猪异种器官移植的人源化修饰 Genetic Modification of Porcine Organs for Human in Xenotranspla
开展异种器官移植临床试验的几个关键伦理问题
开展异种器官移植临床试验的几个关键伦理问题王 华,吴卫星,栾 尧 (军事医学科学院输血医学研究所,北京 100850)〔摘 要〕目前,异种器官移植由于动物道德权、医疗资源分配及危害大众健康等问题而受到广泛地关注与争论,本文提出了四个关键伦理问题,即利弊界限、供研究患者的知情同意、第三方组织的知情同意及临床试验的监督和批准,作为开展异种器官移植临床试验的先决条件。
〔关键词〕异种器官移植;伦理〔中图分类号〕R617 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1001-8565(2002)06-0043-02Critical ethical issues for initiation of clinical trials of xenotransplatationWANG Hua,WU Weixing,LUAN Yao(Institute o f Transf usion Medicine,Academy o f Military Medical Sciences,Beijing,100850,China) Abstract:There are s ome widely discussed issues on xenotransplatation,such as animals’m oral rights,allocation of medical res ources and endangering public health,etc.The article raises four critical ethical issues,e.g.harm-benefit thresholds,in formed consent from research patients,in formed consent from third-party groups and oversight and approv2 al of clinical trials as the prerequisites to initiation of clinical trials of xenotransplatation.K ey Words:Xenotransplantation;Ethics 由于同种器官移植飞速发展,如今几乎所有的人体主要器官的成功移植都已不存在重大障碍,器官移植已成为恢复患者衰竭器官功能的一种新的医疗方式。
猪异种器官移植的人源化修饰
猪异种器官移植的人源化修饰
俞远京
【期刊名称】《遗传》
【年(卷),期】2003(25)5
【摘要】利用猪的器官来解决当前人源器官严重短缺,为解决移植器官短缺的可行的途径.用定向基因转移(gene targeting)手段,直接并准确地对α-1,3半乳糖苷转移酶(α-1,3GT)基因进行同源重组,使α-1,3GT失活,再结合猪体细胞克隆技术,对其进行人源化改造,减弱或消除排异反应.除对2-1.3GT进行基因定向修饰外,阻断由异种器官移植而激活的人类补体的串联反应是猪异种器官人源化修饰的另一途径.然而,猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)造成的公共卫生问题,给异种器官移植的前景投下了阴影.因此,即要剔除导致人类排异反应的猪细胞表面的α-1,3GT及其相关的分子, 又要确保猪器官异种移植的安全性, 是尚待研究的重大课题.
【总页数】5页(P596-600)
【作者】俞远京
【作者单位】中南大学湘雅医学院实验动物学部,长沙,410078
【正文语种】中文
【中图分类】Q342+.4;R392.2
【相关文献】
1.外源蛋白在酵母中表达的糖化修饰及人源化改造 [J], 黎刚;潘卫;王应雄
2.基因修饰猪在异种器官移植中的研究进展 [J], 陈鹏飞;聂惠蓉;戴一凡;蔡志明;牟丽莎
3.异种移植相关功能蛋白人源化基因修饰猪模型的建立 [J], 刘琪帅;李小平;王可品;葛维凯;赖良学
4.挽救生命的“天使”——谈基因编辑猪与异种器官移植研究路径 [J], 胡正; 方铭慧
5.利用基因编辑技术进行猪异种器官移植及人类疾病模型研究的进展 [J], 陆新章;张梅;娄颜坤;马育芳;李大力
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
国际首例6-基因编辑猪-猴肝肾联合移植围术期治疗研究
国际首例6-基因编辑猪-猴肝肾联合移植围术期治疗研究韩士超;马帅军;戚若晨;王国辉;张小燕;刘克普;范效铮;魏迪;张玄;杨晓剑;陶开山;秦卫军;窦科峰【期刊名称】《空军军医大学学报》【年(卷),期】2024(45)1【摘要】目的探讨国际首例6基因编辑猪猴肝肾联合移植模型的构建,探究异种肝脏移植对异种肾脏移植的影响。
方法将人源化6基因编辑猪的肝脏、肾脏移植给恒河猴受体,肝脏移植采用腹腔异位移植,肾脏移植采用原位移植,保留对侧肾脏,观察血流灌注恢复后,移植肝、肾的情况及受体存活情况;定期进行移植物超声及功能检查;监测受体猴生化指标及生理指标变化;受体猴生命终点取移植肾、移植肝进行病理检查。
结果手术历时14 h结束,术后受体猴各项生理指标基本正常,移植物开放血流后可见移植肝灌注良好,即刻可见胆汁流出;移植肾灌注良好,即刻可见尿液流出,未见明显超急性排斥反应发生;术后移植肾功能良好,术后5 d移植肾尿量减少,考虑排斥反应发生,术后受体猴最终存活14 d。
结论多基因编辑猪猴异种肝肾联合移植模型构建成功,术后移植肾未见明显超急性排斥反应发生,异种肝移植可减轻异种肾脏移植急性排斥反应发生。
【总页数】6页(P9-14)【作者】韩士超;马帅军;戚若晨;王国辉;张小燕;刘克普;范效铮;魏迪;张玄;杨晓剑;陶开山;秦卫军;窦科峰【作者单位】空军军医大学西京医院泌尿外科;空军军医大学西京医院肝胆外科【正文语种】中文【中图分类】R-332;R617【相关文献】1.肝肾联合移植患者的围术期护理研究2.多基因编辑猪-猴心脏、肝脏、肾脏移植临床前研究初步报道3.西京医院成功实施多基因编辑猪-恒河猴异种肝心肾器官移植4.猴猪非协调性异种胰肾联合移植的实验研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪-人异种移植相关基因CMAH的克隆、表达及功能生物信息学分析
猪-人异种移植相关基因CMAH的克隆、表达及功能生物信息学分析张霞;秦彩艳;霍海龙;王淑燕;王配;潘伟荣;张永云;陈园园;霍金龙【期刊名称】《四川农业大学学报》【年(卷),期】2018(036)004【摘要】[目的]研究版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)CMA H 基因特性,探索该基因在猪-人异种器官移植免疫排斥中的作用.[方法]采用实时荧光定量PCR技术检测BMI 27个重要组织的CMA H mRNA表达水平,采用Western blot检测BMI在9个组织中的CMAH蛋白表达特征,并对CMA H编码的氨基酸进行生物信息学预测,分析CMAH蛋白质的功能.[结果]扩增得到BMI CMA H编码区序列长1734 bp,编码577个氨基酸,序列已提交GenBank,基因登录号KM098147,对应的氨基酸登录号AIS36193.多组织相对荧光定量表达分析表明CMA H基因在颌下腺、脾及舌下腺中呈相对高表达水平,在其他组织中呈相对中、低表达水平.Western Blot分析表明CMAH蛋白在除脊髓和大脑外的其他组织都有表达.功能生物信息学分析表明CMAH蛋白质包含Rieske和UlaG保守结构域,二级结构以α螺旋为主,N末端亲水,C末端疏水,有6类功能活性位点.[结论]明确了CMA H基因的结构以及在多种组织中差异化表达情况,为深入研究其在异种器官移植方面的功能积累了基础资料.【总页数】7页(P507-513)【作者】张霞;秦彩艳;霍海龙;王淑燕;王配;潘伟荣;张永云;陈园园;霍金龙【作者单位】云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室,昆明 650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明 650201;云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室,昆明 650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明 650201;云南农业职业技术学院教务处,昆明 650031;云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室,昆明 650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明 650201;云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室,昆明 650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明 650201;云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室,昆明 650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明 650201;云南农业大学农科专业基础实验教学示范中心,昆明 650201;云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明 650201;云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室,昆明 650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.版纳微型猪近交系RNF4基因克隆、多组织qPCR表达及功能生物信息学分析[J], 张霞;曾日彬;霍金龙;王配;陈园园;王淑燕2.版纳微型猪近交系FANK1基因CDS克隆、qPCR表达及功能生物信息学分析[J], 霍晋华;张霞;王配3.版纳微型猪近交系SLA-DOA基因克隆、mRNA表达及蛋白质功能生物信息学分析 [J], 王配;王淑燕;霍金龙;李罗刚;张永云;李卫真;朱宏涛;姚茂东4.版纳微型猪近交系免疫排斥相关基因B4 GALNT2的克隆、表达及功能生物信息学分析 [J], 宋雪; 王淑燕; 陈园园; 王配; 霍海龙; 张霞; 霍金龙5.猪睾丸表达序列37(TEX37)克隆、mRNA表达及蛋白质功能生物信息学分析 [J], 霍海龙;张霞;范俐;赵筱;王世雄;王荣琼;刘丽仙;霍金龙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
用于器官移植的基因修饰猪的研究进展
品， 发 展 动 物 来 源 的 器 官 就 成 为 解 决 器 官 短 缺 问 题 的主 要 方
的治疗 。随着免疫学 的发展 和新 型抑制剂 的出现 ， 同种异体 器 官移植 的排斥 问题逐步得 到解决 ， 可通过器官移植治疗 的
疾 病 种 类 不 断增 多 。迄 今 为止 ， 全球有近百万患者通过器官
移植而获得新生＿ ２ Ｊ 。 我 国是器官移植大国 ， 每年约有 １ ５ ０万人
因终末期器官 衰竭需要移植 ， 但仅 １ 万人能 够得到移植 ， 供
ｒ ｅ ｐ ｅ ａ ｔ ｓ ， Ｃ Ｒ Ｉ Ｓ Ｐ Ｒ） 技术 ， 构建 ａ Ｇａ ｌ Ｋ Ｏ ／ ［ ３ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ｔ ２ ． ＫＯ ／ ｈ Ｃ Ｄ ４ ６ ／
向。虽然猴 、 狒狒等灵长类动物在系统发育方面更接近 于人 类， 但是并不适合作为临床异种移植 的器官来源 。 首先 ， 由于 体 型差异 ， 灵长类 动物的器官在体 积 、 生理功 能上 与人类器 官相差甚远 ， 不能满足要求 ； 其次， 由于灵长类动物在进化上 与人 类 比较接 近 ， 存 在种间交叉感 染 的可 能 ， 有严 重的安全 性风 险； 此外 ， 由于繁殖量 少 、 珍稀动物保护 以及伦理学等 问 题， 并不适合作为供体动物 。目前大部分研究者都认为猪更 适合作为器官移植的供体 。猪的器官体积和生理指标与人类 接近、 繁殖迅 速 、 易于基 因改 造和修饰 、 安全性 好 ， 是理想 的
猪到人肝异种移植的研究
猪到人肝异种移植的研究英文回答：Pig-to-human liver xenotransplantation is a field of research that explores the possibility of transplanting pig livers into humans. This area of study is driven by the shortage of human organs available for transplantation, particularly livers. In many countries, the demand forliver transplants exceeds the supply, leading to long waiting lists and high mortality rates among patients in need of a transplant. Xenotransplantation offers apotential solution to this problem by utilizing pig livers as an alternative source.One of the main challenges in pig-to-human liver xenotransplantation is the issue of immunological compatibility. The human immune system recognizes pig cells as foreign and mounts a vigorous immune response, leading to organ rejection. To overcome this barrier, researchers are exploring various strategies to modify the pig organsand make them less immunogenic. For example, genetic engineering techniques can be used to knock out certain genes in the pig genome that are responsible for producing antigens recognized by the human immune system. By doing so, the pig organs can be "humanized" to a certain extent, reducing the likelihood of rejection.Another challenge in pig-to-human liver xenotransplantation is the risk of transmission of porcine endogenous retroviruses (PERVs) from the pig organ to the human recipient. PERVs are integrated into the pig genome and can potentially infect human cells. Although studies have shown that PERVs are not capable of infecting human cells efficiently, there is still a concern about the possibility of PERV transmission and its long-term effects. Researchers are actively working on developing methods to eliminate or inactivate PERVs in pig organs to ensure the safety of xenotransplantation.In addition to immunological compatibility and PERV transmission, there are also practical considerations inpig-to-human liver xenotransplantation. The size mismatchbetween pig and human organs poses a challenge in surgical procedures. Pig livers are smaller than human livers, and transplanting a smaller organ into a larger recipient may result in inadequate function. Researchers are exploring techniques such as liver regeneration and tissue engineering to address this issue and enhance the functionality of pig livers in human recipients.Overall, pig-to-human liver xenotransplantation holds promise as a potential solution to the shortage of human organs for transplantation. However, there are still many scientific and ethical considerations that need to be addressed before this procedure can be widely used in clinical practice. It requires extensive research, collaboration between scientists and clinicians, and careful evaluation of the risks and benefits. With continued advancements in genetic engineering and immunosuppression techniques, pig-to-human liver xenotransplantation may become a viable option in the future.中文回答：猪到人肝异种移植是一项研究领域，探索将猪肝移植到人体的可能性。
国内外异种器官移植的现状及进展
· 综述·国内外异种器官移植的现状及进展张小燕 王国辉 韩士超 戚若晨 刘克普 魏迪 杨晓剑 马帅军 窦科峰 秦卫军【摘要】 器官短缺已成为阻碍器官移植发展的主要难题，异种移植是解决全球器官匮乏最有价值的方法之一。
近年来，基因工程技术的发展和新型免疫抑制药的研发为异种移植提供了新的理论基础。
国外陆续开展基因修饰猪-非人灵长类动物或脑死亡受者的相关异种移植研究，并取得一些实质性的进展，但大部分的研究仍处于临床前阶段，距离投入临床跨越巨大。
因此，本文结合目前国内外最新的临床前实验研究进展，对异种移植的历史、基因修饰技术发展、异种移植排斥反应及免疫抑制方案等问题进行综述，以期为异种移植的进一步研究提供参考，促进异种移植临床应用，造福更多终末期疾病患者。
【关键词】 异种移植；基因修饰猪；免疫抑制药；非人灵长类动物；排斥反应；炎症反应；凝血功能障碍；感染【中图分类号】 R617,Q78 【文献标志码】 A 【文章编号】 1674-7445（2024）02-0017-06Present situation and progress of xenotransplantation at home and abroad Zhang Xiaoyan, Wang Guohui, Han Shichao,Qi Ruochen, Liu Kepu, Wei Di, Yang Xiaojian, Ma Shuaijun, Dou Kefeng, Qin Weijun. Department of Urology , Xijing Hospital of Air Force Medical University , Xi’an 710032, ChinaCorrespondingauthors:DouKefeng,Email:***************.cnQinWeijun,Email:**************.cn【Abstract 】 Organ shortage has become one of the major challenges hindering the development of organ transplantation. Xenotransplantation is one of the most valuable methods to resolve global organ shortage. In recent years,the development of genetic engineering technique and research and development of new immunosuppressant have provided novel theoretical basis for xenotransplantation. International scholars have successively carried out researches on xenotransplantation in genetically modified pigs to non-human primates or brain death recipients, making certain substantial progresses. However, most of the researches are still in the preclinical stage, far from clinical application.Therefore, according to the latest preclinical experimental research progress at home and abroad, the history of xenotransplantation, the development of gene modification technology, xenotransplantation rejection and immunosuppression regimens were reviewed, aiming to provide reference for subsequent research of xenotransplantation,promote clinical application of xenotransplantation and bring benefits to more patients with end-stage diseases.【Key words 】 Xenotransplantation; Genetically modified pig; Immunosuppressant; Non-human primate; Rejection;Inflammation; Coagulation disorder; InfectionDOI: 10.3969/j.issn.1674-7445.2023193基金项目：国家自然科学基金（82101322、82200845）作者单位： 710032 西安，空军军医大学西京医院泌尿外科作者简介：张小燕（ORCID 0000-0002-1199-988X ），硕士，住院医师，研究方向为肾移植与肾纤维化，Email ：156****6095@通信作者：窦科峰（ORCID 0000-0003-1708-8048），主任医师，中国科学院院士，研究方向为异种移植与肝胆疾病，Email:***************.cn ；秦卫军（ORCID 0000-0001-5202-642X ），博士，主任医师，研究方向为肾移植与泌尿系肿瘤，Email:**************.cn第 15 卷 第 2 期器官移植Vol. 15 No.2 2024 年 3 月Organ Transplantation Mar. 2024 我国慢性肾病的发病率高达10.8%[1]。
猪到人肝异种移植的研究方法
猪到人肝异种移植的研究方法As the demand for organ transplants continues to rise, researchers have been exploring alternative sources of organs, such as xenotransplantation, which involves transplanting organs from one species to another. One area of interest in the field of xenotransplantation is the use of pig livers for human liver transplants. This research has the potential to greatly expand the pool of available organs for transplant patients and could help to address the shortage of human organs for transplantation.随着器官移植需求持续增加，研究人员一直在探索器官的替代来源，例如异种移植，即将一种物种的器官移植到另一种物种。
在异种移植领域，一个备受关注的领域是将猪肝用于人类肝脏移植。
这项研究有望极大地扩大可用于移植患者的器官库，并有助于解决人类器官移植短缺的问题。
However, there are significant challenges to overcome before pig-to-human liver transplants can become a reality. One of the major hurdles is the risk of organ rejection due to incompatibilities between pig and human immune systems. Research in this area isongoing, with efforts focused on developing techniques to prevent or mitigate organ rejection in xenotransplantation.然而，在猪到人类肝脏移植成为现实之前，需要克服重大挑战。
猪到非人灵长类动物异种器官移植研究进展
人 类灵 长动 物 的器 官 移 植 模 型对 异 种 器 官移 植 的 现 状 和存 在 的问题作 一述 评 。
１ 猪 作为 异种 器官移 植供 体研 究优 势
０ ０人 在 等待 器官 供 给 的名单 里 ， 均每 天有 ｌ ０ 平 ２人在 等待 期 间 死 亡 。 可见 器 官 供应 和 临 床 器 官 需 求 之 间
里 已取得 长足进展 ， 主要 由于 转基 因猪器 官移 植 到 非
络器 官 共 享 （ ＵＮＯＳ 估 计 ， 美 国 范 围 内就 有 超 过 ） 仅
１ ０ ０ ０人在 等 待 器 官 移 植 。欧 盟 （ Ｕ） 约 有 ５ ， １ ，０ Ｅ 大 Ｏ
人灵 长类 动 物 后 可 以免 受 免 疫 反 应 的 影 响［ 。 由于 １ ］ 异种移 植 尚未应用 于临 床 ， 文着 重 临床 前 从 猪 到 非 此
的差 距越 来 越 大 。 大 多 学 者 认 为 克 服 目前 人 体 器 官 的短 缺 有 三 种 方 法 ： 工 器 官 、 生 医 学 和异 种 器 官 人 再 移 植 。理 论 上 ， 种器 官 移 植 有在 较 短 的时 间 内满 足 异 器 官 移植 供 体 的 需 求 的潜 力 。尽 管 猪 作 为 人 类 器 官
研 工 作 。是 加 拿 大安 大略 省执 业 医 师授 权 机 构 认 证 的 移 植 外科 医 师 ， 并
MSTN打靶猪的安全性分析
Vol.372No.12DEC.2020农业技术与装备AGRICULTURAL TECHNOLOGY &EQUIPMENT MSTN 打靶猪的安全性分析李诚瑜，刘昭君，申明，李荣阳，陶景丽，吴望军，刘红林（南京农业大学动物科技学院，江苏南京210095）摘要在提高物质生活的同时，人们越来越注重健康问题，转基因动物的安全性成为热点话题。
肌肉发育是家畜育种过程中重要经济性状之一，肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN ）是一种抑制骨骼肌生长发育的转录生长因子，被认为是提高畜牧业瘦肉生产的重要基因。
研究表明，MSTN 基因的敲除有助于提高动物的肌肉发育。
文章重点讨论了利用基因编辑技术获得的MSTN 基因敲除猪的安全性。
关键词MSTN；基因编辑技术；MSTN 打靶猪的安全性中图分类号S828文献标志码Adoi:10.3969/j.issn.1673-887X.2020.12.0661MSTN 基因简介Myostatin （MSTN ）基因，中文名为肌肉生长抑制素基因，是转化生长因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）超家族成员之一，是一种抑制肌肉生长发育的负调控因子[1]。
在胚胎发育阶段，MSTN 在生肌节细胞和发育的骨骼肌中表达，对肌纤维的数量起着非常重要的调控作用。
在成年动物体内，MSTN 在骨骼肌中特异表达，能有效控制肌纤维的生长[2,3]。
而大量的研究发现，MSTN 基因敲除和自然纯合突变的小鼠、牛、狗和人类均表现出骨骼肌肥大的现象[4-7]。
因此，MSTN 是一个在多物种中影响肌肉生长发育的重要功能基因。
2动物遗传修饰的概念与理解动物遗传修饰（Genetic Modification）是指人为改变动物的基因组（遗传物质），主要包括转基因与基因敲除。
转基因动物（Transgenic Animal ）是指利用实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内，外源基因能在动物体内表达并稳定遗传给后代的一类动物[8]。
多基因编辑猪-猴心脏、肝脏、肾脏移植临床前研究初步报道
第１２卷 第１期２０２１年１月Ｖｏｌ． １２ Ｎｏ．１Ｊａｎ． ２０２１器官移植Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ【摘要】 目的 探讨目前国际上基因改造程度最大的基因编辑猪在临床前异种器官移植中的应用前景。
方法 将1只猪内源性逆转录病毒（PERV ）敲除联合3种主要异种抗原基因敲除以及抑制补体活化、调节凝血紊乱、抗炎抗吞噬的9种人源化基因转入猪（PERV-KO/3-KO/9-TG ）作为供体，获取其心脏、肝脏和肾脏，分别移植给3只恒河猴受体，建立猪-猴异种器官移植临床前研究模型。
观察血流重建后各移植物的功能状态并总结受体存活情况；监测移植物的血流动力学情况；比较各器官移植受体的血液学指标变化；观察移植物组织病理学表现。
结果 血流重建后各移植器官颜色红润、质地柔软、血流灌注状态良好。
术后1 d ，移植心脏、肝脏和肾脏均表现为动、静脉血流状态充盈，灌注情况良好。
心脏、肝脏和肾脏移植受体的术后存活时间分别为7 d 、26 d 和1 d 。
心脏移植受体术后1 d 肌酸激酶、肌酸激酶同工酶以及乳酸脱氢酶水平均升高，至术后6 d 逐渐恢复至接近正常水平。
术后7 d 各项指标均急剧升高。
肝脏移植受体术后2 d 天冬氨酸转氨酶水平升高，术后10 d 转氨酶基本恢复正常，但总胆红素持续升高。
术后12 d 天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平均出现升高，至术后15 d 达到高峰。
多基因编辑猪-猴心脏、肝脏、肾脏移植临床前研究初步报道张玄 王琳 张洪涛 杨诏旭 岳树强 杨雁灵 董海龙 陈敏 路志红 程亮 刘金成 俞世强 张更 秦卫军 李纪鹏 魏红江 杨璐菡 周亮 龙恩武 陶开山 窦科峰·论著 实验研究·结构式摘要转入人源化基因培育肝脏移植CRISPR/Cas9基因编辑恒河猴重建猪胚胎hCD46/hCD55/hCD59h β2M/hHLA-E/hCD47hTHBD/hTFPI/hCD39心脏移植基因编辑猪器官和人免疫系统更匹配且不含PERV肾脏移植敲除PERV敲除异种猪抗原基因供体猪PERV-KO GalT-KOβ4GaINT2-KO CMAH-KO体细胞DOI: 10.3969/j.issn.1674-7445.2021.01.008基金项目：国家“973计划”项目（2015CB554100）；国家重点研发计划项目（2017YFC1103703）作者单位：710032 西安，空军军医大学西京医院肝胆外科（张玄、王琳、张洪涛、杨诏旭、岳树强、杨雁灵、陶开山、窦科峰），麻醉科（董海龙、陈敏、路志红），心脏大血管外科（程亮、刘金成、俞世强），泌尿外科（张更、秦卫军），实验外科（李纪鹏）；云南农业大学动物医学院（魏红江）；杭州启函生物科技有限公司（杨璐菡）；四川省医学科学院暨四川省人民医院实验动物研究所（周亮、龙恩武）通信作者：陶开山，主任医师，教授，博士研究生导师，Email:**********************；窦科峰，主任医师，教授，博士研究生导师，Email ：***************.cn·５２·第１２卷器官移植肾脏移植受体术后1 d 出现轻微蛋白尿，后因突发严重心律失常死亡。
猪—人异种移植相关实验研究——中国猪种SLA基因序列分析及人NK细胞通过胞吐途径杀伤猪内皮细胞的机制探讨
猪—人异种移植相关实验研究——中国猪种SLA基因序列分析及人NK细胞通过胞吐途径杀伤猪内皮细胞的机制探讨同种异体移植已在临床广泛开展，并成为根治许多终末期器官功能衰竭疾病的唯一手段。
目前面临的问题是：人器官移植物来源十分有限，且获得供体的时机极为随机，以至临床需求缺口日益扩大，并成为制约临床开展移植术的主要因素。
为解决供体器官严重短缺的难题，应用异种动物(主要是猪)为供体的异种移植成为近年移植免疫学领域的研究热点之一。
由于灵长类动物(包括人)体内存在针对猪组织细胞表面α-半乳糖苷的天然抗体，故猪→人异种移植中，人天然抗体可与猪组织细胞表面抗原结合，通过激活补体而导致供者移植物细胞溶解，并引发超急性排斥反应。
国内外均已报道：通过抑制受者补体系统激活等手段，可成功克服超急性异种移植排斥反应。
因此，异种移植后的急性血管性排斥反应和急性细胞性排斥反应成为人们关注的重点。
目前有关异种移植的实验研究主要集中于如下领域：①猪的主要组织相容性复合体(SLA)；②NK细胞ADCC效应对异种靶细胞的杀伤作用，以及人CD4~+和CD8~+T细胞介导异种细胞移植排斥反应的机制。
本课题分析中国猪种SLA基因结构特征，以及人NK细胞杀伤异种靶细胞过程中的胞吐作用及其机制，其立题依据是： 1．猪MHC(SLA)分子是引发急性和慢性异种移植排斥反应的关键抗原，分析比较SLA与人HLA复合体遗传结构的异同，有助于探讨异种移植排斥反应的发生机制，并为选择猪种和制定临床干预方案提供重要线索。
2．人NK细胞是参与异种移植排斥反应的重要效应细胞，其被靶细胞(即猪血管内皮细胞)触发，通过杀伤性胞吐(脱颗粒)过程而释放颗粒酶、穿孔素等，可对猪血管内皮细胞发挥杀伤效应，此乃猪→人异种器官移植急性排斥反应中最早发生和最关键的病理过程。
一、异种移植备选中国猪种的经典SLA基因序列分析近二十余年，国外已分析了多个实验猪种的SLA复合体及其抗原系统，为探讨人类免疫系统识别SLA抗原的机制奠定了理论基础。
▲◇★ 转基因猪 异种移植 离走向临床 专家持审慎态度教程
▲◇★ 转基因猪异种移植离走向临床专家持审慎态度转基因猪异种移植离走向临床专家持审慎态度 2011-03-28 作者：李苑来源：文汇报一种特殊的“猪”年初已漂洋过海来到南京，也许在不久的将来，医生可以把这种猪的器官移植到人体内，用来挽救病人的生命、解除病患的痛苦。
南京医科大学的专家近日宣布，他们正在克隆一种“基因敲除转基因猪”，今年初夏首批猪宝宝就要出生。
这种猪体内会导致人体超急性免疫排斥反应的基因已被敲除掉，从理论上说，其各种器官移植到人身上也不会引发主要排斥反应。
高科技“敲除”排斥基因将这种猪引进国内的，是“海归”赵子建、戴一凡教授领衔的6人专家团。
他俩此前都在美国匹兹堡大学医学院从事分子遗传学方面的研究，去年底带着国际顶尖的“基因敲除猪”技术回到国内，落户南京医科大学代谢疾病研究中心。
赵子建教授介绍说，开展异种器官移植是世界公认的解决器官短缺的重要途径，由于猪器官大小及功能与人体器官比较一致且容易繁殖，国际上把猪作为人体异种器官移植来源的首选动物。
而用猪器官代替人体“报废器官”，关键是要解决排斥反应。
“所谓转基因猪，就是运用现代基因工程技术，把猪身上容易引起主要免疫排斥反应的基因除掉，使移植的猪器官能够与人体相容并长期存活。
”戴一凡教授介绍说，猪血管内皮细胞上含有一种人类没有的糖分子，当猪器官植入人体后，人体的免疫系统会将这种糖分子认作外来物而发起攻击，几分钟内即可将移植器官摧毁。
因此，要解决这一问题，就要“敲掉”猪细胞中产生这种糖分子的基因。
早在2002年，戴一凡课题组就在美国培育出了“单基因敲除猪”，后来又培育出了“双基因敲除猪”，解决了“超急性免疫排斥反应”；在此基础上，他们还给猪细胞转入一些人的基因，对它进行“人源化”修饰和改造，培育出基本不含“排斥基因”的“基因敲除转基因猪”。
戴一凡说，此前他们把转基因猪的角膜、胰岛移植到大动物身上，均未发生排斥反应。
“猪二代”才能用于移植首批克隆出来的“猪一代”还不能直接用于临床试验，必须再繁殖一代，成为“猪二代”才会用于实验。
猪→人异种移植概念 分类 意义
猪→人异种移植念分类意义(一)异种移植的概念与分类异种移植(xenotransplantation)是指将动物源性的细胞、组织、器官或在体外与活的动物源性细胞、组织、器官共同培育的人源细胞、组织、器官输注、植入、移植到人源受者的任何医学过程。
异种移植有望成为缓解人源组织、器官严重短缺这一临床问题的有效替代途径。
1970年，英国剑桥大学著名移植学家Calne首次提出异种移植分类法，并将严格的拉丁语系构词和移植学排异原则相结合，提出了协调性和非协调性异种移植的概念。
进化关系较近，存活时间以天计算的，类似于第一次同种移植排斥反应的异种移植，称为协调性异种移植(concordant xenotransplantation)，如猩猩与人、狗与狼、大鼠与小鼠之间的移植。
进化关系较远，排斥时间以分钟或小时计算的，类似于第二次接触抗原的同种移植反应的异种移植，称为非协调性异种移植(discordant xenotransplantation)，如猪与人，或猴与猪之间的移植。
由于这种分类方法具有其科学性和临床适用性的双重价值，一直被移植学界沿用至今。
由于人类、猿类和旧大陆猴类不表达半乳糖-α-1，3-半乳糖糖基，作为对携带半乳糖-α-1，3-半乳糖糖基结构的胃肠道菌群和其他致病原的免疫应答结果，人和灵长类动物出生后体内就产生了抗半乳糖-α-1，3-半乳糖糖基表位的天然抗体。
猪的细胞表面表达半乳糖-α-1，3-半乳糖糖基抗原，因此，在器官移植中，人体内的异种天然抗体与猪器官血管内皮表面的半乳糖-α-1，3-半乳糖糖基表位结合，从而引发补体激活、凝血连锁等反应，表现为移植器官在数分钟或数小时内吻合血管破损、间质性出血、水肿甚至功能衰竭。
这是引发非协调性器官移植超急性排斥反应的主要原因。
(二)猪→人异种移植的意义随着外科血管吻合技术的提高、新型免疫抑制剂的临床应用以及组织配型工作的不断完善，器官移植已成为治疗器官终晚期疾病的主要手段之一。
异种移植相关功能蛋白人源化基因修饰猪模型的建立
·述评·异种移植相关功能蛋白人源化基因修饰猪模型的建立刘琪帅1，2，李小平1，王可品1，葛维凯1，2，赖良学1（1.中国科学院广州生物医药与健康研究院再生生物学重点实验室，广东 广州 510530；2.中国科学院大学存济学院，北京 100049） DOI ：10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.002 基金项目：广东省省级科技计划项目（2014B020225003） 通讯作者：赖良学，Email ：lai_liangxue@随着临床上器官衰竭及功能缺陷等疾病的日益增多，器官移植一直是医生及科学家们努力尝试解决的问题，包括肝脏、肾脏、心脏等重要器官的移植和重建，因此合适的移植供体就显得尤为重要。
由于人与人之间移植供体资源匮乏，且找到同型合适匹配的脏器来源更为稀缺，异种器官移植就成为解决供体来源最重要的方法。
由于猪的器官大小、解剖结构、生理代谢和免疫系统等与人类非常相似，因此被认为是最理想的异种器官移植供体。
相比于同种器官移植， 异种器官移植存在的障碍更多， 包括更为复杂的免疫排斥反应、内源性逆转录病毒感染、异种功能蛋白在人体发挥的功能及安全性问题等。
从目前的研究进展来看，世界上大部分异种器官移植实验室特别关注前两种障碍，因此构建出数十种基因修饰猪模型用于研究。
但对于异种功能蛋白在人体的功能及安全性问题，目前还很少涉及。
本实验室是最早进行猪功能蛋白人源化研究的实验室，在此领域也取得了一定的进展，本文将对异种移植相关功能蛋白人源化的基因修饰猪的建立进行综述。
1 胰岛素人源化点突变基因修饰猪 1型糖尿病又称为胰岛素依赖型糖尿病，临床 上的治疗方法是胰岛素注射或胰岛移植。
目前， 胰岛素注射是1型糖尿病主要的临床治疗方法， 但存在很多问题：① 胰岛素用量难以精确控制，血糖波动幅度较大，胰岛素注射后可能会出现低血糖昏迷或引起其他一些相关并发症；② 长期注射胰岛素易引起患者皮下结节，增加后期注射难度；③ 1型糖尿病患者需终身注射胰岛素，治标 不治本，患者需承受巨大的身体痛苦和经济压力。
基因修饰猪在异种器官移植中的研究进展
＿
【 Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ 】 Ｏ ｒ ｇ ａ ｎ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｓ ｔ ｈ ｅ ｍ ｏ ｓ ｔ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｔ ｏ ｔ ｒ ｅ ａ ｔ ｅ ｎ ｄ — ｓ ｔ ａ ｇ ｅ ｏ ｒ ｇ ａ ｎ ｆ ａ ｉ ｌ ｕ ｒ ｅ ，
修 饰 猪 在 猪 一灵 长 类 动 物 异 种 器 官 移 植 中 的研 究 与 应 用 进 行 综 述 。
【 关键词 】 基因修饰猪 ； 异种器 官移植 ； 基 因编辑
Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｐ ｒ ｏ ｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｏ ｆ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ ｌ ｙ ｍｏ ｄ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｐ ｉ ｇ ｓ ｉ ｎ ｘ ｅ ｎ ｏ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ａ ｉ ｔ ｏ ｎ Ｃ ｈ ｅ ｎ Ｐ ｅ ｎ ｇ ｆ ｅ ｉ 一， Ｎ ｉ ｅ
Ｈｕｉ ｒ ｏ ｎ ｇ２
，
Ｄ ａ ｉ Ｙ ｆ ｉ ａ ｎ ，Ｃ ａ ｉ Ｚ ｈ ｉ ｍｉ ｎ ｇ ２ ，Ｍｏ ｕ Ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ２ ． Ｚ ｈ ｏ ｎ ｇ ｓ ｈ ａ ｎ Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆＭｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ，Ｓ ｕ ｎ Ｙ ａ ｔ — ｓ ｅ ｎ
ｂ ｕ ｔ ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｖ ｅ ｒ ｅ ｓ ｈ ｏ ｌ ｆ ａ ｇ ｅ ｏ ｆ ｄ ｏ ｎ ｏ ｒ ｏ ｒ ｇ ａ ｎ ｓ ｈ ａ ｓ ｂ ｅ ｃ ｏ ｍｅ ｔ ｈ ｅ ｂ ｉ ｇ ｇ ｅ ｓ ｔ ｏ ｂ ｓ ｔ ａ ｃ ｌ ｅ ｆ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ｏ ｒ ｇ ａ ｎ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ． Ｒｅ ｃ ｅ ｎ ｔ ｌ ｙ ，ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｆ ｘ ｅ ｎ ｏ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ０ ｎ ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｄ ｅ ｓ ｐ ｏ ｔ ｅ ｎ ｔ ｉ ｌ ａ ｌｔ ａ ｅ ｒ ｎ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ｓ ｔ ｏ ｓ ｏ ｌ ｖ ｅ ｔ ｈ ｅ ｅ ｖ ｅ ｒ ｉ ｎ ｃ ｒ ｅ ａ ｓ ｉ ｎ ｇ ｓ ｈ ｏ ａａ ｇ ｅ ｏ ｆ ｄ ｏ ｎ ｏ ｒ ｏ ｒ ｇ ａ ｎ ｓ ．Ｔ ｈ ｅ ｐ ｉ ｇ ｉ ｓ ｃ ｏ ｎ ｓ ｉ ｄ ｅ ｒ ｅ ｄ ａ ｓ ｔ ｈ ｅ ｍｏ ｓ ｔ ｓ ｕ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｘ ｅ ｎ ｏ ｇ ｒ ａ ｆ ｔ ｄ ｏ ｎ ｏ ｒ
猪红细胞血型抗原修饰异种输血的研究进展
猪红细胞血型抗原修饰异种输血的研究进展王捷熙,章扬培(军事医学科学院输血研究所,北京100850)摘要 异种器官移植所取得的突破性进展为异种输血的研究带来了曙光。
人与猪的红细胞的血清学和生物化学特性有许多相似之处,因此猪就成为实现异种输血最具可能性的红细胞供体。
猪红细胞上存在异种抗原,包括αG al抗原和non2αG al抗原。
αG al抗原和人血清中天然存在的抗αG al抗体结合后引起的免疫排斥反应在抗体介导的凝集反应中起主要作用。
但是non2αG al抗原和人血清中天然存在的抗non2αG al抗体结合引起的免疫排斥反应作用也不能低估。
经特定修饰、改造以后的猪红细胞,是来源丰富的异种血源。
关键词 红细胞;血型抗原修饰;异种输血中图分类号 R3311141;R45711R ecent Advance on B lood G roup A ntigen Modification of Porcine E rythrocytes WAN G Jie2Xi,ZHAN G Yang2Pei(Instit ute of Transf usion Medici ne,Academy of Military Medical Sciences,Beiji ng100850)Abstract Advances in the field of xenotrans plantation raise the intriguing possibility of using porcine red blood cells (pRBCs)as an alternative source for blood transfusion.Serologically,pRBCs share a number of characteristics with human red blood cells(RBCs),so pRBCs are considered the most likely donor for xenotransfusion.However, xenoantigens on porcine erythrocytes play major roles in antibody2mediated RBC destruction.Although theαG al epitope (G alα1,3G alβ1,4G alNAc2R)is the major xenoantigen on porcine erythrocytes and is responsible for the binding of the majority of human natural antibodies,other non2αG al xenoantigens have been identified.The im portance of these non2αG al xenoantigens in binding human natural antibodies and subsequently triggering immunological responses cannot be underestimated.K ey w ords erythrocyte;blood group antigen modification;xenotransfusion 近几年来,人们对异种器官移植倾注了极大的热情和精力[1],在分析和鉴定主要异种抗原、建立转基因动物模型和延长移植体存活时间等方面取得了突破性进展[2,3]。
人源化基因修饰猪红细胞与人血清免疫相容性的体外研究
人源化基因修饰猪红细胞与人血清免疫相容性的体外研究陈蕾佳;崔梦一;宋翔宇;王恺;贾志博;杨鎏璞;董阳辉;左浩辰;杜嘉祥;潘登科;许文静;任洪波;赵亚群;彭江【期刊名称】《器官移植》【年(卷),期】2024(15)3【摘要】目的探讨野生型(WT)、四基因修饰(TKO/hCD55)和六基因修饰(TKO/hCD55/hCD46/hTBM)猪红细胞与人血清的免疫相容性和免疫差异。
方法收集20名不同血型志愿者的血液,将WT、TKO/hCD55和TKO/hCD55/hCD46/hTBM猪红细胞、ABO-相容(ABO-C)及ABO-不相容(ABO-I)人红细胞分别暴露于不同血型人血清中,检测血凝集、抗原抗体结合(IgG、IgM)水平和补体依赖细胞毒性,评估2种基因修饰猪红细胞与人血清的免疫相容性。
结果 ABO-C组未出现明显凝集;WT组和ABO-I组凝集水平高于TKO/hCD55组和TKO/hCD55/hCD46/hTBM组(均为P<0.001)。
WT组猪红细胞裂解水平高于ABO-C组、TKO/hCD55组和TKO/hCD55/hCD46/hTBM组;ABO-I组猪红细胞裂解水平高于TKO/hCD55组、TKO/hCD55/hCD46/hTBM组(均为P<0.01)。
TKO/hCD55组猪红细胞IgM和IgG结合水平均低于WT组和ABO-I组;TKO/hCD55/hCD46/hTBM组猪红细胞IgG和IgM结合水平低于WT组,IgG 低于ABO-I组(均为P<0.05)。
结论基因修饰猪红细胞的免疫相容性优于野生型猪,并接近于ABO-C,人源化猪红细胞在血资源奇缺时可考虑作为血液来源。
【总页数】7页(P415-421)【作者】陈蕾佳;崔梦一;宋翔宇;王恺;贾志博;杨鎏璞;董阳辉;左浩辰;杜嘉祥;潘登科;许文静;任洪波;赵亚群;彭江【作者单位】河北北方学院研究生院;中国人民解放军总医院第一医学中心神经外科医学部;中国人民解放军总医院第四医学中心骨科医学部研究所;邯郸市中心医院神经外科;成都中科奥格生物科技有限公司【正文语种】中文【中图分类】R457.1;R392【相关文献】1.FGF2人源化单抗E12及其联合顺铂/紫杉醇体外抑制乳腺癌细胞增殖作用的研究2.二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体与人嗜酸性细胞神经毒素重组免疫毒素融合基因的构建及表达3.人源性抗肝癌单克隆抗体的免疫组化及细胞免疫化学研究4.人牙源性间充质细胞与陶瓷化骨支架材料相容性的实验研究5.经IFN-γ诱导的人IL-2基因修饰的人原代成纤维细胞体外细胞因子表达及某些免疫学特性的研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
!"#$%
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
/0123456789%:
!"#
! " 8$97:;<7=%&’(7> $ ?@ * ) % % + (
;!<! ABCDEFGHIJKLMEFNOPQ $ RHIST E F P Q D U V D W X % B Y 6 + Z [ S ! . , " \] $ ^_‘abcd " +ZjVkMOl$ pqrC m" / 0 1 / 2 . 3 )$ 3 )$ & 4 5" 3 )$ & 4 5 no$ & efgh[Si ! " , , stuvwxy $ dzjVLM{|} $ ~ % d ! E 3 )6 & 4 5 jV+ZY6 $ FSToDLsD C E F L M { D W X % $ CM[! 8 1 9 2 . 7 $ }D ¡¢£ ¤ $ ¥ E F S T D K ¦ § ¨ © ª «%Z ¬$ ®¯°±L . : 8 . 8 ; <1 / 1 8 = 2 1 ; < > ? @ A" , DCtu²³D " 3 )$ & 4 5 ´zµ¶D·¸ $¹®bºCEFSTD»¼ $½¾23DO9¿ ¤% =>? ! Y6+Z[S &EFS C" 3 )$ & 4 5& @ABCD ! D!!! B & * !C 6 *& @ & # !6 !!!! EFGHI ! ! " EJKD ! % ! " &’# + + ! ! % % & % "’% " # $’% "
¿ U À Á @ CEF²³ P tu Z ëÀÞ MN¶¼½¾ $ EFz Âà D hi¼q $ £ èC ’ 7 ?’( Ä Õ 8 ý Å è’ST ] $ °±èE F  à %$ ï ¶¼½¾ÆÇ n $ È hÉ $ mEF Ê Ë Q Ì % V H @ ;îèC P t u 8 Í Î Ï Ð · ¸ A W DX ! = 0 < 9 ; I 0 19 I I0 : L < 2 8 . " " $ mA D+Zë Ñ ! ; K 8 I 9 ; I 0 1 3 1 ; I 0 / 2 8 . W DX u ¢Á Ò $ 7 , °± Ó $ xÔÕ òótu Ö³ ST( % =6 =! /23789RS6[\ CDþ ² ÷ $ 9èîCtu²³D 4 ¶ ·«BC $ ®mCDEFSTÇ $ ×Ø v Ù TD @% À Ád 4 ¶· D ÚÛ 2 3 $ Ü R 4 ¶ · D 9 è$ Ý®" 3 )$ & D A Br % efgh[Si ! 3 )$ & 4 5" " ès Þ ß 3 J C s t u å $ AB+ZY6[S ! " xy $ ^_‘abcd " . / 0 1 / 2 . 3 )$ & 4 5 +ZjVk , , , m" M Ol $ ¸] ðB’(stu à STvw 3 )$ &4 5 no $ xy $ ïvwC¦UÃvÙ ¢u L ¥ N " 3 )$ & 4 5 D C$ á ÚCEFDLM{|} % TD @$ C E 2 J 0 .V 0 2( Bî C t u L M { | } D s t u å ! âã ä å t u " ¿D·R Y N * $ Z D ) 3 ) %$ > W ? [ * 3 !$ > zçDRè > W [ [ * 3 &$ > W [ [ * 3 $$ W [ [ * 3 $R æ t u $ t u % C t u Y 6 + Z [ S B D é s R 7 > Z $ " *Ñ ìÛÞDí6é > Z $ " +% z+ZY6 [ S ê ) « ë # 7 " $ s! kMOlè " N . 8 9 N 8 ; /= 9 / 8 1 3 )$ & 4 5 +Z8Dî¸ Ol ] m ï r N í 6 é s D C s t u ( Ú î ¸ # Ìæ $ kMO å$ MNð0ñò \ 8 * * ! Y ‘ÈjV > W @ ó& $ lô õ Ð ã D " 4 5 ? ( YÑ " 4 5 ? # D !öOUjV?÷à ó &$ > W @! Z @ 3 > W @" Z @ 3 > W @ È ó & +6 * N M" 3 )$ & 4 5 +Z øñ$ > W @ ó & ö O ê ù ú « ë $Õ > W @ B(R # # \ 8 * * ! Y " 3 W D 5 W 4 W W 5 5 W 5 D 5 W 4 W W 5 5 W 5 5 3 && 4 5 ? ( Y " " 3 D 4 D4 4 5 W 4 5 4 D W W D 5 DD W W D 4 DD 5 3 && 4 5 ? # D !# " 3 " D4 W W W D 5 W 4 5 4 W 5 4 DD W D 5 W DD 4 5 W 3 &% Y 8 ; / L 1 . ûüýþÿ ] ê ë !" « ë $ ÈjV Y 8 ; / L 1 .# $ ý þ$
CEFSTDLM{ !" n !!!!!!!!!!!!!!!! -./ #
)+ $ 3 L 4 Rµß * 5 z E F 9 6 3 L µ ß$ "37
" # +
) &+ $ % # ï ÷ L D 5 t u » ° D * / 2 8 . V H @"
! " # " $ % &’ ( ) % * % & + $ % ( #( *, ( & % # ". + # 0 * ( -1 2 3 + # % #4 " # ( $ + # 0 6 + # $ + $ % ( # / 5
EF E ; 0 . 3 G 2 . ,
! / + 0 02 * 3 + 4 0 56 7 5 5 * 6 * 8 9 0 5 ( 7 : 8 ;< + = * 9 > + 8 6 ; 0 > ; 0* ) % % + ($ 6 ; + 0" *$ .1 . ?$ .
!"#$ ! %&#$ ! ! % % !’% (’! $" ! % % &’% $’) & " ’()* ! #$%&’()*+, ! ! % % !’) ! !’% * $ 0$ +,-. ! -./ ! 1234 $ 2356 # %&’(7 % ) # " #’ "
ST % èL<7éêë $ jVEFSTì®íîk + ZST $ ïEFS T ® ð B å ñ ò ó 7 Ê Ë ô õ $ ~öLDksSTD÷ $ øRO®D k sDEFGM $ NO ç ù $ úK¼ûü_ÒEFSTDL " # $ % &$ ýþÁ $ îSTEFGMNOP %ÿ!$ Q$ ’ ÿLè ( ¾ E F D Á ) 8 * + $ ,-BîSTL D’(EF $ ýRHIï . ¤D /01 % CD¢ ( 7 2
# 7 8 0 $ + & $ H . 8 / 1 0 . < I 0 . / 0 / 2 8 .! H >" J 1 8 K7 2 2 . / 8L ; K 0 .L 0 <M .9 8 . < 2 : 1 :0 <K 0 . < / 88 = 1 9 8 K / L -, 1 0 / I 0 9 N8 J 7 , $ : 8 . 8 18 1 0 .0 = 0 2 I 0 M I 2 ./ 1 0 . < I 0 . / 0 / 2 8 .< ; 1 1 6 P .8 1 : 1 / 8Q 0 N .1 9 / 2 8 .M / Q .L ; K 0 .0 . :7 1 8 0 9 L <8 J 2 0 , 7 , O R , 7 7 ( 6 1 9 / 2 8 ., . 3 )$ & 4 5J 1 8 K7 8 1 9 2 . -9 I I <: 2 1 9 / I . :0 9 9 ; 1 0 / I . / 0 1 / 2 . 0 = -M .7 1 8 8 < :/ 8I 2 K 2 . 0 / -’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tuEFST $ ÃÄÅÆnÇÈD l  ) t !! ÀÁl ) uEFÉÄ< 7 Ê Ë D O ® \ ] Ì % Í Î Ï Ð Ñ Ò " $ ÐDlr $ ÓS T · R Ô Õ% Ö s S T ! 0 ; / 8 1 0 J / , ×ÓGÖSTÒÐØÙDlÂSTÚÒÐ & kk+ Z S T " $ ! ×!"qÛܼµkÝÞµß D à s ! ká 1 0 J / < . O , ⢸ ã ä å ’ ( " Ì æ D S T& k+ZST! 0 I 3 " " $ × k ’ ( ! !"qÛçkàsÌ < I 8 1 0 J / 9 2 < , 7 " æDST & ST ! ×çk’( àsÌæD U . 8 1 0 J / ,