《中国药典》2015年版微生物计数法实例

定？
《中国药典》2015年版----微生物计数法实例
中国药典2015年版
1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
• 计数培养基适用性检查 • 供试品计数方法适用性试验
1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法
• 培养基适用性检查 • 控制菌检查方法适用性试验
1107 非无菌药品微生物限度标准
1:10 180 1800
1:100 15 1500
1:1000 3 3000
结果判断 • 101cfu：可接受的最大菌数为
20； • 102cfu：可接受的最大菌数为
200； • 103cfu：可接受的最大菌数为
2000，以此类推。
一个化学口服固体制剂，需 氧菌计数结果见表，报告菌 落数?符合规定，不符合规
计数
• 若同稀释级两个平皿的菌落数 平均值不小于15，则两个平皿 的菌落数不能相差1倍或以上。
• 需氧菌总数测定宜选取平均菌 落数小于300cfu的稀释级，霉 菌和酵母菌总数测定宜选取平 均菌落数小于100cfu的稀释级， 作为菌数报告的依据。取最高 的平均菌落数，计算1g、1mL、 10cm2供试品中所含的微生物 数，取两位有效数字报告。
水不溶性非油脂类供试品
• pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或TSB溶解或稀释成1:10供试液。分散力较差的 供试品可在稀释液中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。必要时进一步稀释。
油脂类供试品
• 取供试品加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌 性的无菌表面活性剂充分混匀。必要时进一步稀释。
菌液 对照组
（菌）
• 取9.9mL稀释液代替供试品，按试验组操作加入试验菌液同试验组试验。
供试品 对照组
（样）
• 取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组试验。
试验一：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数（平皿法1:10）
计数方法适用性试验中， 采用平皿法或薄膜过滤法 时，
TSA
回收率比值应在0.5-2范围 内。
供试品计数方法适用性试验
菌液对照组（菌）
试验组（样+菌）
供试品对照组（样）
注意事项
检验量
• 不少于2个最小包装 • 一般供试品的检验量为10g、
10mL、100cm2；贵重药品、 微量包装药品的检验量可以 酌减。 • 大蜜丸不得少于4丸，膜剂 不得少于4片。
稀释级 平均菌落数（cfu） 结果（cfu/g)
菌液 对照组
（菌）
• 取9.9mL稀释液代替供试品，按试验组操作加入试验菌液同试验组试验。
供试品 对照组
（样）
• 取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组试验。
试验二：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数 （薄膜过滤法）
若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法 及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计 数。
• 非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准 • 非无菌含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准 • 非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准 • 中药提取物及中药饮片的微生物限度标准
1107 非无菌药品微生物限度标准（1/3）
1107 非无菌药品微生物限度标准（2/3）
1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
• 计数培养基适用性检查 • 供试品计数方法适用性试验
1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法
• 培养基适用性检查 • 控制菌检查方法适用性试验
1107 非无菌药品微生物限度标准
• 非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准 • 非无菌含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准 • 非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准 • 中药提取物及中药饮片的微生物限度标准
供试品中微 生物的回收
水溶性供试品
试验组
增加稀释液或 培养基体积
平皿法
水不溶性非油 脂类供试品
供试品对照组
加入适宜的中 和剂或灭活剂
薄膜过滤法
油脂类供试品
需要特殊方法 制备供试液的
供试品
菌液对照组
最可能数法 （MPN法）
供试品计数方法适用性试验----供试液制备
水溶性供试品
• pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或TSB溶解或稀释成1:10供试液，必要时进一步 稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液(霉菌和酵母菌的限度为101cfu/g)。
/
/
T/S
0.92
0.91
0.92
1.07
1.08
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应 在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
实例：霉菌和酵母菌总数计数培养基适用性检查结果（SDA）
菌种
被检培养基菌落数 （T）
对照培养基菌落数 （S） T/S
白色念珠菌
1107 非无菌药品微生物限度标准（3/3）
1107 非无菌药品微生物限度标准----实例
微生物限度标准：需氧菌总数不得过103cfu/g，霉菌和酵母菌总数 不得过102cfu/g，金黄色葡萄球菌不得检出，铜绿假单胞菌不得检 出，大肠埃希菌不得检出，沙门菌不得检出，耐胆盐革兰阴性菌 应小于102cfu/g。
1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
计数培养基适用性检查/计数方法适用性试验
试验菌株 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
需氧菌总数计数
培养基适用性：胰酪大豆胨液体培养基（TSB） 和胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA)； 方法适用性：TSA或TSB(最可能数法） 30～35℃，培养不超过3天，接种量不大于 100cfu。
胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA)，30～35℃，培养 不超过5天，接种量不大于100cfu。
霉菌和酵母菌总数计数
沙氏葡萄糖琼脂培养基 （SDA)，20～25℃，培养不 超过5天，接种量不大于 100cfu。
每一种试验菌株平行制备2管或2个平皿，同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 判断标准：
1
# 皿
2
# 皿
平 均
55 69 62
62 71 67
铜绿
1
# 皿
2
# 皿
平 均
枯草
1
# 皿
2
# 皿
平 均
白念
黑曲
1
# 皿
2
# 皿
平 均
1
# 皿
2
# 皿
平 均
55 64 60 82 87 85 62 59 61 78 81 80
70 62 66 93 90 92 59 54 57 77 70 74
空白 对照
需要特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂（浸泡） • 肠溶及结肠溶制剂（特殊pH稀释液） • 气雾剂、喷雾剂（冷冻、钻孔等） • 贴膏剂（多孔材料、表面活性剂）
试验一：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数 （平皿法1:10）
试验组
（样+菌）
ห้องสมุดไป่ตู้
• 取10g供试品加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，制成1:10的供试液， 供试液分装成7支试管，每支9.9mL，每管加0.1mL的菌液(TSA:金、铜、枯、白、 黑；SDA：白、黑)，使试管中含菌量不大于100cfu/mL，吸取2mL分别注入两个 平皿，每皿1mL，立即倾注相应的培养基。
（1）被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。 （2）被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大 小应与对照培养基上的菌落一致。
实例：需氧菌总数计数培养基适用性检查结果（TSA）
菌种
被检培养基菌落数 （T）
对照培养基菌落数 （S）
金葡
SDA
试验二：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数 （薄膜过滤法）
试验组
（样+菌）
• 取10g供试品加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，制成1:10的供试液，供试 液分装成7支试管，每支9.9mL，每管加0.1mL的菌液，使试管中含菌量不大于 100cfu/mL，吸取1mL进行薄膜过滤，用500mLpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗， 100mL/次，滤膜贴在相应的培养基上。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。
1#皿
2#皿
平均
68
49
59
69
59
64
0.92
黑曲霉
1#皿
2#皿
平均
92
78
85
95
80
88
0.96
空白 对照
/
/
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应 在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
供试品计数方法适用性试验
供试液制备
接种和稀释
抗菌活性的 去除或灭活