口带有薄的无菌棉花或纱布能通过滤菌丝的无菌巴氏 吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后在室温2h 内使用，在2~8℃可再24h内使用。
结果判定：若被检培养基上得菌落平均数不小于对照培 养基上得菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养 基上得菌落一致，判改培养基的适用性检查符合规定。
4.2.2 验证方法 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算个
试验菌每次试验的回收率。 a．平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液
的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30℃、159r/min摇
床培养24h做①代，上述培养物24h后接1ml至新鲜营养肉
汤培养基中30℃、159r/min摇床培养24h做②代
4）白色念珠菌菌液的制备
接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基, 30℃150r/min培养24小时，做①代，上述培养物24h后接1ml 至新鲜改良马丁培养基中30℃、159r/min摇床培养24h做② 代
复核人
日期
备注：
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组数 试验组 菌液组 供试品对照组 稀释剂对照组
加样 供试液+菌液
加样量（mL） 1
回收率（%）
是否 合格
菌液
供试液 稀释液+菌液
e．结果判断 在3次独立的平行试验中。 稀释剂对照组的平均菌落数 稀释剂对照的菌回收率= ×100% 菌液组的平均菌落数 试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数
1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼 脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定 其菌数。薄膜过率法计数时，取规定量试验可能用的最 低稀释剂供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中 加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌 数。 b．菌液组 测定所加的试验菌数。 c．供试品对照组 取规定量的供试液，按菌落计数方法 测定供试品本底菌数。 d．稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化，中和、 离心或薄膜过滤等
培养基适用性验证
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌（
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis )
白色念珠菌
(Candida albicans)
黑曲霉
(Aspergillus niger )
备料单（菌落计数）
一、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌 营养琼脂培养基200ml、*3 0.9%无菌氯化钠溶液100ml*3 平皿10套*3 1ml移液管9支*3、10ml移液管2支*3 试管7支*3
二、白色念珠菌、黑曲霉 玫瑰红钠200ml、*2 0.9%无菌氯化钠溶液100ml*2 平皿10套*2 1ml移液管9支*3、10ml移液管2支*2 试管7支*2
菌液制备
1）金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌菌液的 制备
接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌
金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 菌种类型
培养基
温度
铜绿假单胞 白色念珠菌
黑曲霉
时间
阴性对照
结论
培养条件
检验人 备注：
复核人
日期
2：培养基适用性检查报告
培
养
菌种类型
皿编号1源自金黄色葡萄球菌21
枯草芽孢杆菌
2
1
大肠埃希菌
2
培养条件
培养基
对
照
培
养 基
验证培养 基计数
计
数
结论
1
白色念珠菌
2
1
黑曲霉
2
检验人