实验三 固定化活性干酵母细胞的制备及活力测定

操作步骤
一、菌体悬浮液的制备 称取含转化酶活力的市售活性干酵母粉 15g，用 5mL、pH4.6 的醋酸缓冲液将酵母粉制成均匀浆液，
备用。 二、菌体的固定化
本实验选用通透性好，包埋量大，易再生的海藻酸钠作为包埋载体。称取 1.0g 海藻酸钠，缓慢加入 到 50mL 的热蒸馏水中，使之完全溶解。将制备好的酵母细胞悬液与溶解完全海藻酸钠凝胶充分混合(要 求在无菌条件下)搅拌均匀。用注射器吸取上述混合浆液，再用注射针头逐渐地滴人到 0.2mol/L 氯化钙 溶液中，在其搅拌的条件下制成直径约 2-3 mm 的球状凝胶颗粒。制粒完毕后，于该溶液中再固化 20-30min。
思考题
1．在固定化活性酵母细胞的制备过程应注意哪些? 2．为什么要对生物活性材料(如酶、细胞等)进化固定化，有何意义? 3．你认为影响固定化细胞效率的因素有哪些? 4．固定化细胞与非固定化细胞有何异同?
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
试剂和器材
一、试剂 (1)3.0％海藻酸钠 (2)0.2mol／L 氯化钙溶液 (3)市售干酵母粉 (4)3,5—二硝基水杨酸(DNS)试剂：取 6.3g 3,5—二硝基水杨酸(DNS)和 262mL 2mol／LNaOH 溶液加到酒 石酸钾钠的热溶液中(192g 酒石酸钾钠溶于 500mL 水中)，再加 5g 重蒸酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌使其溶解， 冷却后加水定容至 1000mL，保存于棕色瓶中。 (5)pH4.6、0.2mol／L 醋酸缓冲液 (6)1.5mol／L 蔗糖溶液(用 pH4.6、0.2mol／L 的醋酸缓冲液溶解蔗糖) 二、仪器 (1)漏斗 (2)烧杯 (3)带针头的注射器 (4)磁力搅拌器 (5)移液枪 (6)试管 (15 支) (7)抽滤装置 (8)烧杯 150mL(2 个) (9)电动磁力搅拌器 (10)分光光度计 (11)电热恒温水浴锅 (12)温度计 1 支
(1)免去破碎细胞提取酶的手续。 (2)酶在细胞内环境中的稳定性较高。 (3)完整细胞固定化后酶活性损失较少。 (4)固定化细胞有可能将微生物发酵改为连续反应。 (5)固定化完整细胞的成本比固定化酶低。本实验以海藻酸钠为载体，制备成固定化。 (6)可制备活性干酵母细胞凝胶颗粒，该颗粒可用于转化糖和乙醇的生产。 掌握固定化生物催化剂活力的测定方法在实际应用方面具有重要意义。固定化细胞在催化反应中活 性会受到载体骨架、孔径及底物、产物的扩散速度的影响。一般被固定化了的细胞其酶活力较游离细胞 要低。本实验以测定活性干酵母细胞蔗糖酶活力来表示固定化活性干酵母细胞的蔗糖转化酶活力，固定 化活性干酵母细胞蔗糖转化酶[EC.3.2.1.26]活力的表示方法：用在 28℃每小时每克干酵母粉所制备的固 定化细胞水解生成还原糖的质量表示。
实验三 固定化活性干酵母细胞的制备及活力测定
实验目的
1．学习固定化微生物细胞的制备方法 2．通过该方法的学习，了解其他固定化方法及实践意义 3．掌握固定化生物催化剂活力测定方法 4．学会利用固定化活性干酵母凝胶生产转化糖
实验原理
20 世纪 60 年代，酶学研究领域崛起一支新军——固定化酶。它使人们模拟体内酶的作用方式(体内 酶大多数是结合在膜类物质上进行催化反应的)，将酶进行一定的改造（固定化)，使之更符合人类需要 的新型酶制剂。酶固定化过程是通过化学或物理的手段，将酶束缚在一定的载体上，限制酶在此载体上 进行活跃的催化作用。酶经固定化后，使其更趋稳定，且易于回收，有利于连续柱反应等特点。到 20 世纪 70 年代又迅速发展起来一种新技术——固定化微生物细胞。它在利用生物催化剂为人类提供产品 和为社会服务等方面已取得了显赫的成就，同时具有广阔的应用前景。该技术沿用了固定化酶的方法， 但其应用速度已超过了固定化酶，因为固定化完整细胞有其明显的优点。
于布氏漏斗中滤去氯化钙溶液，再用无菌水洗涤固定化酵母细胞凝胶颗粒，以洗去未固定化的氯化 钙，即得到固定化市售活性酵母细胞凝胶颗粒。该凝胶颗粒保存于 pH4.6 的醋酸缓冲液中，置冰箱中冷 藏保存备用。 三、固定化活性干酵母细胞蔗糖转化酶活力的测定方法
称取 1.0g 活性干酵母粉所制备的固定化细胞，加入 50mL,、pH4.6、1.5mol／L 的蔗糖溶液，于 28℃ 搅拌反应 1h，然后测定其还原糖量。用 3,5—二硝基水杨酸法测定每份蔗糖转化液的还原糖量（稀释到 200 倍，540nm 测定），计算出酵母固定化后的蔗糖转化酶活力保持的百分率。