LC-MS液质联用方法开发(沃特斯培训教材)
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• TFA（三氟乙酸）- 用于分析蛋白和多肽
– 它能抑制ESI+电离至少 0.1%。 – 它将很大程度上抑制ESI-电离。
• TEA（三乙胺）
– 有丰富的m/z 102离子存在（三乙胺加质子的峰）。 – 抑制弱碱性化合物的ESI+电离，但能提高弱碱性化合物的 ESI-电离。
• THF（四氢呋喃）
– 100% 的四氢呋喃可能会着火。 – 当喷雾气是空气时，在APCI电离方式，不能用四氢呋喃。 – 腐蚀PEEK管
用同位素模型算同位素峰
©2004 Waters Corporation
两种不同有机溶剂的比较
©2004 Waters Corporation
流动相配比的影响
©2004 Waters Corporation
HPLC等度和梯度方法比较
等度 LC 梯度 LC
©2004 Waters Corporation
©2004 Waters Corporation
不恰当的溶剂和缓冲盐
• 不挥发性缓冲盐 (磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸 盐等)－堵塞管路和探头 • 表面活性剂－抑制电离 • 无机酸 (硫酸、磷酸等)－腐蚀
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用PEEK管时注意溶剂的使用
• 腐蚀 PEEK
– HNO3 – H2SO4
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Ibuprofen布洛芬 -ve ion
pH 值的影响
正离子方式 – 分析碱性化合物
用有机酸调整 pH 值 如：甲酸或乙酸
负离子方式 – 分析酸性化合物
用碱调整 pH 值 如：氢氧化铵/氨水
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pH 值的影响
LC-MS液质联用方法开发
LC-MS配置
色谱柱
分流器
探头
液相色谱仪和进样器 废液或馏分收集 器
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基质干扰: Loop 进样
In Methanol
In Tomato Juice
©2004 Waters Corporation
基质干扰: 用色谱柱将基质和分析物分离
©2004 Waters Corporation
色谱柱温度变化的影响
©2004 Waters Corporation
In Methanol
In Tomato Juice
©2004 Waters Corporation
正离子方式或负离子方式?
碱性化合物 (-NH2) 酸性化合物 (-CO2H, -OH)
NH O
(M+H)+ (M-H)CH3 O
百度文库
N Cl Cl H3C O
CH3
H3C
CH3 OH
Linuron 利谷隆+ve ion
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pH 值的影响
©2004 Waters Corporation
一般所用溶剂和缓冲盐
溶剂
水 乙腈 甲醇 异丙醇
缓冲盐
甲酸 乙酸 氢氧化胺 乙酸胺*
* 缓冲盐浓度应不超过10 mM 。
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溶剂和添加剂的选择
分析物溶解
样品全溶解于水中 样品溶解于流动相中
©2004 Waters Corporation
流速对大气压电离的影响
100 Relative intensity APCI 50 Pneumatically assisted ESI ‘Pure’ ESI 0 0.5 1.0 1.5 2.0
流速 (ml/min) (50/50 ACN/H20)
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HPLC色谱柱的影响
©2004 Waters Corporation
色谱柱的选择
• 当进样量相同时，一般情况下，内径小的色谱 柱比内径大的色谱柱有更高的响应。 • 用ESI电离方式时，一般建议用2.1mm内径的色 谱柱，用APCI电离方式时，用3.9mm内径的色谱 柱。
©2004 Waters Corporation
质谱能适应的流动相流速
APCI 0.2 - 1 ml/min (不用分流) ESI
1 - 300 µl/min (需要分流，约 250 µl 进入质谱)
©2004 Waters Corporation
分流器的连接
死体积为零的三通
PEEK 管
分析色谱柱
电雾喷探头
PEEK 管
废液池或溜分收集器
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LC流速对质谱的影响
©2004 Waters Corporation
LC流速对质谱的影响
©2004 Waters Corporation
HPLC色谱柱的选择
LC流速一般根据色谱柱规格和电离方式来确定 0.5-2 ml/min 0.1-0.3 ml/min 40-50 µl/min < 10 µl/min APcI ESI 0.2-2 ml/min 5-300 µl/min routinely (1 ml/min possible) 3.9-4.6 mm i.d. 2.1 mm i.d. 1 mm i.d. Capillary column
• 溶胀 PEEK
– DMSO – THF – CH2Cl2
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溶样的溶剂 – 乙腈／水
利谷隆
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溶样的溶剂 –甲醇／水
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溶剂的选择
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– 它能抑制ESI+电离至少 0.1%。 – 它将很大程度上抑制ESI-电离。
• TEA（三乙胺）
– 有丰富的m/z 102离子存在（三乙胺加质子的峰）。 – 抑制弱碱性化合物的ESI+电离，但能提高弱碱性化合物的 ESI-电离。
• THF（四氢呋喃）
– 100% 的四氢呋喃可能会着火。 – 当喷雾气是空气时，在APCI电离方式，不能用四氢呋喃。 – 腐蚀PEEK管
用同位素模型算同位素峰
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两种不同有机溶剂的比较
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流动相配比的影响
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HPLC等度和梯度方法比较
等度 LC 梯度 LC
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不恰当的溶剂和缓冲盐
• 不挥发性缓冲盐 (磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸 盐等)－堵塞管路和探头 • 表面活性剂－抑制电离 • 无机酸 (硫酸、磷酸等)－腐蚀
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用PEEK管时注意溶剂的使用
• 腐蚀 PEEK
– HNO3 – H2SO4
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Ibuprofen布洛芬 -ve ion
pH 值的影响
正离子方式 – 分析碱性化合物
用有机酸调整 pH 值 如：甲酸或乙酸
负离子方式 – 分析酸性化合物
用碱调整 pH 值 如：氢氧化铵/氨水
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pH 值的影响
LC-MS液质联用方法开发
LC-MS配置
色谱柱
分流器
探头
液相色谱仪和进样器 废液或馏分收集 器
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基质干扰: Loop 进样
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基质干扰: 用色谱柱将基质和分析物分离
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色谱柱温度变化的影响
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In Methanol
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正离子方式或负离子方式?
碱性化合物 (-NH2) 酸性化合物 (-CO2H, -OH)
NH O
(M+H)+ (M-H)CH3 O
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N Cl Cl H3C O
CH3
H3C
CH3 OH
Linuron 利谷隆+ve ion
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pH 值的影响
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一般所用溶剂和缓冲盐
溶剂
水 乙腈 甲醇 异丙醇
缓冲盐
甲酸 乙酸 氢氧化胺 乙酸胺*
* 缓冲盐浓度应不超过10 mM 。
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溶剂和添加剂的选择
分析物溶解
样品全溶解于水中 样品溶解于流动相中
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流速对大气压电离的影响
100 Relative intensity APCI 50 Pneumatically assisted ESI ‘Pure’ ESI 0 0.5 1.0 1.5 2.0
流速 (ml/min) (50/50 ACN/H20)
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HPLC色谱柱的影响
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色谱柱的选择
• 当进样量相同时，一般情况下，内径小的色谱 柱比内径大的色谱柱有更高的响应。 • 用ESI电离方式时，一般建议用2.1mm内径的色 谱柱，用APCI电离方式时，用3.9mm内径的色谱 柱。
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质谱能适应的流动相流速
APCI 0.2 - 1 ml/min (不用分流) ESI
1 - 300 µl/min (需要分流，约 250 µl 进入质谱)
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分流器的连接
死体积为零的三通
PEEK 管
分析色谱柱
电雾喷探头
PEEK 管
废液池或溜分收集器
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LC流速对质谱的影响
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LC流速对质谱的影响
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HPLC色谱柱的选择
LC流速一般根据色谱柱规格和电离方式来确定 0.5-2 ml/min 0.1-0.3 ml/min 40-50 µl/min < 10 µl/min APcI ESI 0.2-2 ml/min 5-300 µl/min routinely (1 ml/min possible) 3.9-4.6 mm i.d. 2.1 mm i.d. 1 mm i.d. Capillary column
• 溶胀 PEEK
– DMSO – THF – CH2Cl2
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溶样的溶剂 – 乙腈／水
利谷隆
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溶样的溶剂 –甲醇／水
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溶剂的选择
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