异种移植

猪作为异源器官供体需克服的问题
一、异种器官移植的免疫排斥反应。 二、异种器官移植PERV（猪内源性逆转录病毒）感 染问题。
免疫排斥反应分类
• 超急性排斥反应
• 急性血管性排斥反应 • 慢性排斥反应 （在器官移植上后两者基本上可以忽视，在此不以 讲解）
超急性排斥反应（ HAR ）及解决方案
超急性排斥反应指移植的器官在几分钟至数小 时内被破坏。多数理论认为 HAR 是由人类预存的天 然抗体 ( 主要为 IgM) 与供体血管内皮细胞的表面抗 原 α -1 , 3 半乳糖 (α -Gal) 抗原结合而启动 , 抗体 结合物激活补体系统和凝固联级反应,导致移植物出 血和血小板血栓形成 , 破坏内皮功能。HAR 中补体 激活是最重要的,而其内皮细胞是宿主免疫反应的首 先靶位。
异种器官移植PERV（猪内源性逆转录病毒） 感染问题
最 近 发 现 的 PERV (porcine endogenousret rovirus , 猪内源性逆转录病毒 ), 由一条 RNA 组 成, 被包含在糖蛋白的外膜里, 这些病毒的RNA序 列已经与猪的染色体永久地结合在一 PERV 对于猪 本身并无危害 , 但猪的器官移植给人类 , 这种病 毒能否随之传递给受体人并造成危害 , 目前尚无 确切的结论。
谢谢！

如果能阻止异种供体细胞内 α -1 , 3 半 乳糖基因的表达, 使得人类抗α -Gal 抗体没 有结合的靶抗原, 就可以避免由于人类抗α Gal 抗体与异种抗原结合而引起的超急性排 斥反应。目前的分子基因敲除和基因定点突 变技术已做到了这一点。
基因敲除和基因定点突变技术
利用体细胞核移植技术敲除基因或定点突变的主 要过程是, 首先利用DNA 同源重组的原理, 构建基因 敲除或使目的基因定点突变的载体, 然后转化到动物 的体细胞系中;筛选转化的体细胞, 建系, 分离单个 细胞, 取出细胞核;采用显微注射方法移入去核的猪 卵母细胞中, 电融合形成重组胚, 重组胚移植到受体 母猪, 分娩产出的小猪即是敲除基因或基因定点突变 的克隆猪, 这些猪没有α -GT 基因的表达产物。
归纳上述的有关研究 , 单独转 DAF 基因猪的心 脏和肾脏在联合应用大剂量免疫抑制剂的情况下可 以存活7 ～ 30 d , 并最终因血管内凝血丧失功能 而告终。一个较早期的研究显示 , 至少 2 000 个分 子的补体结合到细胞表面, 才能发生对细胞的损害。 而DAF 和其他补体调节蛋白阻止了补体达到这一结 合水平。
4 、猪的某些肿瘤 , 例如自发性皮肤黑色素瘤 , 与人 类的肿瘤发病机制非常接近, 其特点是发生于子 宫内或产后自发,有典型的皮肤自发性退行性病变, 传播方式与人类的完全相同。 此外 , 猪作为人类器官移植的动物还有以下 一些优势：妊娠期短,产仔数多,后代生长快,更重 要的是猪的不同发育时期的器官,如心脏、肾脏等 与不同年龄人的器官在大小上比较接近,极有可能 代替病人的某些器官。
基因敲除和基因定点突变技术现状
2003 年 Phelps 等利用同源重组技术获得了 世界上第1 头双敲除alpha-1,3-Gal（GGTA1）基 因的转基因克隆猪，开启了利用体细胞基因打靶 技术生产异种器官移植供体的先例。此后，日本 和澳大利亚等国的几个科研小组也相继获得了敲 除GGTA1 基因的转基因克隆猪。将敲除GGTA1 基因的猪心脏和肾脏分别移植到免疫抑制的狒狒 体内，移植后的异种器官可以在狒狒体内正常存 活2 ～ 6个月，最长的个体生存期长达179 d。
猪作为异种器官移 植供体的浅谈
器官移植
• 器官移植 :是将健康的器官移植到通 常是另一个人体内使之迅速恢复功能 的手术 , 目的是代偿受者相应器官因 致命性疾病而丧失的功能。广义的器 官移植包括细胞移植和组织移植 。
器官移植的发展
• 1954 年美国 Murtay 在同卵双胎的个体间进行肾移 植获得成功，开辟了器官移植的新时代。 • 1961年Hitchings等将硫唑嘌呤用作嘌呤代谢的抑 制剂，抑制抗体的产生，并延长兔皮肤同种移植 物的存活。 • 1962 年 Murray 施行首例尸体肾移植，受者服用硫 唑嘌呤获得长期存活。 • 我国器官移植始于 20 世纪 60 年代， 1974 年第一例 肾移植成功。 自此，现代器官移植时期正式开始。
敲除GGTA1 基因的近交系五指山小型猪
2010 年，中国农 业科学院北京畜牧兽 医研究所潘登科领导 的科研团队成功研制 出敲除 α -1, 3 半乳 糖苷转移酶基（ GGTA1 ） 单敲除的近交系五指 山小型猪，为我国创 建器官移植迈出了关 键的一步。
当然基因敲除或基因定点突变技术解决 了主要免疫排斥反应，还需要解决其他排斥 反应，同时也还需要做一些临床前的研究工 作。所谓临床前研究，就是先将器官移植到 与人很接近的猴子身上进行研究实验，解决 排斥反应、临床疾病等各种可能存在的问题， 最终为人的临床应用奠定基础。
我国“九五”“863”计划中, 中科院发育所孙 方臻等人构建了 hDAF 基因, 湖北省农科院生物技术 研究所魏庆信等人将其导入猪的基因组 , 构建成转 hDAF 基因猪。华中科技大学同济医院陈实等人用这 种转基因猪的心脏异位移植到猴的腹腔 , 存活 90 h 以上, 成功克服了超急性排斥反应。 David H .Adams 等人联合转染CD59 和DAF 的 两个外源基因的试验表明, 其转基因猪的心脏能更好 地克服超急性排斥反应。我国陈实等人的离体实验进 一步证明 , DAF 联合转染 CD59 较联合转染其他基因 对异种细胞有更好的保护作用。
目前学界似乎已经达成共识，认为 异种移植使用猪作为供体是最佳选择。
理论上讲，选择与人亲缘关系最近的其它灵长 类动物，比如猴子、猩猩、狒狒等作为移植物来源 应该是最佳方案。但这些动物生长周期慢（一般要 5~10 年，甚至超过 10 年），而且繁殖率低，一胎 一仔，饲养成本较高，很难满足人类器官移植的需 求。另外，这类动物，比如猴子，本身个子小，体 重轻，其器官对于很多人来说都不适用。
异种移植的原因
科学家们将目光转向异种移植是 因为同种移植需要的器官太少，满足 不了病人的需求。 数据显示，中国每年有150万病患 亟需接受器官移植手术，但最终能够 获得供体并接受移植的病人不到1万。
为什么会出现这种情况？
在亚洲地区，尤其是中国，大部分公众的传统 观念根深蒂固，很少有人自愿捐献器官。再加上我 国目前没有明确规定脑死亡标准的法律，很多病人 要等到全身器官衰竭的时候，才会确定死亡，但这 样的器官已经不能成为可供使用的供体，如此一来， 可供利用的器官就更是少之又少了。即便是在有相 对完善的“联合器官共享网络”的美国和欧洲，每 年只能满足约十分之一病人的需求，仍有很多病人 因无法及时得到供体而死亡。
异种移植
1905年，法国一位外科医师曾尝试 将兔肾移植片移植到肾功能衰竭患者的 身上，虽然这个病人仅存活两周，但这 位医生的尝试却为世人提供了一条器官 移植的新思路。同种移植之外，异种移 植首次出现在人们的视线中。
异种移植的概念：
所谓异种移植，即把动物的组织、器官 移植到人的身上，代替不健康的组织、器官 行使功能。 较之同种移植，异种移植的好处是器官 的来源不受限制，但异种间存在的免疫排斥 反应要比同种间强很多，这是最大的难题。 如果免疫排斥反应这个问题能够解决，异种 移植将能够得到和同种移植同样的效果。
另外一种方案是通过转基因技术 , 使异 种动物的移植物血管内皮细胞表达人源补体 抑制蛋白 , 从而使动物的细胞不能激活人的 补体, 达到阻止超急性排斥反应的发生。
转基因技术
在异种移植过程中, 能够抑制超急性排斥反应的 主要是以下膜结合补体调节蛋白, 作用于补体早期阶 段的 DAF( 人类补体促衰变因子 ) 、 MC （ 膜辅蛋白 ) 与 CR Ⅰ（补体Ⅰ 型受体 ), 作用于攻膜复 （ MAC) 的 CD59 与 C8bp 等。上述各种补体调节蛋白中 , 对 DAF 的研究最多。如采用转基因技术, 使人的一种或数种 补体调节膜结合蛋白得以在猪的细胞膜上表达这种表 达有人补体调节膜结合蛋白的移植物实际上“欺骗” 了人的补体系统使补体系统将“非我”的外源物当作 “自我” 的组织或器官,从而不发生或较弱地发生超 急性排斥反应。
猪的比较医学特点
猪与人类有许多类似的生物学特点：
1、猪的皮肤与人类的皮肤都具有上皮修复能力, 对 两者的上皮增生生物学研究发现, 猪为 30d ，人类 的为21d，皮肤脂肪层和烧伤后内分泌与代谢的改 变两者也相似。
2、猪和人对高胆固醇的饮食的反应是一样的。 3、产期仔猪和幼猪的呼吸系统、泌尿系统和血液系 统与人类的新生婴儿很相似,像婴儿一样, 仔猪亦 患营养不良症。
异种移植的未来
目前，应用于各种器官移植的基因改造猪的研发和培育 还在进行中，因为各种器官的要求不一样，对基因改造的程 度也不同。根据现有的大动物试验的结果，有几个部分应该 可以优先上临床，比如胰岛。根据FDA 的规定，大动物实验 中，在适量的免疫抑制条件下，供体在动物体内能够发挥功 能且动物能够存活半年以上，那么该供体就达到了进入临床 的标准。而有科学家已完成试验，将猪的胰岛移植到猴子身 上，结果发现猴子在没有接受任何胰岛素注射的情况下糖尿 病就完全治愈了，因为猪的胰岛在猴子体内发生了作用，并 且接受胰岛移植后的猴子还存活了400多天。这一实验结果为 胰岛进入临床提供了必要依据。
另外，建设超洁净的猪舍原本也是一 个瓶颈问题，因为猪舍内要保证完全无细 菌和病毒，猪食用的饲料和水也要经过无 菌无毒处理，建设成本和维护成本都很高。 但现在，这个问题正在慢慢地解决，比如 我国的长沙就已有研究团队建好了类似的 超洁净猪舍。倘若国内的研发团队间加强 合作，互相利用各自的优势来推进基因改 造猪的培育等各项工作，猪的各种器官、 组织作为供体进入临床应用的时间可能大 大缩短。
而猪正好相反。首先，猪的生长周期 很短，且一胎多产，平均下来饲养成本较 低，器官获取相对容易很多。其次，在形 状大小方面，其器官基本能适用于人类。 第三，猪是杂食动物，它的器官代谢和人 很接近，因此其器官可广泛用作人体角膜、 皮肤、胰岛、关节、肌腱、韧带、肾脏、 心脏、肝脏等器官的移植。最后，猪组织 内的病毒不太会感染给人类。
White 等人 1996 年首次成功地进行了器官移 植用转基因猪的探索 , 他们将 DAF 基因导入猪的基 因组并得到表达。用这种转基因猪的心和肺作人体 血浆活体灌流试验表明 , 这些器官获得了抵御人体 补体系统损伤的能力。 Duke 大学 Kroshus T J 等人 1996 年改用 β 肌动蛋白的启动子控 CD59 , 用 H-2k 启动子控制 DAF , 获得CD59 和DAF 的表达水平比球蛋白启动子 高得多的转基因猪。用这种转基因猪的心脏移植给 狒狒, 被移植物发挥作用的时间显著延长。