2011-05-31遗传病致病基因的克隆

微卫星遗传标记
ABI 3100 遗传分析仪
微卫星遗传标记
不同荧光标记引物扩增覆盖全基因 组的382个微卫星标记
ABI 3100遗传分析仪
新的房颤致病基因NUP155的发现及 其致病机理研究
房 颤
房颤（AF, Atrial Fibrillation）是最常见的心律失常 疾病之一，15%的中风是由房颤引起的。
总结：房颤致病基因的克隆
连锁分析定位致病基因
定位区域内候选基因的突变筛选， 发现致病基因 正常对照人群中突变位点 的验证 分子，细胞，动物模型等 各个层次阐明致病的机制
MEF2A基因突变与冠心病
冠心病家系
冠心病是冠状动脉粥样硬化性心脏病的简称。 是指供给心脏营养物质的血管——冠状动脉发生 严重粥样硬化或痉挛，使冠状动脉狭窄或阻塞， 以及血栓形成造成管腔闭塞，导致心肌缺血缺氧 或梗塞的一种心脏病，亦称缺血性心脏病。
微卫星遗传标记的检测
要检测个体的基因型，通常是采用PCR扩增结合 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法，即在重复序列两侧按单 一序列设计引物，经过PCR扩增后，扩增产物在变性 聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳结果如图所示，根 据电泳结果按片段大小依次命名等位基因1，2，3…
基因拷贝数变异的检测方法
比较基因组杂交芯片（用于全基因组CNVs检测） 原理：将目的基因和参考基因用不同的荧光进行标记后与芯片上的DNA片 段进行杂交而产生不同的荧光信号比值，从而得到两者之间拷贝数的 差别 SNP芯片法 （用于全基因组CNVs检测） 原理：与比较基因组杂交芯片不同的是，SNP芯片不需要进行双杂 交，只需将目的基因与SNP芯片杂交得到杂交信号强度，然后与已知 的参考杂交信号对比得出目的基因与参考基因之间拷贝数的差别。 实时荧光定量PCR（针对单个基因） 原理：分别针对待检测基因上的序列和对照基因序列设计两对引 物和标记不同荧光基团的检测探针。通过对扩增后两个探针信号指示 的Ct值进行比较从而判断目标基因拷贝数。
Kary Mullis
1993年诺贝尔化学奖得主
1973年获加州大学伯克利分校 生物化学博士
Kary Mullis
在Cetus公司工作期间，他原本是要合成DNA引物 来进行测序工作，但为没有足够多的模板DNA而烦恼。 1983年5月一个星期五的晚上开车去郊外度假的路 上联想起DNA复制的过程，引发了用两个引物（而不 是一个引物）去扩增模板DNA的想法。
连锁分析定位致病基因
定位区域内的候选基因突变筛选
定位区域内含93个基 因，其中43个已知基 因，50个假想基因
MEF2A 转录因子，肌肉细胞增 强因子-2家族成员 （MEF2 family）， mef2a基因在小鼠胚胎 发育的早期的血管中就 有表达
X连锁隐性遗传病（X-linked recessive diseases，XR）
致病基因位于X染色体上，致病基因为隐性基 因。
X连锁显性遗传病（X-linked dominant diseases，XD）
致病基因位于X染色体上，致病基因为显性基因。
Y连锁遗传病（Y-linked diseases，YL）
PCR背后的故事
PCR背后的故事
DNA多态性
DNA多态性是指染色体DNA等位基因中核苷酸 排列的差异性，分为序列多态性和序列长度多态性 。
DNA多态性遗传标记
第一代遗传标记： ABO血型位点标记，HLA位点标记，限制性片 段长度多态性（RFLP） 第二代遗传标记： 微卫星标记（microsatellite marker），又称短 串联重复（STR） 第三代遗传标记：1996年MIT的Lander ES 提出了SNP(single nucleotide polymorphism )遗传标记系统 新的遗传标记：拷贝数变异。
拷贝数变异(copy number variation,CNV),它是一 种大小介于1 kb到3 Mb之间的DNA片段的缺失、重 复、倒位和易位,在人的基因组中都分布广泛.
DNA多态性的检测
RFLP（restriction fragment length polymorphism，限 制性片段长度多态）的检测
遗传病致病基因的克隆和功能 研究
遗传病
遗传病(genetic diseases)是由于遗传物质改变而 导致的疾病。 遗传物质是存在于细胞内的、决定特定性 状的基因。
疾病基因的定位和克隆
疾病基因定位的含义 疾病基因定位，是指将致病基因定位到人类染色体的 某一区段上。 疾病基因克隆 疾病基因的克隆是指疾病基因的鉴定，找到导致疾病的 致病基因。
若多态性遗传标记与待定基因距离较远，则它们 在向子代传递时会发生自由分离而呈现“连锁平衡”； 反之，则不发生自由分离，而呈 “共分离（ Cosegregation ）”现象。由此可以在染色体上定位与某 一 DNA 标记相连锁的致病基因。
使用的遗传标记：微卫星遗传标记，精细定位时也辅 助用到SNP遗传标记
单基因病的传递方式
（一）常染色体显性遗传病（autosomal dominant disease，AD） 定义：致病基因位于常染色体上，致病基因为显性基因。
常染色体隐性遗传病（autosomal recessive diseases，AR）
定义：致病基因位于常染色体上，致病基因为隐性基因。 基因型与表现型的对应关系： 基因型： AA Aa aa 表现型： 正常 正常（携带者） 患者
NUP155对HSP70 mRNA转运的影响
RT-PCR
免疫染色
NUP155基 因敲除小鼠 心肌细胞
房颤致病基因的致病机理
分子机制 突变对蛋白定位的影响 突变对蛋白功能的影响 （HSP70mRNA转运） 动物模型（基因敲除小鼠） 表型，心脏组织结构，细胞水平（动作电 位）， HSP70 mRNA转运。
基因敲除小 鼠心房组织 的电镜照片
基因敲除小鼠心房组织的电镜照片
NPC
NPC
NPC
Nup155与HSP70的关系
1.
Gle1蛋白与NUP155蛋白相互作用将Gle1蛋白定位到 核孔复合体上
2. Gle1蛋白与核孔蛋白CG1相互作用,介导HSP70 mRNA的转运 3. 小鼠敲除HSP70基因影响小鼠心脏的收缩功能和心肌 细胞钙离子的动态平衡
致病基因位于Y染色体上，随Y染色体遗传。
线粒体遗传病（mitochondrial diseases）
致病基因位于线粒体基因组上，由于受精卵的细 胞质主要来自卵子，存在于细胞质中的线粒体也来自 卵子，所以线粒体遗传病表现为母系遗传
克隆单基因遗传病－定位克隆的 原理
定位克隆的基本思路是通过连锁分析原理进行基因 定位。
DNA多态在医学遗传学中的应 用
1. 基因定位：DNA多态在人类基因定位中起着非常重要的作 用。 2. 要确定个体之间的亲缘关系，DNA多态分析是最有效的方 法，可以通过检测待分析个体的DNA多态位点，通过等位基因 分析确定他们之间的血缘关系。 3. 追踪额外染色体起源：如在对21三体患者进行病因分析时 ，通常需要分析21三体患者额外的21号染色体的起源，可以 通过DNA多态位点分析进行。 4. 鉴定细胞来源：在进行移植时，通常需要跟踪移植细胞在 受体内的状态，可以采用DNA多态位点分析确定细胞来源。
构建GFP的融合表达载体
表达GFP和NUP155 融合蛋白
GFP的发现－2008年诺贝尔化学奖
突变对NUP155蛋白定位的影响
NUP155 Knock out 小鼠模型
The Bay Genomics/Univers ity of California, Davis
基因诱捕（gene trap） β-geo β-gal +Neo
Lod值
精确分析基因之间的连锁关系，通常采用优势 对数法，也称Lod计分法。Lod得分是在一定重组率下 两个位点相连锁的似然性与两个位点不连锁的似然性比 值的对数值 在进行连锁分析时，要计算=0.0（不重组）到 =0.5（随机分配）的一系列Lod得分。当Lod得分为+3 或更大时，肯定连锁；当Lod得分小于或等于-2时，排 除连锁。Lod得分最大时的值被接受为最大似然估计值。
EcoRI 内切酶 切割GAATTC 序列
SNP（single nucleotide polymorphism）单 核苷酸多态
一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷 酸变异，SNP在基因组中分布相当广泛，人类基因组 中每300个碱基对就出现一次。
拷贝数变异(copy number variation, CNV)
连锁分析法（linkage analysis）
用连锁分析方法进行基因定位是通过分析拟定位致病基因 产生的表型效应（如疾病）与染色体上多态位点之间的连锁关 系。基本原理是位于同一染色体上两个基因位点（如致病基因 与微卫星标记） 在减数分裂的过程中会发生交换与重组，假如 两个位点相距很近的时候，遗传标记和致病基因（疾病表型） 共分离，那么说明致病基因就在遗传标记附近，反之则致病基 因不在遗传标记附近。
房颤病人 正常人
来自南美洲的房颤病家系
乌拉圭
近亲结婚的隐性遗传的房颤家系
NUP155基因测序结果
NUP155 蛋 白
NUP155基因编码一种分子量为155k Da的核孔蛋 白，NUP155蛋白是核孔复合体的重要成分。
突变对NUP155蛋白定位的影响
GFP: 绿色荧光蛋白 在特定波长的激光照射 下可以发出绿色荧光
NUP155基因在小鼠心脏组织中的表达
RT-PCR
Western Blot
纯合子NUP155基因敲除小鼠死于胚胎发育的8.5天前，
杂合子NUP155基因敲除小鼠能存活。
NUP155基因在心肌细胞中的表达
免疫染色
小鼠心电图的记 录
DSI FA-20电极的植入
小鼠心电图的记录
NUP155基因导致房颤的机理
遗传性疾病的分类及发病率
分 类 发 病 率(%) 2.5 0.9 1.3 0.3 18.0 基因病 单基因病（Monogenetic Disease） 常染色体显性遗传病 常染色体隐性遗传病 性连锁遗传病 线粒体病 多基因病（Polygenetic Disease）
染色体病 常染色体异常的疾病 性染色体异常的疾病
人体细胞的遗传物质
人的基因组大小：30亿个碱基对
Βιβλιοθήκη Baidu
个rRNA基因和22个tRNA基因，13个 编码蛋白质基因，编码序列占93%。
人类的基因数目
如何克隆遗传病的致病基因？
1. PCR 2. DNA多态性遗传标记
PCR （ Polymerase Chain Reaction ）
快速扩增目的DNA片段，30 次循环将扩增上10亿个靶 DNA片段的拷贝
微卫星遗传标记(short tandem repeat ，STR)
指重复单位在2-6bp、并且呈串联排列的重复 序列，其重复次数在群体中存在变异。如（CTA）n 不同等位基因表现为n的差异。
DNA多态性
RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性 片段长度多态）
机理？
NUP155基因突变
房颤
NUP155功能：核孔复合 体的成分,与NUP155相 互作用的蛋白Gle1B负 责mRNA的运输
房颤发生的机理：心脏电活 动改变（离子通道基因）， 心脏结构的改变
NUP155基因敲除小鼠心脏组织 结构
a-actin 免疫染色
心房心肌细胞动作电位
全细胞膜片钳技术记录心肌细胞动作电位
单基因遗传病致病基因的定位与克隆的 流程
单基因遗传病致病基因克隆的研究 策略
定位 （全基因组连锁分析）
筛选候选基因 基因突变的筛查 验证（家系成员，正常对照群体的 突变筛查） 基因的功能研究，阐 明致病机理
单基因遗传病致病基因定位的实 验方法
基于遗传病家系的全基因组扫描，对覆盖整个基 因组的微卫星遗传标记，逐个验证其与疾病表型的连 锁关系，找到与疾病表型相连锁的微卫星遗传标记， 而将致病基因定位在两个或多个微卫星遗传标记所在 的区域。
0.54 0.36 0.182
单基因遗传病
由于单个基因突变所引起的疾病，这类疾病的遗 传符合Mendel遗传规律，如血友病、色盲、白化病。
多基因遗传病
由多个微效基因与环境因素共同作用所引起的 疾病。
如：精神分裂症、高血压、冠心病等
染色体病
染色体病（chromosomal disorders） 由于染色体数目或结构异常所引起的疾病，如唐 氏综合，脆性X染色体综合征。