人二倍体细胞建株

人二倍体细胞建株、检定及制备疫苗规

程

人二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。

[B]A细胞株的要求[/B]

用于疫苗生产的人二倍体细胞株（以下简称细胞株）须按下列规定进行全面检定。新建立细胞株，应按《新生物制品审批办法》进行审批。

1 建立细胞株必须具备下列资料

1.1 建立细胞株所用的胎儿的胎龄和性别，中止妊娠原因。

1.2 建立细胞株所用胎儿的父、母年龄、职业及健康状况，胎儿父、母系三代应无明显遗传缺陷和肿瘤疾病历史。在取胎儿组织时，应作出详细调查，报卫生部审批前，应进行一次重复调查。

1.3 原始组织种类，原代培养的数量与生长状况。

1.4 细胞培养史和生长特征，细胞寿命、世代数。

1.5 细胞生长液的成分。

2 细胞株的检定

2.1 染色体的鉴定和制片

细胞原系建株过程，每8～12世代*应作一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少应有4～5次染色体检查结果。

每次染色体检查，应从同一世代不同细胞培养瓶中取细胞混合再培养，制备染色体标本片。染色体标本应长期保存（直至褪色不能用为止），以备复查。

每次染色体检查，至少应随机取1000个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检查，并作出有助于复查的记录，其中至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相，作出核型分析。并应粗数500个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。

可以G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体带型，应用照相图片作出带型分析。以显带技术检出的核型异常（假二倍体、倒位、易位等）发生率应用比现用上限更宽的基本数据进行评价，合格上限尚未定出。

2.1.1 合格要求

1000个和500个中医细胞标本中，检查异常率、合格的上限（可信限95%，Poison 法）如表1。

表1

异常检查细胞数（个）1000 500 100

染色单体和染色体断裂47 26 8

结构异常17 10 2

超二培性8 5 2

亚二倍性*180 90 18

多倍性**30 17 4

*亚二倍性超过上限时，可选用批标本片重数

**+一个中期细胞内超过53条染色体即为一个多倍体

2.1.2 染色体制片要求

应及时进行制片质量检查，如发现细胞堆积，染色体分散不好等，由于技术原因不适于读片时，可以及时重新制片。但已经读片后，不断因某项超过标准（亚二位性除外）而废弃不算。如考虑到制片技术与质量问题，可重试两次，当有一次结果与原结果相近时，又无可知原因，应以原结果为准。

2.2 外源因子检查

细胞株不应有细菌、霉菌、支原体和病毒等污染。每8～12世代细胞培养物，应进行下列检查。

2.2.1 细菌、霉菌、支原体检查

按《生物制品无菌试验规程》进行。

2.2.2 病毒检查

2.2.2.1 细胞直接观察及红细胞吸附试验

取混合瓶细胞样品，接种小瓶或小管，长成单层后更换维持液，观察2周，镜检细胞，应保持正常形态特征。培养7天，用0.2%～0.5%鸡和豚鼠混合红细胞悬液进行红细胞吸附试验，先置于4～8℃，后置于20～25℃，各30分钟，两次观察结果均应为阴性。

2.2.2.2 细胞培养检查

细胞培养的上清液混合样品，至少接种4种细胞（原代人肾或猴肾细胞、原代兔肾细胞、人源传代细胞和另一批人二倍体细胞）。接种的样品量应占维持液的20%以上，于培养5～7天和14天时，进行红细胞吸附试验（见2.2.2.1项）。培养7天的上清液在同种细胞培养上盲传一代，观察14天，应无细胞病变，红细胞吸附试验应为阴性（在该试验的细胞维持液中，允许加入少量该细胞培养用的牛血清，以利细胞维持和观察）。

2.2.2.3 动物试验检查

用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和鸡胚各一组。每组动物或鸡胚接种受检细胞不应少于107。按表2所列要求进行试验和观察。如80%以上动物和鸡胚健存，此试验为通过。

2.2.2.4 其他检查

细胞株传代过程中，至少于2个不同世代水平进行包涵体、乙型肝炎表面抗原及电镜检查，结果均应为阴性。

2.3 肿瘤原体检查

每8～12世代做一次细胞株的异种移植试验，观察细胞株有无致肿瘤性质，每次实验使用6只乳鼠（3～5日龄）或体重8～10g小白鼠，经抗胸腺血清（ATS）处理，皮下接种活二倍体细胞（最适传代的细胞），观察14天，检查有无结节形成。有结节或可疑病灶时，做病理切片检查。试验同时，用HeLa或其他人源传代细胞系做阳性对照试验，用动物数与处理方法同试验组，接种被检二倍体细胞数应为对照肿瘤细胞数的5倍以上。结果二倍体细胞株不应有移植瘤形成，而对照组细胞则应有80%或更多的动物有典型移植瘤出现（肿瘤结节需经病理组织学诊断）。

表2

动物组别要求

动物或鸡

胚数

接种途

径

接种细胞悬液

量

（ml/只）

观察天

数

结果

乳鼠24小时内2窝≥10脑内

腹腔

0.01

0.1

21 应健存

成鼠12～14g 10 脑内

腹腔

0.03

0.5

21 应健存

豚鼠350～

500g

5 腹腔 5.0 42

应健存,解剖无结

核病变

家兔1.5～

2.5kg

5

皮内

皮下

0.1×10**

9.0

21

无异常

健存

鸡胚9～11日

龄

10 尿囊腔 0.2 3～4

尿液血凝试验阴

性***