水产品中孔雀石绿快速检测方法
孔雀石绿
净化
将PRS柱安装在固相萃取柱装臵上，上端连接酸性氧化铝 固相萃取柱，用乙腈活化，一般需要活化3次以上，转移 提取液到柱上，再用乙腈洗茄形瓶2次，每次2.5mL，依次 过柱，弃去酸性氧化铝住，吹PRS柱近干，再不抽真空的 情况下，加入等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液，收集洗脱 液，再加入等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液，再次收集洗 脱液，收集洗脱液用玻璃瓶，乙腈定容至3mL，供液相色 谱测定。
色谱分析
液相色谱条件
色谱柱：C18柱，250mm4.6mm，粒度5μm 流动相：乙腈+乙酸铵缓冲溶液 流速：1.3mL/min 柱温：35℃ 激发波长：265nm 发射波长：360nm 进样量：10μL
液相色谱测定
上机测定时，应根据样液中被测孔雀石绿、隐色孔 雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫含量情况，选定峰高 相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀 石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫响应值 均应在仪器检测线性范围内。在上述色谱条件下， 孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的 保留时间约为6.10min、7.88min、17.77min、 18.22min，标准品色谱图参见附录。
孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、 隐色结晶紫的色谱图
实验过程中应注意：
匀浆时不要使匀浆机连续操作1分钟以上，因其发 热，匀浆时间过长容易影响回收率和造成机器损坏， 应停顿后再继续匀浆。 根据样品质量的多少来决定氧化铝的用量，5g鱼样 大约需要10g氧化铝，若试样脂肪较多，应适当增 加氧化铝的用量。 加入二氯甲烷后，进行液液萃取时，应上戴橡胶手 套，一定要注意及时放气，应在通风处放气，放气 口不要对着人。 过柱操作时，加入乙腈溶解茄形瓶中的残液时，应 充分摇晃，使其溶解后再转移至固相萃取柱上。
水产品中残留孔雀石绿的毒性与检测方法
I he『esea rch『eviewed水产品中残留孔雀石绿的毒性与检测方法王邦国(靖远县农产品质量安全检验检测管理站730699)摘要：作为一种带有金属光泽绿色结晶体的孔雀石绿,在化学界中被称为四甲基代二氨基三苯甲烷,其在戊醇、乙醇、甲醇以及水中易于溶解,水溶液呈现蓝绿色,抗菌效力在药物染料中较强，可作为驱虫剂或杀菌剂，属于三苯甲烷类染料。
下面本文章将对水产品残留孔雀石绿的研究进展加以分析。
关键词:水产品;残留物质；孔雀石绿；研究进展在养殖过程中，我国曾以孔雀石绿作为清塘杀菌剂，同时，也常将孔雀石绿使用在存放池内和运输过程中，它们在鱼体内可分别代谢为无色结晶紫与无色孔雀石绿，因为其母体化合物与代谢物质存在较大的副作用，极易致突变、致畸、致癌，至此多数国家已经在20世纪90年代将孔雀石绿列为水产养殖禁用药用。
但是现阶段仍有一些渔民在违规使用,主要是因为孔雀石绿价格便宜,抗菌效果较好,所以有效监测孔雀石绿残留物质是至关重要的遥1孔雀石绿的分布与代谢情况进入机体后的孔雀石绿通常会经过生物转化，变成无色孔雀石绿，属于脂溶性的衍生物,极易残留在组织中。
一些业界人士发现，在鱼体内残留的孔雀石绿物质比水体中孔雀石绿的浓度明显要高,主要分布在内脏器官、皮肤、肌肉、肝脏、肾脏以及血浆中,同时体内也会蓄积孔雀石绿，特别是含有较多脂肪的组织中浓度水平更高。
在清除体内的孔雀石绿过程中，除脂肪含量影响与自身解毒能力外，还会受到环境因素的影响，如PH值和温度等。
在体内孔雀石绿的代谢方式有两条:首先，在还原酶的催化作用下,孔雀石绿可降解成无色孔雀石绿;其次，经N-脫甲基作用,在细胞色素催化下,生成次级或初级代谢产物芳香胺。
另外,无色孔雀石绿也有两条代谢方式:首先,基于氧化酶作用下,无色孔雀石绿会被重新氧化成孔雀石绿;其次,无色孔雀石绿经N-脫甲基作用，在催化作用下，酯化后与DNA形成DNA加合物。
2孔雀石绿的毒性与致毒机制据大量研究证实,在水产品中，孔雀石绿对动物的毒性较强,导致鱼皮肤和鳃上皮细胞轻度炎症,扩大肾小管壁细胞的胞核,使肾管腔有轻度扩张，甚至会影响鱼的生长与摄食,减少鱼肠中酶的分泌量。
水产品有机有害物的检测—孔雀石绿的测定
定量方法
四
内标法：
① 实验过程采用同位素内标法。 ② 内标物为：同位素内标氘代孔雀石绿(D5-MG)、
同位素内标氘代隐色孔雀石绿(D6-LMG)，纯度 大于98%。
检测原理
二
提取原理
试样中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶 紫、隐色结晶紫残留用乙腈提取，中性氧 化铝和阳离子交换固相萃取柱净化。
定量方法
1.液相色谱串联质谱测定 2.内标法定量。
三
1.提取过程：
提取步骤
称取5g样品于50 mL塑料离心管中； 加入20 μL内标标准工作液,加人10 mL乙腈； 匀浆2 min(l0000 r/min)； 超声提取10 min,离心3 min(3000 r/min)； 取上清液再加人10 mL乙腈,重复提取一次；
提取步骤
三
2.净化过程：
活化：5 mL乙腈。 上样：准确吸取5mL过固相萃取柱。 洗脱：用4 mL乙腈淋洗收集。 浓缩：洗脱液氮吹至0.5mL(≤45℃)。 复容：1.0 mL乙腈溶解，再加入1mL 乙酸铵溶液，过0.45 μm滤膜测定。
检测范围
四
种类及项目参数：
① 鱼、虾、蟹、贝、鱼粉、植物源性饲 料、浓缩饲料、配合饲料、饲料添加 剂、精料补充料。
检测原理 提取步骤 检测范围
孔雀石绿 简介
一
孔雀石绿室一种带有金属光泽的绿色结晶体，易 溶于水，水溶液呈蓝绿色。曾经作为杀菌剂，杀虫剂， 消毒剂 广泛应用于养殖业中，预防水产品水霉病、 鳃霉病和寄生虫病等，也用于水产品的运输和存放过 程中消毒并延长鱼类的生存时间，经研究表明孔雀石 绿进入人体或动物体后，代谢产物有高毒性、高残留 具有致畸 致癌 致突变风险严重危害人体或水产品安 全，因此我国已将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。
水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法
水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法1范围本方法规定了水产品及其养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于鱼肉及养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的快速测定。
2原理样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿经有机试剂提取，吸附剂净化，正己烷除脂后，加入氧化剂将隐色孔雀石绿氧化成为孔雀石绿，经浓缩复溶后，孔雀石绿与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。
通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量进行定性判定。
3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 试剂3.1.1正己烷。
3.1.2乙腈。
3.1.3冰乙酸。
3.1.4盐酸。
3.1.5吐温-20。
3.1.6氯化钠。
3.1.7对-甲苯磺酸。
3.1.8无水乙酸钠。
3.1.9盐酸羟胺。
3.1.10无水硫酸钠。
3.1.11中性氧化铝：层析用，100目~200目。
3.1.12二氯二氰基苯醌。
3.1.13氯化钾。
3.1.14磷酸二氢钾。
3.1.15十二水合磷酸氢二钠。
3.1.16饱和氯化钠溶液：称取氯化钠（3.1.6）200 g，加水500 mL，超声使其充分溶解。
3.1.17盐酸羟胺溶液（0.25 g/mL）：称取2.5 g 盐酸羟胺（3.1.9），用水溶解并稀释至10 mL，混匀。
3.1.18乙酸盐缓冲液：称取4.95 g 无水乙酸钠（3.1.8）及0.95 g 对-甲苯磺酸（3.1.7）溶解于950 mL 水中，用冰乙酸（3.1.3）调节溶液pH 为4.5，用水稀释至1 L，混匀。
3.1.19二氯二氰基苯醌溶液（0.001 mol/L）：称取0.0227 g 二氯二氰基苯醌（3.1.12）置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，混匀。
水产品中孔雀石绿快速检测方法
水产品中孔雀石绿快速检测方法
组织检测步骤：
鱼虾等去皮、脂肪，用均质器均质样本，称取2±0.05g均质物于15ml离心管；加入1瓶去脂试剂，振荡2min，室温4000rpm，离心3min。
倒掉上清液，把肉样弄松散（若要做添加实验，请在此刻加入添加物）；加入1瓶提取剂A，立即摇匀，然后加入1瓶提取剂B，充分振荡混合5min，室温4000rpm，离心5min；取上层有机层4ml到15ml离心管中，加入20ul衍生化试剂，涡旋1min，加入4ml净化剂，颠倒混匀1min，静置1min；取下层（溶液显紫红色）2ml，55℃下使用便携式空气吹干仪吹干；然后加入0.5ml缓冲液剧烈涡旋2min，待检。
检测:从包装中取出微孔，用移液器吸取待检液体80ul至微孔中充分吸打均匀，然后全部滴加至检测卡加样孔（检测卡平放），静置8-15分钟，根据示意图判读结果（见彩图）水样检测步骤：
①用移液器吸取80µl样本液至样品孔中。
②静置5-8分钟，根据示意图判读结果。
结果判定及示意图：
在试纸卡的中央判读区喷有2条线，上面一条为对照线(C线)，下面一条为测试线(T线)。
若样品液中孔雀石绿的浓度小于检测限时，则T线显色比C线强，或显色与C线相近；若样品液中孔雀石绿的浓度大于检测限时，则T线显色比C线浅很多或T线显绿色。
实验设备：
1、孔雀石绿快速检测卡；
2、PRO-12L空气吹干仪;
3、HH-1水浴锅；
4、80-2离心机；
5、均质器；
6、掌上电子天平。
孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂卡
武汉欣泰扬生物科技有限公司孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂卡 使用说明书（Ⅱ）【产品简介】 本产品用于快速检测水产品组织样品中的孔雀石绿残留，整个检测过程只需要 40 分钟左右，适用于各类企业及检测机构。
表一 产品灵敏度【样品处理】 组织样品（虾要去掉头和壳后彻底清洗干 净，鱼要去鳞后洗干净）应当避光冷藏保存。
样品的处理方法如下：1. 取切碎的一定量的去脂肪组织样本，用均质机均质；2. 称取 3 g 均质物于 50 ml 离心管中；3. 向上述50ml 管中加入提取剂1 溶液 3 ml ，提取剂2溶液3ml,再加入 8 ml 乙腈，盖上盖子剧烈振荡2 min 后，室温下 4000 rpm 离心 5 min ；4. 移取4 ml 上清液于5 ml 离心管中，加入100μl 氧化剂，颠 倒 混 匀 1 0 秒 ，于 6 0 ℃ 环 境 下 ，利 用 氮气 或 空 气 吹 干。
（若管底剩余 少于10 0 微升吹不干液体为正常现象，可直接复溶使用，不影响检测结果）5.向吹干的离心管中加入 0.3 ml MG 复溶液，和正己6.烷 500μl ,于室温下 4000 rpm 离心 1 min ，用移液器移取下层 150 μl 溶液 ，待检。
(移液器枪头一定要抵着管底，取底层溶液，以免取到油脂，导致结果异常)【使用步骤】 测试前先完整阅读使用说明书，使用前将试剂板和待检样本溶液恢复至室温（20℃~30℃）。
从原包装袋中取出试剂板，水平放置于观察者正面，如下图所示（打开后请立即使用）；吸取待检样品 150 微升加入到金标微孔中，等待反应2分钟后，用滴管吹打至完全溶解孔内红色物质； 吸取孔内所有溶液滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在:8～10 分钟读取，其他时间判读无效。
T 线 明显显为绿色的，可判为阳性结果【结果判断】阴性（-）： T 线显色（测试线，靠近加样孔一端）比C 线（对照线）深或一样深，表示样品中待检 药物浓度低于2 ppb 或不含待检药物。
养殖水体中孔雀石绿的快速检测技术
孔雀石绿残留。2 个不同加标浓度的颜色变化情况见表 ’。
表 !" % 个不同加标浓度的颜色变化情况
实验组浓度 . ,-·/0 % ’
步骤 样品
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富集 %
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% 淡绿色可见 淡绿色明显
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% 淡绿色可见 淡绿色明显
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! ! 从实验结果看，当水样中含有 +#* # ,- . /0 浓度的孔 雀石绿时候，能比较明显地在富集、显色和洗脱过程中观
! ! 收稿日期："##$ % #& % &# 作者简介：张晓辉，’()) 年生，男，浙江衢州人，工程师，主要
从事水产品药残检测和水生生物学研究*
’# /9,。 ’* 2* "* &! 洗脱! 加 ’* # /0 洗脱液于筛选柱，收集洗脱 液。
#" 结果与讨论
! ! 本实验通过筛选柱在富集、显色、洗脱过程中的颜色 变化来定性判断水体中孔雀石绿残留情况，若检测的 & 个过程中出现 颜 色 变 化，即 可 初 步 判 定 检 测 水 体 中 含 有
察到淡绿色，当水样中样品浓度达到 ’##* # ,- . /0 时，& 个过程颜色变化明显，而当水样中孔雀石绿浓度为 +* # ,- . /0 和 ’#* # ,- . /0 时，未发现颜色变化。因此，我们可 以初步判定当水样中含 +#* # ,- . /0 或以上时，该筛选柱 能很好的进行 定 性 检 测，此 结 果 可 以 满 足 广 大 基 层 养 殖
摘要：利用筛选柱快速检测养殖水体中孔雀石绿，发现当水样中孔雀石绿浓度为 +* # ,- . /0 和 ’#* # ,- . /0 时，检测过程中未发现颜色变化；当水样中孔雀石绿浓度为 +#* # ,- . /0 或以上时，检测过程中颜色变化 较明显，该结果能满足广大基层养殖户快速筛选的需求。
水产品中孔雀石绿的常规检测方法
142实验研究引言我国有着非常丰富的水产资源，在世界上属于水产养殖大国。
水产品作为我国城乡居民摄入动物蛋白的主要来源之一，在居民的生产生活中占据着极其重要的地位。
随着我国科学技术的进步，经济的快速发展，人民生活水平不断提高，对水产品的需求量也不断增长。
在养殖过程中，为降低生产成本，使用含有激素或者发生霉变的饲料，滥用抗生素、激素等渔用药物防治水产动物疾病，导致水产品药物残留超标，严重危害人类健康。
加强水产品中的渔药检测就显得尤为重要，本文阐述及归纳了水产品中孔雀石绿检测的常用方法，为水产品药物残留检测提供重要依据，对保障人类食品安全具有一定的意义。
1.孔雀石绿的常规检测方法1.1前处理方法1.1.1液液萃取液液萃取也称溶剂萃取或抽提，是指利用在溶液系统中两种或多种物质组分溶解度或分配系数不同的原理，使溶质物质从其中一种溶剂中转移到另一溶剂中提取方法。
通过静置过程，将出现分层现象的两种互不相容的物质进行分离的操作，叫做分液。
提取孔雀石绿的过程中常用的萃取溶液是二氯甲烷和无水乙醇。
它的优点是可以在常温条件下进行，操作较为方便，不需要特殊的实验装置和操作技术；缺点是有机溶剂的消耗量较大，挥发性较强的溶剂应尽量在通风橱内操作并做好个人防护工作。
1.1.2固相萃取固相萃取是于20世纪80年代发展起来的一种样品前处理技术，通常与液相色谱技术相结合，主要用于样品前处理的分离、提纯和浓缩过程。
它的原理是通过固相萃取小柱中的固体吸附剂吸附液体中的目标化合物，将样品的基质与干扰物有效的分离，再用洗脱液进行洗脱或者通过加热过程使目标化合物解吸附，最后经过氮吹或者旋蒸，达到浓缩与富集目标化合物的目的。
固相萃取的优点是操作简单，分离时间短，试剂消耗量少，可有效提高被测样品的回收率，对于痕量分析物有较为出色的检测能力；缺点是成本较高，属于一次性使用的实验耗材，同时需要专业人员进行方法开发。
1.1.3分散固相萃取净化技术分散固相萃取净化技术也称为QuEChERS技术，是2003年由美国农业部Anastassiades等人开发，提出之后又经过多次验证和方法改进正式确立。
孔雀石绿、亮绿检测方法-液质联用
超高效液相色谱-串联质谱法同时检测水产品中孔雀石绿（隐）、结晶紫（隐）和亮绿陈军（龙大食品检测中心）摘要： 采用乙腈提取水产品组织中的目标物，液液分配到二氯甲烷层，10%氯化钠水溶液去除水溶性杂质，无水硫酸钠脱水及过滤固体杂质。
浓缩定容后，过中性氧化铝柱净化，采用UPLC/MS/MS 进行检测，方法简便、快捷、稳定、灵敏度高，定量下限为0.0005mg/kg，可满足水产品亮绿药物的检测的要求。
检测项目：亮绿（brilliant green ，BG ）属于碱性三苯甲烷类染料，具有类似的结构，在水产养殖过程中，常作为杀菌剂和抗寄生虫药，用于防治各种鱼病。
由于三苯甲烷具有致突变、致畸和致癌作用，欧美、中国和日本等宣布严禁在水产养殖中使用孔雀石绿和结晶紫，并规定孔雀石绿（含隐色孔雀石绿）和结晶紫（含隐色结晶紫）不得检出。
【药代动力学】。
适用范围：本方法适用于虾、鱼、蟹等水产样品以上五种药物残留量的检测。
实验部分：一、试剂与材料 1.1试剂1.1.1 乙腈（色谱纯） 1.1.2 超纯水1.1.3 无水硫酸钠（分析纯） 1.1.4 氯化钠（分析纯） 1.1.5 异丙醇（分析纯） 1.1.6 甲酸（色谱纯） 1.1.7 冰乙酸（色谱纯） 1.1.8 乙酸铵（色谱纯） 1.1.9 甲醇（色谱纯） 1.2仪器材料1.2.1 飞利浦食品加工机Un Re gi st er ed1.2.2 50ml 带盖离心管 1.2.2 离心机1.2.3 250mL 分液漏斗1.2.4 中性氧化铝小柱(LC-Alumina-N)：100mg,3mL 1.2.5 旋涡混合仪 1.2.6 150mL 茄形瓶 1.2.7 氮吹仪 1.2.8 移液管 1.2.9 滤纸 1.2.10 UPLC/MS/MS1.3 溶液1.3.1 0.1甲酸乙腈：取0.5mL 甲酸加入到500mL 的乙腈中，摇匀。
1.3.2 5mmol/L 乙酸铵0.1%甲酸水溶液：称取0.19g 乙酸铵溶于500mL 水，然后向其中加入0.5mL甲酸，摇匀。
高效液相色谱法测定水体中孔雀石绿残留量
107实验研究孔雀石绿，又称为碱性绿、孔雀绿等，其为一类生物染色剂、染料，商品名中含有草酸盐及氯化锌两种规格，呈现翠绿色结晶体，主要包含两种结构式，即盐酸盐和无色孔雀石绿，易溶于水、乙醇及甲醇中，其水溶液呈现蓝绿色，在水生生物体内代谢产物变为无色孔雀石绿。
当前水产品感染孔雀石绿途径主要包含养殖、运输及存放，其中养殖户进行鱼苗孵阶段，会利用孔雀石绿将其各类鱼病防治。
孔雀石绿不仅拥有高毒素特征，而且致癌及致畸性较强，可在动物内长期存留，通过动物代谢之后转化为无色孔雀石绿，对人们健康构成严重威胁。
本次实践的主要内容是使用高效液相色谱法测定水体中孔雀石绿的残留量。
检测结果的准确性、稳定性有利于有关监管部门对水产养殖基地兽药使用的监控，对食品安全起到预警、监督作用。
1.材料与方法1.1仪器与设备本试验中主要涉及以下设备：Agilent 1100型高效液相色谱仪：配荧光检测器；Mettler Tolledo(PL202-L/100)百分一天平；IKA MS3 basic旋涡混合器；OA-SYS氮吹仪；CNW固相萃取装置;Thermo移液器（1mL 5mL 10mL ）；Microman微量移液器（20μL~100μL ）1.2材料与试剂乙腈：色谱纯；二氯甲烷；冰乙酸；氨水；孔雀石绿标准品(Dr.Ehrenstorfer GmbH)：纯度≥98%。
提取液：盐酸羟胺3g，对甲苯磺酸0.24 g溶于100 mL水中。
硼氢化钾溶液［ 0.2% ］：称取0.2 g硼氢化钾溶于100 mL水中，现配现用。
乙酸铵缓冲溶液［ 0.125mol /L］：称取9.64 g无水乙酸胺溶解1000 mL水中，用氨水调pH至4.5，过0.45μm滤膜备用。
乙酸铵缓冲溶液［ 0.1mol /L］：称取7.71 g无水乙酸胺溶解1000 mL水中，用氨水调pH至10.0，过0.45μm 滤膜备用。
PRS柱洗脱液：乙酸铵缓冲溶液（0.1mol /L）+乙腈=1+1，现配现用。
孔雀石绿的快速检测方法
水中孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿、隐色结晶紫
快速检验方法
一、【检测原理】
水中的孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物隐色孔雀石绿、隐色结晶紫经过孔雀石绿专用SPE小柱富集、衍生化后在小柱上形成有色环带，可初步判断水样中是否含有待检物质。
用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，即可定性检测。
二、【检测范围】
水体
三、【技术指标】
检测下限：2.0μg/kg
四、【检验步骤】
1、取样：取待检水样约50mL，若样品杂质较多可先用滤纸过滤去除杂质。
2、过层析柱：将50mL注射器与层析柱串接，将1中水样加入注射器中。
从上口加压，加快流速，建议样本通过柱子的时间为10min左右。
3、观察结果：去掉注射器，加入2mL蒸馏水洗涤，用吸耳球从上口加压挤干，观察层析柱中吸附剂颜色变化，若吸附剂逐渐形成绿色环带，可初步判断样本中含有孔雀石绿；若吸附剂逐渐形成紫色环带，可初步判断样本中含有结晶紫。
4、检测孔雀石绿或结晶紫含量：取0.8mL洗脱液于富集有待检样品的层析柱中,用比色管收集洗脱液判断是否含有孔雀石绿或结晶紫。
5、隐色孔雀石绿及隐色结晶紫检验：用2mL蒸馏水洗涤4中洗脱后的层析柱挤干，取1瓶衍生化试剂全部加入层析柱中后再加入2mL蒸馏水，挤干后将4中的洗脱剂全部加入层析柱中挤干，用比色管接收洗脱液，再加入0.8mL 洗脱液挤干，合并洗脱液，加入0.5mL蒸馏水及0.5mL萃取剂，振荡混匀后静置观察下层，既可判断是否含有所检物质。
《 水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法》 江西省
《水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法》江西省地方标准编制说明一、立项背景、意义孔雀石绿（Malachitegreen，MG）是一种三苯甲烷类化学物，可作为杀菌剂应用于水产养殖业，预防和治疗鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染，也可作为商业运输的消毒剂使用。
在我国很多地方，尤其是河南、湖北等地的水产养殖业和水产品贩运中，孔雀石绿被普遍使用。
但是孔雀石绿具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，在水产体内有明显的残留现象，其残留时间达到100天以上。
欧盟法案2002/675/EC规定，动物源性食品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留总量限制为2 μg/kg。
日本肯定列表也明确规定在进口水产品中不得检出孔雀石绿残留。
我国农业部于2002年12月24日发布235号公告《动物性食品中兽药残留最高限量》，孔雀石绿被列为禁止使用药物，在动物性食品中不得检出。
尽管如此，由于作为抗菌药，孔雀石绿药物具有杀菌能力强、抗菌谱广、价格低廉和疗效好等优点，仍然有养殖户在水产养殖中用于预防和治疗鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染，残留超标问题一次次困扰着水产品出口企业。
目前，水产品中孔雀石绿药物的残留检测主要是液质联用的分析手段，该方法虽然检测结果精确，但需要的仪器设备昂贵，分析方法前处理繁琐、溶剂消耗量大、检测周期长、检测成本高，不适于对大量样品进行低成本快速筛选、现场判定的需要。
快速检测技术相对于传统和经典的化学检测与仪器检测而言，其特点是检测所需时间相对较少，对仪器设备等条件要求不高，能携带到交易（生产）现场实施检测，既快速方便，又节约成本。
免疫胶体金快速检测技术被认为是最具应用价值和发展潜力的快速痕量分析技术之一，是二十世纪九十年代新兴的一种新型免疫学检测技术。
其反应所需的原料全部或大部分已整合到试剂中，当待测样品加入到样品膜上后，由于微孔膜的毛细管作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，整个反应仅需要８～10分钟，滴样后用肉眼直接判断结果无需特殊仪器设备。
水产中孔雀石绿残留量快速检测新技术—一干式分析法
ANAlYSIS & TEST分析与检测水产中孔雀石绿残留量快速检测新技术 ——干式分析法□ 北京六角体科技发展有限公司 供稿目前检测孔雀石绿方法有实验室标准方法及现场快速筛查方法。
实验室的标准检测方法主要是高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法，能够提供较高的灵敏度和回收率，但是色谱法需要昂贵的仪器，费时且检测成本高，不适用于大量样品的筛选，也难在基层检测单位以及食品企业推广使用，同时检测时间仍很难满足企业产品质量安全控制的实际需求。
现场快速筛查方法快速、经济但只是起到对待检样品的初步快速筛查，实验结果受人为因素影响较大，不能准确定性、定量和及时记录传输结果。
现本方法采用北京六角体科技发展有公司限研制的便携干式分析仪，结合六角体科技研制的孔雀石绿快速检测试剂盒-柱净化点滴板比色法，利用便携干式分析仪记录色斑达到现场定性定量快速准确检测孔雀石绿的目的。
水产品中孔雀石绿快速提取样液经过柱色谱分离净化及隐色孔雀在线快速衍生转化成有色孔雀石绿，分离衍生样液并浓缩于聚四氟乙烯点滴板上，采用便携干式分析仪快速定量检测，设计了5个添加水平（1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg/kg）6次重复试验。
结果表明，方法线性范围为0～20.0μg/kg；检测限均为1.0μg/kg，回收率在70%～85%之间，RSD在3.6%～12.5%之间，在30分钟内完成整个检测过程。
本方法操作简单、检测时间短、对实验人员素质要求不高、可准确定量检测水产品中孔雀石绿含量，并可现场记录传输结果，可以满足基层检测及执法单位的需求。
实验部分1.仪器、设备和试剂便携干式分析仪(北京六角体科技发展有限公司)；孔雀石绿快速检测试剂盒(北京六角体科技发展有限公司)。
2.实验方法(1)检测范围鱼、虾等水产品肌肉组织。
(2)技术指标检测下限：1.0μg/kg。
图1 样品前处理流程图. All Rights Reserved.30食品安全导刊•技术 2013年９月（3）样品前处理样品前处理操作如图1所示。
KJ201701 水产品 孔雀石绿胶体金
附件1水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201701）1范围本方法规定了水产品及其养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于鱼肉及养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的快速测定。
2原理样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿经有机试剂提取，吸附剂净化，正己烷除脂后，加入氧化剂将隐色孔雀石绿氧化成为孔雀石绿，经浓缩复溶后，孔雀石绿与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。
通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量进行定性判定。
3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 试剂3.1.1正己烷。
3.1.2乙腈。
3.1.3冰乙酸。
3.1.4盐酸。
3.1.5吐温-20。
3.1.6氯化钠。
3.1.7对-甲苯磺酸。
3.1.8无水乙酸钠。
3.1.9盐酸羟胺。
3.1.10无水硫酸钠。
3.1.11中性氧化铝：层析用，100目~200目。
3.1.12二氯二氰基苯醌。
3.1.13氯化钾。
3.1.14磷酸二氢钾。
3.1.15十二水合磷酸氢二钠。
3.1.16饱和氯化钠溶液：称取氯化钠（3.1.6）200g，加水500mL，超声使其充分溶解。
3.1.17盐酸羟胺溶液（0.25g/mL）：称取2.5g盐酸羟胺（3.1.9），用水溶解并稀释至10mL，混匀。
3.1.18乙酸盐缓冲液：称取4.95g无水乙酸钠（3.1.8）及0.95g对-甲苯磺酸（3.1.7）溶解于950mL 水中，用冰乙酸（3.1.3）调节溶液pH为4.5，用水稀释至1L，混匀。
3.1.19二氯二氰基苯醌溶液（0.001mol/L）：称取0.0227g二氯二氰基苯醌（3.1.12）置于100mL 棕色容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，混匀。
4℃避光保存。
3.1.20复溶液：称取8.00g氯化钠（3.1.6），0.20g氯化钾（3.1.13），0.27g磷酸二氢钾（3.1.14）及2.87g十二水合磷酸氢二钠（3.1.15）溶解于900mL水中，加入0.5mL吐温-20（3.1.5），混匀，用盐酸（3.1.4）调节pH为7.4，用水稀释至1L，混匀。
实验水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定
实验十五、水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定标准依据：GB/T 19857—2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定一、实验目的：学习水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿（Leucomalachite green）、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫(Leucocrystal violet)残留量的高效液相色谱的测定方法。
二、实验原理：试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-PbO2柱后衍生测定，外标法定量。
三、实验试剂与仪器：（一）试剂(除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
)乙腈：液相色谱纯。
二氯甲烷。
甲醇：液相色谱纯。
乙酸盐缓冲液：溶解4.95g 无水乙酸钠及0.95g对-甲苯磺酸于950mL水中,用冰乙酸调节溶液pH到4.5, 最后用水稀释到1L。
20%盐酸羟胺溶液。
1.0 mol/L对-甲苯磺酸：称取17.2g对-甲苯磺酸，并用水稀释至100mL 。
50 mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取3.85g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH到4.5。
二甘醇。
酸性氧化铝：80-120目。
二氧化铅。
硅藻土545：色谱层析级。
标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV），纯度大于98%。
标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分别配制成100µg/mL的标准贮备液，再用乙腈稀释配制1µg/mL的标准溶液。
-18℃避光保存。
混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为20ng的混合标准溶液。
-18℃避光保存。
（二）仪器和设备1、高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器。
2、匀浆机。
3、离心机：4 000 r/min。
4、固相萃取装置。
5、25% PbO2氧化柱：不锈钢预柱管(5cm(4mm i.d)，两端附2(m过滤板，抽真空下，填装含有25% PbO2的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。
实验十五水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定
实验十五、水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定标准依据：GB/T19857—2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定一、实验目的：学习水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿（Leucomalachitegreen）、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫(Leucocrystalviolet)残留量的高效液相色谱的测定方法。
二、实验原理：试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-PbO2柱后衍生测定，外标法定量。
三、实验试剂与仪器：（一）试剂(除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
)乙腈：液相色谱纯。
二氯甲烷。
甲醇：液相色谱纯。
乙酸盐缓冲液：溶解4.95g无水乙酸钠及0.95g对-甲苯磺酸于950mL水中,用冰乙酸调节溶液pH到4.5,最后用水稀释到1L。
20%盐酸羟胺溶液。
1.0mol/L对-甲苯磺酸：称取17.2g对-甲苯磺酸，并用水稀释至100mL。
50mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取3.85g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH 到4.5。
二甘醇。
酸性氧化铝：80-120目。
二氧化铅。
硅藻土545：色谱层析级。
标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV），纯度大于98%。
标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分别配制成100µg/mL的标准贮备液，再用乙腈稀释配制1µg/mL的标准溶液。
-18℃避光保存。
混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为20ng的混合标准溶液。
-18℃避光保存。
（二）仪器和设备1、高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器。
2、匀浆机。
3、离心机：4000r/min。
4、固相萃取装置。
5、25%PbO2氧化柱：不锈钢预柱管(5cm⨯4mmi.d)，两端附2μm过滤板，抽真空下，填装含有25%PbO2的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。
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水产品中孔雀石绿快速检测方法
组织检测步骤：
鱼虾等去皮、脂肪，用均质器均质样本，称取2±0.05g均质物于15ml离心管；加入1瓶去脂试剂，振荡2min，室温4000rpm，离心3min。
倒掉上清液，把肉样弄松散（若要做添加实验，请在此刻加入添加物）；加入1瓶提取剂A，立即摇匀，然后加入1瓶提取剂B，充分振荡混合5min，室温4000rpm，离心5min；取上层有机层4ml到15ml离心管中，加入20ul衍生化试剂，涡旋1min，加入4ml净化剂，颠倒混匀1min，静置1min；取下层（溶液显紫红色）2ml，55℃下使用便携式空气吹干仪吹干；然后加入0.5ml缓冲液剧烈涡旋2min，待检。
检测:从包装中取出微孔，用移液器吸取待检液体80ul至微孔中充分吸打均匀，然后全部滴加至检测卡加样孔（检测卡平放），静置8-15分钟，根据示意图判读结果（见彩图）水样检测步骤：
①用移液器吸取80µl样本液至样品孔中。
②静置5-8分钟，根据示意图判读结果。
结果判定及示意图：
在试纸卡的中央判读区喷有2条线，上面一条为对照线(C线)，下面一条为测试线(T线)。
若样品液中孔雀石绿的浓度小于检测限时，则T线显色比C线强，或显色与C线相近；若样品液中孔雀石绿的浓度大于检测限时，则T线显色比C线浅很多或T线显绿色。
实验设备：
1、孔雀石绿快速检测卡；
2、PRO-12L空气吹干仪;
3、HH-1水浴锅；
4、80-2离心机；
5、均质器；
6、掌上电子天平。