水产品中孔雀石绿的测定
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5.4.5.离心后若于上层有机层内观察到白色胶状物时，用竹棒或移液枪头搅拌上层有机层后再次以1700×g(约3500rpm)离心10分钟。
5.4.6.取3mL上层液(盐酸-乙酸乙酯)至10mL玻璃管中，于60℃下，利用氮气将有机溶剂吹干。
5.4.7.于此玻璃管中加入正己烷1mL ,剧烈震荡将残余物完全溶解(若氮吹后的管内有很多油脂时，可将正己烷加入量改为2mL。)。
5.3.9.水浴锅。
5.3.10.聚四氟乙烯离心管：5mL，50mL，具塞。
5.4.样品处理
5.4.1.将2克已均质之样品放入15mL离心管中，加入0.4%还原剂3mL后立刻震荡1分钟使成肉浆状。
5.4.2.静置30分钟。
5.4.3.再加入6mL 0.002N盐酸-乙酸乙酯，震荡1分钟。
5.4.4.以离心机离心1700×g(约3500rpm)10分钟。
颁布日期：2014年月日
层，待玻璃管冷却至室温后再次以离心机离心1700×g(约3500rpm) 10分钟。用吸管吸去上层液(正己烷)，再吸取下层液(水层)备用
稀释倍数：1
5.5.酶联免疫测定
5.5.1.使用前将试剂盒置于室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2-8℃不要冷冻;
XXX实验室检测中心
管理体系文件
作业指导书
（第A版第0次修改）
文件编号：
编写：
审核：
批准：
批准日期：
受控状态：□受控□非受控
正副版本：□正本□副本
持有者：
发布日期：实施日期：
作业指导书文件编号：Fra bibliotek第页共页
标题：水产品中孔雀石绿的测定
第A版第0次修改
颁布日期：2014年月日
1.目的
使孔雀石绿的测定处于受控状态，保证孔雀石绿检测结果的准确性与一致性；规范参加本项目检测工作人员的操作规程。
5.4.8.缓缓加入1mL样品稀释液，轻柔混合震荡(vortex) 1分钟。
5.4.9.以离心机离心1700×g(约3500rpm) 10分钟。
5.4.10.若离心后不能确实分层而在两层问出现乳化层时，请置于沸水中隔水加热至上下确实分
作业指导书
文件编号：
第页共页
标题：水产品中孔雀石绿的测定
第A版第0次修改
5.3.仪器和设备
5.3.1.酶标仪：配备450 nm滤光片。
5.3.2.分析天平：感量0.001g，感量0.0001g。
5.3.3.恒温培养箱。
5.3.4.均质器。
5.3.5.旋涡振荡器。
5.3.6.离心机：离心力≥4000g。
5.3.7.氮吹仪
5.3.8.微量单道/多道移液器：10μL～100μL；100μL～1000μL； 50μL～300μL。
2.适用范围
本作业指导书规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留量的酶联免疫测定方法。
本作业指导书适用于鱼、虾以及鱼池或者鱼缸水样中的总的孔雀石绿残留量的检测。
3.引用依据
孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒使用说明书。
水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量的快速筛选测定 酶联免疫法DB34/T 1421-2011
5.酶联免疫吸附法
5.1.原理
本孔雀石绿类酶联免疫检验试剂，主要是利用还原剂将样品中的孔雀石绿还原成隐性孔雀石绿后，利用抗原与抗体之特异性免疫化学反应的基本原理来进行的，换句话说，就是利用酶标记物与样品中之隐性孔雀石绿对微孔中之抗体来进行竞争反应。
在整个反应当中，如果样品中之隐性孔雀石绿残留的越多，相对地就会竞争掉越多的抗体，使得结合了与微孔盘上包被的抗原结合抗体的二次抗体相对地就会减少。因此，反应中之酶标记物结合体-底物溶液之呈色就会很淡，甚至几乎没有颜色，此即为阳性反应。反之，若样品中没有含隐性孔雀石绿，则呈色会比较深，与阴性标准品呈色几乎是一样的，此即为阴性反应。
5.5.2.于适当微孔分别加入100μL隐性孔雀石绿标准液。
5.5.3.在另外的微孔加入100μL已完成前处理之样品溶液。
5.5.4.再于每一微孔另再加入100μL的1倍隐性孔雀石绿抗体。
5.5.5.轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应30分钟。
5.5.6.将微孔中之反应液甩掉，再将300μL的1倍清洗液加满每一微孔后甩掉，重复此步骤洗3次。
5.5.12.于每一微孔加入底物溶液100μL。
5.5.13.轻敲盘子四周，使其充分混合后室温卜反应20分钟。
5.5.14.加入反应终止液，每一微孔加入100μL。
5.5.15.酶标仪以单波长450 nm或双波长450 nm/650 nm判读。
5.6.结果判定
5.6.1.定性判定
用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含孔雀石绿浓度范围(ng/ml)。假设样品1的吸光度值为0.313，样品2的吸光度值为1.032，标准液吸光度值分别是:0ppb为1.892；0.025ppb为1.501；0.05ppb为1.175；0.1ppb为0.751；0.3ppb为0.421；0.6ppb为0.198。则样品1的浓度范围0.3ppb-0.6ppb;样品2的浓度范围0.05ppb-0.lppb。(再乘以相应的稀释倍数)
5.2.试剂和材料
5.2.1.实验室用试剂：所用试剂除另有规定外，均为分析纯。水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。
作业指导书
文件编号：
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标题：水产品中孔雀石绿的测定
第A版第0次修改
颁布日期：2014年月日
5.2.2.乙酸乙酯。
5.2.3.正己烷。
5.2.4.12N盐酸溶液
5.2.5.孔雀石绿酶联免疫试剂盒
水产品中孔雀石绿和结品紫及其代谢产物的快速测定方法SN/T 1768-2006
水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法GB/T 20361-2006
4.概述
孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，既是杀真菌剂，又是染料。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。研究显示，孔雀石绿在鱼体内残留时间长，且具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用。
5.5.7.最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。
5.5.8.于每一微孔加入100μL的1倍二次抗体。
5.5.9.轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应30分钟。
5.5.10.将微孔中之反应液甩掉，再将300μL的1倍清洗液加满每一微孔后甩掉，重复此步骤洗3次。
5.5.11.最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。
5.4.6.取3mL上层液(盐酸-乙酸乙酯)至10mL玻璃管中，于60℃下，利用氮气将有机溶剂吹干。
5.4.7.于此玻璃管中加入正己烷1mL ,剧烈震荡将残余物完全溶解(若氮吹后的管内有很多油脂时，可将正己烷加入量改为2mL。)。
5.3.9.水浴锅。
5.3.10.聚四氟乙烯离心管：5mL，50mL，具塞。
5.4.样品处理
5.4.1.将2克已均质之样品放入15mL离心管中，加入0.4%还原剂3mL后立刻震荡1分钟使成肉浆状。
5.4.2.静置30分钟。
5.4.3.再加入6mL 0.002N盐酸-乙酸乙酯，震荡1分钟。
5.4.4.以离心机离心1700×g(约3500rpm)10分钟。
颁布日期：2014年月日
层，待玻璃管冷却至室温后再次以离心机离心1700×g(约3500rpm) 10分钟。用吸管吸去上层液(正己烷)，再吸取下层液(水层)备用
稀释倍数：1
5.5.酶联免疫测定
5.5.1.使用前将试剂盒置于室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2-8℃不要冷冻;
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（第A版第0次修改）
文件编号：
编写：
审核：
批准：
批准日期：
受控状态：□受控□非受控
正副版本：□正本□副本
持有者：
发布日期：实施日期：
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第A版第0次修改
颁布日期：2014年月日
1.目的
使孔雀石绿的测定处于受控状态，保证孔雀石绿检测结果的准确性与一致性；规范参加本项目检测工作人员的操作规程。
5.4.8.缓缓加入1mL样品稀释液，轻柔混合震荡(vortex) 1分钟。
5.4.9.以离心机离心1700×g(约3500rpm) 10分钟。
5.4.10.若离心后不能确实分层而在两层问出现乳化层时，请置于沸水中隔水加热至上下确实分
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文件编号：
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标题：水产品中孔雀石绿的测定
第A版第0次修改
5.3.仪器和设备
5.3.1.酶标仪：配备450 nm滤光片。
5.3.2.分析天平：感量0.001g，感量0.0001g。
5.3.3.恒温培养箱。
5.3.4.均质器。
5.3.5.旋涡振荡器。
5.3.6.离心机：离心力≥4000g。
5.3.7.氮吹仪
5.3.8.微量单道/多道移液器：10μL～100μL；100μL～1000μL； 50μL～300μL。
2.适用范围
本作业指导书规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留量的酶联免疫测定方法。
本作业指导书适用于鱼、虾以及鱼池或者鱼缸水样中的总的孔雀石绿残留量的检测。
3.引用依据
孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒使用说明书。
水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量的快速筛选测定 酶联免疫法DB34/T 1421-2011
5.酶联免疫吸附法
5.1.原理
本孔雀石绿类酶联免疫检验试剂，主要是利用还原剂将样品中的孔雀石绿还原成隐性孔雀石绿后，利用抗原与抗体之特异性免疫化学反应的基本原理来进行的，换句话说，就是利用酶标记物与样品中之隐性孔雀石绿对微孔中之抗体来进行竞争反应。
在整个反应当中，如果样品中之隐性孔雀石绿残留的越多，相对地就会竞争掉越多的抗体，使得结合了与微孔盘上包被的抗原结合抗体的二次抗体相对地就会减少。因此，反应中之酶标记物结合体-底物溶液之呈色就会很淡，甚至几乎没有颜色，此即为阳性反应。反之，若样品中没有含隐性孔雀石绿，则呈色会比较深，与阴性标准品呈色几乎是一样的，此即为阴性反应。
5.5.2.于适当微孔分别加入100μL隐性孔雀石绿标准液。
5.5.3.在另外的微孔加入100μL已完成前处理之样品溶液。
5.5.4.再于每一微孔另再加入100μL的1倍隐性孔雀石绿抗体。
5.5.5.轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应30分钟。
5.5.6.将微孔中之反应液甩掉，再将300μL的1倍清洗液加满每一微孔后甩掉，重复此步骤洗3次。
5.5.12.于每一微孔加入底物溶液100μL。
5.5.13.轻敲盘子四周，使其充分混合后室温卜反应20分钟。
5.5.14.加入反应终止液，每一微孔加入100μL。
5.5.15.酶标仪以单波长450 nm或双波长450 nm/650 nm判读。
5.6.结果判定
5.6.1.定性判定
用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含孔雀石绿浓度范围(ng/ml)。假设样品1的吸光度值为0.313，样品2的吸光度值为1.032，标准液吸光度值分别是:0ppb为1.892；0.025ppb为1.501；0.05ppb为1.175；0.1ppb为0.751；0.3ppb为0.421；0.6ppb为0.198。则样品1的浓度范围0.3ppb-0.6ppb;样品2的浓度范围0.05ppb-0.lppb。(再乘以相应的稀释倍数)
5.2.试剂和材料
5.2.1.实验室用试剂：所用试剂除另有规定外，均为分析纯。水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。
作业指导书
文件编号：
第页共页
标题：水产品中孔雀石绿的测定
第A版第0次修改
颁布日期：2014年月日
5.2.2.乙酸乙酯。
5.2.3.正己烷。
5.2.4.12N盐酸溶液
5.2.5.孔雀石绿酶联免疫试剂盒
水产品中孔雀石绿和结品紫及其代谢产物的快速测定方法SN/T 1768-2006
水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法GB/T 20361-2006
4.概述
孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，既是杀真菌剂，又是染料。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。研究显示，孔雀石绿在鱼体内残留时间长，且具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用。
5.5.7.最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。
5.5.8.于每一微孔加入100μL的1倍二次抗体。
5.5.9.轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应30分钟。
5.5.10.将微孔中之反应液甩掉，再将300μL的1倍清洗液加满每一微孔后甩掉，重复此步骤洗3次。
5.5.11.最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。