微生物实验(4)
实验4放线菌、酵母菌、霉菌形态观察.
实验4放线菌、酵母菌、霉菌形态观察.实验四放线菌、酵母菌、霉菌形态观察（一）放线菌的形态观察1 目的观察放线菌的基本形态特征掌握培养放线菌的几种方法2 原理放线菌一般由分枝状菌丝组成，它的菌丝可分为基内菌丝(营养菌丝)、气生菌丝或有孢子丝三种。
放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。
孢子丝形态多样，有直、波曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。
孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。
它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。
放线菌的菌落早期绒状同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。
3 材料3.1 菌种灰色链霉菌(Str. griseus),天蓝色链霉菌(Str. coelicolor),细黄链霉菌（Str.microflavus）。
3.2 培养基高氏1号培养基。
3.3 器皿培养皿，载玻片、盖玻片、无菌滴管、镊子、接种环、小刀(或刀片)、水浴锅，显微镜，超净工作台，恒温培养箱。
4 流程4.1插片法: 倒平板→插片→接种→培养→镜检→记录绘图4.2压印法: 倒平板→划线接种→挑取菌落→加盖玻片→镜检→记录绘图4.3埋片法: 倒琼脂→切槽→接种→培养→镜检→记录绘图5 步骤5.1插片法5.1.1倒平板将高氏1号培养基熔化后，倒10~12毫升左右于灭菌培养皿内，凝固后使用.5.1.2插片将灭菌的盖玻片以45度角插入培养皿内的培养基中，插入深约为1/2或1/3(图5-1)。
5.1.3接种与培养用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，放置28℃培养3～7天。
5.1.4观察培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压放于载玻片上。
直接在显微镜下观察。
5.2压印法5.2.1制备放线菌平板同5.1.1。
在凝固的高氏1号培养基平板上用划线分离法得到单一的放线菌菌落。
实验4微生物菌落的观察
实验4微生物菌落的观察
一、实验前的准备
（1）准备Petri瓶：Petri瓶是用于生物实验的一种透明塑料或玻
璃容器，可以在其上进行微生物菌落的观察。
Petri瓶的直径大约为9厘米，高度约为2厘米，它一般具有一个小孔，可以用于把培养基引入或培
养基排出。
（2）准备培养基：培养基是用于培养微生物菌落的一种特殊的液体，它通常由淀粉、糖、氮源等组成，可以提供微生物需要的必要营养和营养素。
（3）准备所需的用具：为了完成本次实验，还需要准备一些实验室
常用的用具，如烧杯、移液器、滴管、温控器等。
二、实验过程
（1）将培养基倒入Petri瓶中：将恰当量的培养基倒入清洁的
Petri瓶中，使外壁和底部充分接触培养基，确保培养基在容器内均匀分布。
（2）加入微生物样品：将微生物样品放入容器中，用移液器将样品
匀化，然后用滴管将样品分散在培养基表面，确保培养基表面有足够的微
生物样品。
（3）培养：用温控器控制温度，一般情况下，需要将温度调节在
25℃~30℃之间，并维持适当的湿度，使微生物菌落能够正常生长，一般
情况下，可以在24~36小时内获得较好的观察结果。
（4）观察：取出Petri瓶。
微生物大小的测定-实验四
实验四 微生物大小的测定一、实验目的1. 熟悉目测微尺和物测微尺的使用方法, 掌握测定微生物大小的技能。
3. 巩固光学显微镜的使用方法二、实验要求1. 预习有关微生物大小测定等方面的知识；2. 遵守实验室安全制度, 听从指导教师安排； 3．认真听讲, 不懂就问；4. 完成实验报告三、实验仪器和材料目测微尺、物测微尺、光学显微镜、微生物标本片四、实验原理及方法1.目测微尺:目镜测微尺是一块圆形玻片, 在玻片中央把5mm 长度刻成50等分, 或把10 mm 长度刻成100等分。
测量时, 将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同, 目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样, 因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正, 以求出在一定放大倍数下, 目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
2.物测微尺中央部分刻有精确等分线的载玻片, 一般将1mm 等分成100格, 每格长0.01mm （即10µm ）。
它并不直接测细胞的大小, 而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。
五、实验步骤及内容1. 目测微尺的标定两对重合线间镜台测微尺格数10目镜测微尺每小格长度＝两对重合线间目镜测微尺格数把物测微尺放在载物台上使刻度朝上。
用低倍镜找到物测微尺的刻度, 移动物测微尺和目测微尺使两者的第一条线重合, 顺着刻度找出另一条重合线。
再分别求出高倍镜和油镜下目测微尺每格的长度。
2. 菌体大小的测量将物测微尺取下, 换上标本片, 选择适当的物镜测量目的物的大小, 分别找出菌体的长和宽占目测微尺的格数, 再按目测微尺1格的长度算出菌体的长度和宽度。
六、实验结果1.将目镜测微尺校正结果填入表1物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长度2.在高倍镜下测量枯草芽孢杆菌大., 将结果填入表2序号长/um 宽/um 菌体大小（平均值）长/um×宽/um目镜测微尺格数菌体长度目镜测微尺格数菌体宽度1 2 3 4 5七、思考题1.不改变目镜和目镜测微尺, 而改用不同倍数的物镜来测定同一细菌的大小, 目镜测微尺上所量的物镜上物体的实际长度是否相同？为什么？相似。
实验四-微生物的菌落形态观察、平板菌落计数及菌种保藏(张理珉)
四、菌种衰退的原因
▪ 基因突变－－主要原因 ▪ 1、有关基因发生负突变导致菌种衰退 ▪ 2、表型延迟造成菌种衰退 ▪ 3、质粒脱落导致菌种衰退 ▪ 连续传代－－加速衰退 ▪ 不适宜的培养和保藏条件－－加速衰退
五、菌种衰退的防止
▪ 控制传代次数 ▪ 创造良好的培养条件 ▪ 利用不易衰退的细胞移种传代 ▪ 采用有效的菌种保藏方法 ▪ 讲究菌种选育技术 ▪ 定期进行分离纯化，测试性能
干燥或较干燥 小而紧密
丝状交织，紧密 细而均匀
干燥 大而疏松或大而致密
丝状交织 粗而分化
菌落透明度
菌落与培养 基结合程度
菌落颜色 参 考 菌落正反面 特 颜色的差别 征
菌落边缘
细胞生长速度
气味
透明或稍透明 不结合 多样 相同
一般看不到细胞 一般很快
一般有臭味
稍透明
不透明
不结合
牢固结合
单调，一般呈乳脂或矿 烛色，少数红色或黑色
实验四 微生物的菌落形态观察、 平板菌落计数及菌种保藏
目的要求
1、观察细菌、放线菌、霉菌的菌落形态 特征，并加以区分。
2、掌握平板菌落计数的原则和方法。 3、掌握三种类群微生物的单菌落挑取，
并接种于斜面，进一步加强无菌操作技 术。 4、了解菌种保藏的原理、重要性及常见 方法。
实验内容
▪ 微生物菌落形态观察及区分（细菌、放线菌、 霉菌、酵母菌——放在后面介绍）
做培养基的时间。主要用于细菌总数检测。 （4）其它：如Simplate即用胶，改良MPN产
品。
螺旋平板法
DWS螺旋平板接种仪
aColyte自动菌落计数仪
螺旋平板原理
接种针往外移
动同时自动将 样品稀释1000 倍。
国外微生物学基础实验(四 )-英文版
Mycobacterium Pink colonies tuberculosis Endospore stain E. coli Enterobacter aerogenes Forms endospores Bacillus subtilus
Bacteria Detective
In order to figure out what organism your unknown is, you will need to… 1. Examine your Gram and Acid fast and Endospore stain results.
Apply crystal violet for 1 minute, wash, blot dry.
Blotting paper : Ziehls carbolfuchsin (3 – 5 min heat) : rinse: Acid Alcohol (10 – 15 sec) : rinse : crystal violet (1 min)
Mordant is a chemical used to fix the staining reaction
The structure of the thinner cell walls of Gram negative bacteria cannot hold the dyes previously used, once the decolorizer is applied.
Endospores cannot be stained by normal staining procedures because their walls are practically impermeable to all chemicals.
(完整版)实验四细菌抹片的制备及染色
实验四细菌抹片的制备及染色实验班级：2017级牧医高职（动物微生物）指导老师：陶波实训地点：实训室207时间：2018年6月【目的要求】1.掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法。
2.认识革兰氏染色和瑞特氏染色的反应特性。
【实验材料】试剂用品：载玻片、接种棒、酒精灯、吸水纸、生理盐水、染色液等。
菌种：羊、兔粪便便中提取培养的细菌。
【实验内容】一、细菌涂片的制备1.载玻片准备载玻片应清晰透明，如有残余油渍，可用95%酒精清洗。
2.抹片根据材料情况不同，抹片方法也有差异。
液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片中央均匀涂布适当大小或可采用推片法。
非液体材料（菌落、脓、粪便）应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂抹成适当大小的薄层。
组织脏器材料可先用镊子夹持中部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上触片或涂抹成薄层。
3.干燥上述涂片应让其自然干燥或适当烘干处理。
4.固定有两类固定方法火焰固定法：将干燥好的抹片使其涂抹面向上，以其背面在酒精灯外焰来回拖过数次，略作加热进行固定。
化学固定法：血液、组织脏器等抹片要做姬姆萨染色，不同火焰固定，可将干燥后的抹片滴加数滴甲醇其实作用2~3min后自然干燥进行固定（瑞士染色可不做甲醇固定）。
二、几种常用的染色方法（一）姬姆萨染色将足量的姬姆萨溶液（或将姬姆萨原液稀释）滴加到抹片上，或将抹片浸入盛有姬姆萨染液的染缸中浸染30min 至数小时，取出后水洗，吸干水分后镜检。
（二）瑞特氏染色瑞氏染料是碱性美蓝与酸性伊红混合而成的染料，当溶于甲醇后立即发生分离，分解成酸性和碱性两种染料。
由于细菌菌体蛋白偏酸性，菌体带负电（菌体蛋白等电点多在pH2~5），被染成蓝色。
在以固定好的涂片或触片上滴加足量的瑞氏染液，染色3~5min后水洗，吸干水分后镜检（如染色不理想可重复几次）。
实验四、环境中微生物的检测课件
观察
补做实验一 下周实验课暂停一次
第一部分：环境中微生物的检测
一、背景介绍 什么是微生物 微生物分布
二、实验目的 了解环境中微生物的分布情况
三、实验原理 提供微生物生长所需的营养要素，在实验
室中培养微生物 灭菌的方法和原理 培养基的特性
四、实验方法 1、倒平板
2、环境中微生物的检测
五、实验报告
记录你所培养的微生物的形态
观察时间4月5日（下周四）
12：00——13：00
梅老师班：外间202
尹老师班：里间203
三、个体形态的观察 1、细菌：简单染色法（接种环，取样）
Hale Waihona Puke 、酵母：水封片3、放线菌：插片法
4、霉菌：切片
作业：
1、将观察的细菌、酵母菌、放线菌、霉 菌其菌落特征填入表格
2、划出细菌、放线菌的个体形态简图
3、初步判断你所培养的环境中的微生物 属于哪一大类并说明理由
预习：实验七 生物体内部组织细胞的切片观察（一）
天每
开个
放孩
；子
有的
的花
孩期
子不
是一
菊样
花，
，有
选的
择孩
在子
秋是
天牡
开丹
放花
；，
而选
有择
的在
孩春
➢ He who falls today may rise tomorrow.
子天 是开
梅放
花；
，有
选的
择孩
在子
冬是
天荷
开花
放，
选
择
在
夏
我们，还在路上……
微生物实验四细菌的涂片及简单染色法和革兰氏染色法经典法
【实验报告】
• 2）填表
•
表1 细菌形态的描述
【实验报告】
•
2．思考题
•
（1）涂片为什么要固定，固定时应注
意什么问题？
•
（2）你在涂片染色过程中遇到了什么
问题？试分析其中原因？
•
ห้องสมุดไป่ตู้
（3）革兰氏染色中哪一步是关键，为
什么？你如何控制这一步。
•
（4）不经复染这一步，能否区别革兰
氏阳性菌和阴性菌？
• 2、仪器 显微镜(25台)； • 3、材料 载玻片（每组4个），酒精灯（每组1个）
，接种环（每组1个），擦镜纸，二甲苯、香柏油 ，吸水纸，染色缸等；
【实验用品】
• 4、染料 草酸铵结晶紫（Crystal Violet , CV）、沙黄、吕氏碱性美蓝染液。
1）草酸铵结晶紫染液的配制：
A液： 结晶紫
•
染色前必须先固定细菌，其目的有二
：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘
附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力
。常用的有加热和化学固定两种方法。固
定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞
膨胀或收缩。
【基本原理】
• 二、革兰氏染色法（经典法）基本原理 • 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重
要性状 • 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观
【方法步骤】
• 3、染色
•
⑴初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结
晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。
倾去染色液，用自来水小心地冲洗。
•
⑵媒染 滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。
•
⑶脱色 滴加95%乙醇2-3次，脱色20-25s立
实验4测定细菌生长曲线
仪器：
摇床、分光光度计、取液器。
微生物材料
大肠杆菌菌液、枯草杆菌菌液
培养基
肉汤蛋白胨液体培养基
用具
玻璃比色皿，三角瓶，酒精灯，接种环。
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五、准备步骤
准备菌种：将大肠杆菌和枯草杆菌分别接到于肉汤 蛋白胨液体培养基中，37℃振荡培养14-18h。 另准备大肠杆菌和枯草杆菌斜面种子各1支。
• 将所测的光密度值（OD）与其对应的培养时间作图， 即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线（注意：由于 光密度表示的是培养液的总数，包括活菌与死菌所测 的生长曲线衰亡期不明显）。
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微生物的典型生长曲线图 Ⅰ.延滞期，Ⅱ.指数期，Ⅲ.稳定期，Ⅳ.衰亡期
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四、实验仪器、材料和用具
细菌的生长曲线分为：迟缓期、对数期、稳定期和 衰退期。其表示细菌从开始生长到死亡全过程的动 态。测定微生物的生长曲线对于了解和把握生物的
生长规律是很有帮助的。
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• 测定微生物生长曲线的方法有血球计数法、平板菌落 计数法、称重法和比浊法等。
• 比浊法：由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比。故可 用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。
接种：分别取5ml大肠杆菌或枯草杆菌液接种到装有 100ml培养液的三角瓶中，放摇床37℃，200rmp振 荡培养。同时分别从大肠杆菌或枯草杆菌斜面取菌 接种于100ml培养液中，同样条件培养。
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测定（OD）
每小时吸取200ul培养液到2800ul蒸馏水中摇匀， 以蒸馏水为对照，选420nm波长进行光密度（OD值） 的测定（注意应测定0h的光密度值）。
实训四微生物细胞数计数
使用血球计数板计数பைடு நூலகம்细胞微生 物的数量。
二、实验原理
血球计数板是一块比普通载玻片厚的特 制玻片制成。玻片中央刻有四条槽，中央两 条槽之间的平面比其它平面略低，中央有一 小槽，槽的两边的平面上各刻有9个大方格。 中间的一个大方格为计数室，它的长、宽各 为1mm，深度为0.1mm,容积为3。计数室有两 种规格，一种是把大方格分成16个中格，每 一中格分成25小格，共计400小格；另一种规 格是把大方格分成25中格，每一中格分成16 小格，总共也是400小格。
式中，400为计数板的小格总数； 10000为由计数室3换算成lmL体积的系数
三、实验材料和用具
1.材料 酵母菌悬液
2.用具 显微镜、血球计数板
四、实验方法
1.取清洁干燥的血球计数板，在计数室 上面加盖玻片。在显微镜下找到计数室。
2.取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片 边缘滴一小滴(不宜过多)。菌液可自行渗 入计数室。计数室不得有气泡，然后置高 倍镜下计数。
四、实验方法
3.样品浓度要求每小格内有5～10个菌体为宜。
4.计数时，用16×25的计数板要按对角线方位， 取左上、左下、右上，右下四个中方格(即100 小格)计数酵母菌液，用25×16的计数板，除 计数上述对角线的四个方格外，还需数中央一 个方格的酵母菌数(即80小格)。
四、实验方法
5.每个样品重复计数2～3次，取其平均值， 按上述公式计算每毫升菌液所含的酵母细 胞数。
6.计数完毕，将计数板在水龙头上冲洗，切 勿用硬物洗刷，自行晾干或吹风机吹干， 或用擦镜头纸轻轻擦拭。
五、实验内容
使用血球计数板对样品酵母菌液进行计 数，并计算菌液浓度。
六、实验报告
将微生物计数的结果填入下列空白 1.第一次计数的酵母细胞数目＝ 个。 2.第二次计数的酵母细胞数目＝ 个。 3.从两次的计数结果中求出酵母细胞的平均数目 4.稀释倍数＝ 倍。 5.求出每毫升酵母菌液中的细胞数＝ 个。
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
实验4微生物菌落的观察
实验4微生物菌落的观察微生物菌落的观察是一种常见的实验方法，用于研究微生物的生长和繁殖特性。
本实验通过观察不同条件下微生物菌落的形态、颜色和数量变化，探究微生物的影响因素。
以下为一篇超过1200字的实验报告。
一、实验目的1.了解微生物菌落的基本特征和发展规律。
2.探究温度、pH值和营养物质对微生物菌落的影响。
二、实验原理微生物菌落是指由单个微生物细胞繁殖而成的大群体，具有特定形态、颜色和数量。
微生物菌落的形成受到温度、pH值和营养物质等因素的影响。
在适宜的环境条件下，微生物菌落会迅速生长和繁殖，形成可见的菌落。
三、实验材料与方法1.材料：琼脂培养基、无菌培养皿、微生物菌种液、无菌吸管、无菌接种环等。
2.方法：a.准备琼脂培养基并灭菌。
b.取出无菌培养皿，倒入适量的琼脂培养基并均匀摇晃使其平铺。
c.用无菌吸管取适量的微生物菌种液，在琼脂培养基表面画出菌落或点状样品。
d.使用无菌接种环将不同试验条件的菌种液施加于琼脂培养基上，分别形成不同的菌落。
e.将培养皿盖好，倒置放入恒温箱或恒温培养箱中，设定不同温度和pH值的条件。
f.根据实验设计的时间，观察菌落的形态、颜色和数量变化，拍照记录。
g.分析和比较不同条件下的菌落特征。
四、实验结果与分析本实验分别设置了温度、pH值和营养物质三个因素的实验组。
观察发现，在适宜的温度条件下，微生物菌落生长较为迅速，相反，过高或过低的温度会抑制菌落的形成。
例如，在30°C条件下，菌落的生长速度明显较快，菌落形态呈现圆形或不规则形，颜色多为白色或黄色。
而在较高温度条件下（40°C），菌落的生长速度较慢，形态多呈现不规则形，并呈现土黄色。
在低温条件下（10°C），菌落的生长也受到抑制，数量明显减少，颜色偏向灰色。
对于pH值的影响观察发现，微生物菌落对不同pH值的适应能力有所差异。
在中性条件（pH7）、微碱性条件（pH8）和微酸性条件（pH6）下，菌落均能生长，但形态和颜色有所差异。
实验4 微生物对表面活性剂的降解
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3.实验材料和方法
亚甲基蓝溶液： 100mg 亚甲基蓝溶于100ml蒸馏水。取 30ml于1000ml 容量瓶中，加6.8ml纯H2SO4 和50g NaH2PO4.2H2O, 定容至1000ml。 LAS标准溶液： 称取LAS 0.5 （99.5％LAS标准品）溶于 500ml 蒸馏水，浓度为1mg/ml。取此液10ml稀释至1000ml， 则LAS浓度为0.01mg/ml = 10mg/L。 洗涤液 ： 取6.8ml分析纯浓H2SO4及50gNaH2PO4.2H2O溶 于蒸馏水并稀释至1000ml
3
LAS 的生物降解过程
ω氧化使烷基链末端的甲基被氧化为羧基; β氧化使羧基被氧化并从末端分解脱落两个碳原子
微生物解能力受菌株类型、表面活性剂浓度及其 他理化因素影响
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3.实验材料和方法
菌种：气单胞菌D-4（Aeromonas sp . D –4）
考察不同起浓度LAS对微生物降解率的影响
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4.实验方法
接种：气单胞菌D-4斜面菌种1支，10ml无菌水洗下 菌苔，充分摇匀打散，制成浓菌液。 每瓶培养液中接入菌液1ml，每种LAS浓度接1瓶，另 设1瓶不接种作负对照。
培养: 32℃，振荡200r/min培养48h。离心除去菌体 （8000 r/min离10min），上清液留作测定LAS用。
同绘制标准曲线步骤，测得样品的氯仿提取液的光密度值。
按
D为降解度，％；C0为振荡培养开始时的起始LAS浓度，mg/L；Ct
为振荡培养若干小时后的残留LAS浓度，mg/L。
修正：如果未接菌液的空白对照经培养后，LAS也有所减少，其
实验4 微生物的分离与平板菌落计数法
平板菌落计数法的稀释流程示意图
⑥转移菌液 用一支1ml无菌吸管吸取10-6,10-7,10-8的稀 释菌悬液各0.2ml，向已编好号的无菌平皿。 用涂布器涂匀。 ⑦倒置培养 待平板完全凝固后，倒置于37℃恒温箱中培 养。
⑧计菌落数
培养24、48h、72后，取出平板，算出同一稀 释度三个平板上的菌落平均数，在平板菌落计 数中，可用彩色笔或钢笔在皿底点涂菌落进行 计数，以防漏计和重复。实际工作中同一稀释 度重复对照平板不能少于三个，且同一稀释 度的三个重复对照的菌落数不应相差很大， 否则说明试验误差太大。
由10－6、10－7、10－8三个稀释度计算出 的每ml菌液中菌落形成单位数也不应相差 太大。平板菌落计数法，所选择倒平板的 稀释度是很重要的，培养后所出现的平均 菌落数小于100个左右为好，否则要适当增 加或减少稀释度加以调整。
【结果记录】
下面的表格是对一个培养时间菌液的平板计 数结果的记录表格，其余培养时间菌液的计 数表格请依此自行制作，将菌落计数结果填 入表格：
【实验报告】
1、平板菌落技术的原理。 2、要获得本实验的成功，那几步最为关键， 为什么？ 3、本实验结果记录与分析。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需 要培养一段时间才能取得，而且测定结 果易受多种因素的影响。 但是，由于该计数方法的最大优点是可 以获得活菌的信息，所以被广泛用于生 物制品检验，以及食品、饮料和水等的 含菌指数或污染程度的检测。
【材料和器皿】
①菌种：培养8h的大肠杆菌。 ②培养基 ：LB培养基。 ③器皿：无菌试管，无菌移液管，无菌平 皿等。 ④其他：无菌生理盐水，试管架，记号笔。
【方法和步骤】
①融化培养基 先将LB固体培养基加热融化，置于50度水浴 锅中备用。 ②倒培养液 将固体培养基融化并冷却至45℃左右倒入加 好样品的平皿中，每平皿约倒入10～12ml培 养基，随即快速而轻巧地晃动培养皿，注意 不要使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。
实验四 土壤微生物的分离与纯化
稀释涂板：新鲜土壤。 实验材料：新鲜土壤。 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏 一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。 一号培养基、马铃薯蔗糖培养基。 实验仪器与用具 ∗ 无菌水：带有玻璃珠装有 无菌水：带有玻璃珠装有90ml无菌水三角瓶、 无菌水三角瓶、 无菌水三角瓶 装有9mL无菌水的试管。 无菌水的试管。 装有 无菌水的试管 ∗ 其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、 其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、 电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴等。 电子天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴等。
高氏一号培养基
∗ 用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方 用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。 如下： 如下： 20.0g 可溶性淀粉 ∗ KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4• 7H2O 0.5g ∗ NaCl 0.5g FeSO4• 7H2O 0.01g pH 7.4~7.6 20g 琼脂 1000mL 自来水 灭菌： 灭菌： 1.05kg/cm2 30min
制备无菌水
∗ 无菌水为下一次微生物分离实验中所需要的材 料。 ∗ 250mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水 三角烧瓶（ ），装自来水 三角烧瓶 装有玻璃珠）， 45mL，试管中装 自来水， ，试管中装9.0mL自来水，塞上棉塞，包 自来水 塞上棉塞， 灭菌备用。 扎、灭菌备用。
物品的准备
∗ 三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等的包扎准备。 三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等的包扎准备。
一实验目的土壤是微生物生活的大本营为了获得某种微生物的纯培养一般是根据该微生物对营养酸碱度氧等条件要求不同而供给它适宜的培养条件或加入某种抑制剂淘汰其他一些不需要的微生物再用各种方法分离纯化该微生物直至得到纯菌二实验原理稀释涂板法稀释混合平板法划线分离培养基
实验四微生物平板菌落计数法
实验四微生物平板菌落计数法(共3页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--实验四微生物平板菌落计数法一、实验目的学习并掌握平板菌落计数的基本原理和方法。
二、实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低，为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。
三、实验器材1 ．菌种：酵母菌。
2 ．培养基：YEB培养基。
3 ．仪器或其他用具： 1ml 无菌吸管，无菌平皿，盛有无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。
四、实验步骤1 ．编号取无菌平皿 9 套，分别用记号笔标明 10-4、 10-5、 10-6（稀释度）各 2 套，另取 6 支盛有无菌水的试管，依次标是 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、10-6。
2 ．稀释用 1ml 无菌吸管吸取 1ml 已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放至 10-1的试管中，此即为 10 倍稀释。
将多余的菌液放回原菌液中。
将 10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。
另取一支 1ml 吸管插入 10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。
实验四 放线菌的形态观察
实验四放线菌的形态观察杨明轩生物111班1102040128一、实验目的1、学习观察放线菌形态的基本方法。
2、观察放线菌的个体形态特征。
二、实验原理放线菌是一类丝状原核微生物，因其菌落在固体表面长成放射状生长而得名，放线菌主要存在于土壤中，大部分腐生，少数寄生，也有的与植物共生固氮。
放线菌是最主要的抗生素产生菌，其形态特征是菌种选育和分类的重要依据。
放线菌通常有分枝发达的菌丝体组成，菌丝直径为0.2-1.2μm。
主要由两部分组成，一部分长在培养基内，一般没有横隔，有固定和吸收养分的作用，称为基内菌丝或营养菌丝。
当基内菌丝发育到一定阶段，即可向空中伸展形成气生菌丝（有的菌种没有气生菌丝）。
在显微镜下观察时，气生菌丝颜色较深，并且比基内菌丝粗两倍左右。
有些种的气生菌丝发育到一定阶段，其顶端可形成孢子丝。
孢子丝分直、波曲、螺旋等形状。
孢子丝的着生方式分别为单生、丛生、轮生和互生。
放线菌菌落小，与培养基结合紧密，不易用接种钩挑取，因而难以直接观察。
通常采用玻璃纸培养法和插片法观察。
本次实验采取插片法。
该方法适合进行营养菌丝、气生菌丝和孢子丝的比较观察。
在接种放线菌的培养基一侧，以45°角插入无菌盖玻片，使放线菌沿培养基与盖玻片交界处生长，并附着于盖玻片上，待菌丝生长一段时间后，取下盖玻片进行染色，即可直接观察。
三、实验材料1、菌种：紫色直丝链霉菌（Streptomyces violaoeorectus）、黑化链霉菌（Streptomyces nigrificans）、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）、丰加链霉菌（Streptomyces toyocaensis）2、染色剂：石炭酸复红染液3、培养基：高氏一号培养基4、其他：干净载玻片、盖玻片、无菌水、洗瓶、擦镜纸、吸水纸、二甲苯、香柏油、接种用具四、实验方法1、制备平板：将已融化的高氏一号培养基（冷却到45℃左右）倒入无菌培养皿，每皿15~20ml（厚度约为培养皿高度的一半），凝固后备用。
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基因型和表型变异的比较
基因型变异 基因结构 可逆性 稳定性 变化 不或极少 稳定 表型变异 未变 可逆 不稳定
环境影响
涉及细菌数
不受影响 个别
受影响 全体
பைடு நூலகம் 基因型？表型？
结核杆菌可发生菌落、毒力、耐药性变异。 牛型结核杆菌(有毒株H37Rv)
• 耐药程度用某药物对细菌的最小抑菌浓度(MIC)表示。
H-O变异
原理：将有鞭毛的普通变形杆菌点种在琼 脂平板上，由于鞭毛的动力使细菌在平板 上弥散生长，菌落形似薄膜(H菌落)；若将 此菌点种在含0.1%石炭酸的培养基上，细 菌失去鞭毛，只能在点种处形成不向外扩 展的单个菌落(O菌落)。此变异是可逆的。
公共邮箱：microbiology_lab@ 密码：123456
实验四、 细菌变异现象观察及其毒力测定
河南大学医学院 娄强
qiang_lou@
目的要求
• 掌握内毒素测定的实验原理及实验方法。
• 理解细菌变异的原因，观察细菌变异现象， 加深对变异机制的认识。
细菌的变异现象
H-O变异
• • 菌种：变形杆菌 培养基：普通琼脂平板及0.1%石炭酸琼 脂平板
实验方法：
•
1. 本别在普通琼脂平板和0.1%石炭酸琼脂平板的 边缘四端点种变形杆菌； 2. 置37oC培养24h，观察菌落有无迁徙现象。
细菌的致病性
• 荚膜、内毒素、外毒素、酶
• 内毒素的检测-鲎试验 原理：鲎是海洋中的一种冷血节肢动物，其血液 中有一种特殊的变形细胞，内含凝固酶原和可凝 固蛋白。将此变形细胞冻融后制成鲎变形细胞溶 解物（即鲎试剂）。内毒素能激活其中的凝固酶 原使之变成凝固酶而使可凝固蛋白凝结成凝胶状 态。用以检查药液或注射液是否有内毒素污染。 能测出0.01~1.0ng/ml的内毒素。
胆汁-甘油-马铃薯培养 13年，230次传代
BCG(减毒株H37Ra)
耐药性分类
• 细菌耐药性（drug resistance）亦称抗药性，是指细菌 对某抗菌药物（抗生素或消毒剂）的相对抵抗性。指病原 体或肿瘤细胞对反复应用的化学治疗药物敏感性降低或消 失的现象。
• 天然或突变产生的耐药，即染色体遗传基因介导的耐药。 • 质粒介导的耐药性，即细菌因获得了由质粒、噬菌体或其 他外来DNA片段，所致的细菌耐药，其所带的耐药基因 易于传播，在临床上占有重要地位。
• 结果记录： +++ 固体 ++ 凝胶 + 粘液 未凝固
耐药机制
• 针对不同的药物有不同的耐药机制。
– 接合：细胞间通过性菌毛相互沟通，将遗传物质如质粒或染色质 DNA从供体菌转移给受体菌。 – 转导：以噬菌体及其含有的质粒DNA为媒介，介导供体菌耐药基 因转移给受体菌内。 – 转化：少数细菌可从周围环境中摄入裸DNA，并掺入到细菌染色 体中。 – 针对β内酰胺类抗生素：产生β内酰胺酶；青霉素结合蛋白（PBP） 的作用位点改变或产生新的对β内酰胺类抗生素不敏感的PBP； 革兰阴性细菌外膜通透性降低和主动外排系统将抗生素泵出胞外。
鲎试验
• 材料：大肠杆菌裂解物、鲎试剂、标准内毒素、蒸馏水、 小试管、吸管、37℃水浴箱
• 实验方法： 1. 打开3支鲎试剂，每支各加入0.1ml蒸馏水溶解，并编号； 2. 将3支鲎试剂分别加入标准内毒素、蒸馏水、大肠杆菌裂解物各0.1ml， 摇匀。 3. 置37oC水浴箱，15~30min取出。