植物中SOD的分离提取及性质研究实验报告
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1、邻苯三酚自氧化法 根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specific
activity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白） 来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：每mL样品中的 蛋白质mg数（mg∕mL）;每ml样品中的酶活性单位数（U∕mL）。 酶的纯度越高酶的活性也就越高。
SOD 酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上 腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT 光还原法、化学发光 法等。在一般情况下，SOD 酶活性只能应用间接活性测定法， 本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。
三、实验试剂
大蒜、氯仿-乙醇混合液、维生素 、冷丙酮、邻苯三酚、 浓盐酸、蒸馏水、双氧水、TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺。）、 氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、溴酚蓝、5.0mol/L PH7.8 磷酸钠、 10 mmol/LHCl、Tris（三羟甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇）、甘 氨酸 1．2.45mol/LNBT 溶液：称取 200mgNBT 溶于蒸馏水中并定容至
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中，可防止皮肤衰老，抗炎，防晒等作用。植物中大蒜的 SOD 含量丰富，所以，本实验研究大蒜中 SOD 的性质，并且确定 SOD 同工酶的类型。根据 SOD 的性质，我们采用邻苯三酚自氧化法 判断同工酶的最适温度，最适 PH，以及双氧水对酶的活力抑制。 并采用改进的自氧化法测酶的活力.
二、实验原理
利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出 O2-， 生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后 转为黄色，线性时间维持在 3~4min。加入酶液则抑制其自氧 化速度，在 325nm 处测定溶液的吸光度。酶活性单位采用 1mL 反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50%时的酶定量 为一个活力单位。邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增
② SOD 性质的测定：
1. 粗酶液活性测定（邻苯三酚法）
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试剂 ml PH8.3 磷酸缓冲液
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加 2、不连续电泳
不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于 浓缩胶的堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离 胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度） 的凝胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续 电泳的分辨率大大高于连续电泳。虽然不连续电泳在缓冲系统的 选择和制胶（特别是梯度胶）的操作方面比较繁杂，但它可以得 到电泳分离最重要的指标--高分辨，因而是目前应用最广泛的技 术。
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烧杯 玻璃棒
五．实验内容源自文库
①制 备 酶 液 ：
SOD 的提取： 称取 20~25g 大蒜蒜瓣，置于研磨器中研磨，使组织细胞破碎。
再加入 2~3 倍体积的 0.05mol/L PH 7.8 的磷酸缓冲液，继续研 磨，搅拌 20min，使 SOD 充分溶解到缓冲液中，然后以 5000r/min 离心 15min，弃去沉淀，得提取液。（留取 1ml 提取液备用，正 确量取剩余上清液体积，记录） 除杂蛋白
100ml 置棕色试剂瓶中，避光贮存。 2. 3.60mol/L PH7.8 磷酸缓冲液（内含 2.8mol/L TEMED 和 2.8
维生素 ）：在 100ml 3.60mol/L PH7.8 磷酸钠缓冲液中加 0.42mlTEMED 及 1.32mg 维生素 ，置棕色瓶中贮存。 3．PH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取 Tris6.0g,甘氨酸 28.8g，
植物中 SOD 的分离提取及 性质研究
--------------------综合实验 报告
学校：
学院：
班级：
同组成员：
一、实验目的
SOD 广泛存在生物界，是防御氧毒害的关键酶。SOD 主要有 CuZn-,Mn-,Fe-SOD 三种类型的同工酶，它们的共同的生物学作用 是专一的清除氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细 胞器，尤其是生物膜有严重的损坏作用），具有抗衰老，抗辐射， 抗癌等生理作用。在医药中，SOD 可用于治疗辐射病，自身免疫 性疾病，炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品
向提取液中加入 0.25 倍体积的氯仿-乙醇混合液，搅拌 15min,5000r/min，离心 15min,弃除杂蛋白，得粗酶液。（留取 1ml 粗酶液备用，正确量取剩余粗酶液的体积，记录） SOD 的沉淀分离
将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌 15min,5000r/min, 离心 15min 得 SOD 沉淀。 将 SOD 沉淀溶于 0.05mol/LPH 7.8 的磷酸缓冲液中，于 55~60° C 热处理 15min，再离心弃沉淀的得 SOD 酶液（留取 1ml 酶液备 用，正确量取剩余酶液的体积，记录）
1.0mol/L 盐酸溶液 100ml 。
6.以及不同浓度的磷酸缓冲液。0.05mol/L， PH 如下
5.8
6.5
7.0
7.3
7.6
7.8
7.9
8.3
7. 凝胶贮液以及凝胶 A 液：48ml 1mol/L Hcl,36g Tris,0.24ml TEMED. B 液：48ml 1mol/L Hcl,5.9g Tris,0.46ml TEMED。 C 液：30g Acr,0.8g Bis D 液：10g Acr,2.5g Bis E 液：4mg 核黄素 F 液：40g 蔗糖（以上各液定容至 100ml）
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加水至 1000ml,用是加水稀释 10 倍。
4. PH8.9 1.5mol/L Tris-HCl 缓冲液：称取 18.2g 三羟甲基氨
基甲烷（Tris）加 24ml 1mol/L 盐酸，加水至 100ml.
5. PH6.8 0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液:称取 Tris6.0g,加 48ml
凝胶（体积比）：A:C:E:水=1:3:1:3 浓缩液（体积比）：B:D:E:F=1:3:1:3
四、实验仪器
离心机 离心管 水浴锅 电热炉 研钵 移液枪 移液管 胶头滴管 试管若干 721 型分光光度计以及紫外分光光度计 DYCZ-240D 型垂直板电泳槽 锥形瓶 冰箱 不同型号容量瓶若干 托盘天平
activity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白） 来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：每mL样品中的 蛋白质mg数（mg∕mL）;每ml样品中的酶活性单位数（U∕mL）。 酶的纯度越高酶的活性也就越高。
SOD 酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上 腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT 光还原法、化学发光 法等。在一般情况下，SOD 酶活性只能应用间接活性测定法， 本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。
三、实验试剂
大蒜、氯仿-乙醇混合液、维生素 、冷丙酮、邻苯三酚、 浓盐酸、蒸馏水、双氧水、TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺。）、 氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、溴酚蓝、5.0mol/L PH7.8 磷酸钠、 10 mmol/LHCl、Tris（三羟甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇）、甘 氨酸 1．2.45mol/LNBT 溶液：称取 200mgNBT 溶于蒸馏水中并定容至
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中，可防止皮肤衰老，抗炎，防晒等作用。植物中大蒜的 SOD 含量丰富，所以，本实验研究大蒜中 SOD 的性质，并且确定 SOD 同工酶的类型。根据 SOD 的性质，我们采用邻苯三酚自氧化法 判断同工酶的最适温度，最适 PH，以及双氧水对酶的活力抑制。 并采用改进的自氧化法测酶的活力.
二、实验原理
利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出 O2-， 生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后 转为黄色，线性时间维持在 3~4min。加入酶液则抑制其自氧 化速度，在 325nm 处测定溶液的吸光度。酶活性单位采用 1mL 反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50%时的酶定量 为一个活力单位。邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增
② SOD 性质的测定：
1. 粗酶液活性测定（邻苯三酚法）
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试剂 ml PH8.3 磷酸缓冲液
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加 2、不连续电泳
不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于 浓缩胶的堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离 胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度） 的凝胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续 电泳的分辨率大大高于连续电泳。虽然不连续电泳在缓冲系统的 选择和制胶（特别是梯度胶）的操作方面比较繁杂，但它可以得 到电泳分离最重要的指标--高分辨，因而是目前应用最广泛的技 术。
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烧杯 玻璃棒
五．实验内容源自文库
①制 备 酶 液 ：
SOD 的提取： 称取 20~25g 大蒜蒜瓣，置于研磨器中研磨，使组织细胞破碎。
再加入 2~3 倍体积的 0.05mol/L PH 7.8 的磷酸缓冲液，继续研 磨，搅拌 20min，使 SOD 充分溶解到缓冲液中，然后以 5000r/min 离心 15min，弃去沉淀，得提取液。（留取 1ml 提取液备用，正 确量取剩余上清液体积，记录） 除杂蛋白
100ml 置棕色试剂瓶中，避光贮存。 2. 3.60mol/L PH7.8 磷酸缓冲液（内含 2.8mol/L TEMED 和 2.8
维生素 ）：在 100ml 3.60mol/L PH7.8 磷酸钠缓冲液中加 0.42mlTEMED 及 1.32mg 维生素 ，置棕色瓶中贮存。 3．PH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取 Tris6.0g,甘氨酸 28.8g，
植物中 SOD 的分离提取及 性质研究
--------------------综合实验 报告
学校：
学院：
班级：
同组成员：
一、实验目的
SOD 广泛存在生物界，是防御氧毒害的关键酶。SOD 主要有 CuZn-,Mn-,Fe-SOD 三种类型的同工酶，它们的共同的生物学作用 是专一的清除氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细 胞器，尤其是生物膜有严重的损坏作用），具有抗衰老，抗辐射， 抗癌等生理作用。在医药中，SOD 可用于治疗辐射病，自身免疫 性疾病，炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品
向提取液中加入 0.25 倍体积的氯仿-乙醇混合液，搅拌 15min,5000r/min，离心 15min,弃除杂蛋白，得粗酶液。（留取 1ml 粗酶液备用，正确量取剩余粗酶液的体积，记录） SOD 的沉淀分离
将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌 15min,5000r/min, 离心 15min 得 SOD 沉淀。 将 SOD 沉淀溶于 0.05mol/LPH 7.8 的磷酸缓冲液中，于 55~60° C 热处理 15min，再离心弃沉淀的得 SOD 酶液（留取 1ml 酶液备 用，正确量取剩余酶液的体积，记录）
1.0mol/L 盐酸溶液 100ml 。
6.以及不同浓度的磷酸缓冲液。0.05mol/L， PH 如下
5.8
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7.3
7.6
7.8
7.9
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7. 凝胶贮液以及凝胶 A 液：48ml 1mol/L Hcl,36g Tris,0.24ml TEMED. B 液：48ml 1mol/L Hcl,5.9g Tris,0.46ml TEMED。 C 液：30g Acr,0.8g Bis D 液：10g Acr,2.5g Bis E 液：4mg 核黄素 F 液：40g 蔗糖（以上各液定容至 100ml）
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加水至 1000ml,用是加水稀释 10 倍。
4. PH8.9 1.5mol/L Tris-HCl 缓冲液：称取 18.2g 三羟甲基氨
基甲烷（Tris）加 24ml 1mol/L 盐酸，加水至 100ml.
5. PH6.8 0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液:称取 Tris6.0g,加 48ml
凝胶（体积比）：A:C:E:水=1:3:1:3 浓缩液（体积比）：B:D:E:F=1:3:1:3
四、实验仪器
离心机 离心管 水浴锅 电热炉 研钵 移液枪 移液管 胶头滴管 试管若干 721 型分光光度计以及紫外分光光度计 DYCZ-240D 型垂直板电泳槽 锥形瓶 冰箱 不同型号容量瓶若干 托盘天平