1.3.3 功能化纳米探针在生物传感器、细胞分析中的应用

功能化纳米探针在生物传感器、细胞分析中的应用

1 功能化纳米探针在生物传感器中的应用

伴随着纳米技术的迅速发展，各种各样的组成、尺寸、大小、维度及形状的纳米材料被可控的修饰上不同的生物分子，用于发展特殊性质的纳米探针。生物传感方法己经成为发展速度较快的方法，由于其具有灵敏度高、响应速度快、和操作简易等特点。传感的原理基本上都是通过将纳米探针，的识别单元与待测物质结合过程转变为产生的光学、电化学、Roman 等信号的变化。

一些生物小分子如半胱胺酸、谷胱甘肽等在可逆氧化还原、细胞的解毒及代谢中起到了重要的作用，多巴胺等神经递质是人中枢神经系统中不可缺少的环节，AP肽与阿尔茨海默病（AD）密切相关，这些小分子的检测有利于一些疾病的早期诊断和监控。

1.1 荧光纳米探针用于蛋白质的分析

一般都是利用功能化的荧光纳米材枓与另一种生物分子修饰的有机物或者纳米材料先通过能量转移使荧光猝灭，当目标物引入时，由于和修饰的生物分子更强的作用力，使得猝灭的部分离开荧光性的纳米材料表面，纳米材料的荧光性质发生改变检测到目标蛋白。这种方法己经具有普适性，应用在蛋白或者其他生物大分子的分析检测中。

1.2 对核酸的分析检测

发展核酸传感器两个基本的目标是要求所构建的传感器具有高的灵敏度，而且具有高的特异性。性能优良的核酸传感器要能够在低浓度的情况下对核酸进行检测，并具有区别单个碱基错配的能力。在选择性方面，分子信标和肽核酸（PNA）具有很强的优势。相对于线性分子探针，分子倍标杂交存在一个动力学竞争过程，具有更好的选择性和区别单个碱基错配能力。为了实现高灵敏的检测，引入新的信号放大技术尤为重要。

纳米材料由于大的比表面积，可以提供更多的生物分子识别位点；并且可以通过改变尺寸、形状、组成而改变其物理化学性质；同时稳定性高具有较好的生物相容性、结合生物分子的能力等特点。伴随着纳米技术的迅速发展，各种各样的组成、尺寸、大小、维度及形状的纳米材料被可控的修饰上不同的生物分子，用于发展特殊性质的纳米探针，进行信号放大。

金纳米颗粒（AuNPs）是最常见的用于核酸传感分析中的载体，因为它可以很方便的通过巯基或氨基官能团与核酸或蛋白质等大分子进行功能化后得到生物相容性好的纳米复合物探针。利用DNA碱基互补配对原则，可控性地在空间上组装纳米金，AuNPs-DNA复合物体系对DNA检测是近二十几年来发展起来的一种简便、快速的传感方法。

Mirkin课题组在1996年首次报道了DNA修饰纳米金（DNA-AuNPs）这种新型的生物纳

米结构以来，DNA-AuNPs生物纳米探针，被广泛的用于一系列超灵敏的DNA检测。纳米金表面修饰的厚厚的DNA层，不仅由于协调作用能够实现高选择性检测体系的设计，而且可以用于放人检测信号。生物条形码技术是Mirkin课题组基于DNA-AuNPs纳米探针发展的一种超灵敏检测生物分子的策略，检测灵敏度可以和PCR相媲美。在AuNPs上功能化两种不同的DNA探针，分别用于检测靶标分子和结合磁珠。杂交后，利用磁珠从溶液中将结合了靶标分子的AuNPs分离出来，AuNPs上的DNA片段溶出后通过扫描比色法进行检测，检测限达500 zM，即在30μL溶液中能检测到10个拷贝的DNA段。

1.3 荧光纳米探针检测多组分miRNA

近些年來，在基因工程上具有重要作用的miRNA的检测引起了广泛的关注。miRNA可以作为一种肿瘤标记物，或者药物治疗的靶标，或利用其抑制蛋白翻译功能，直接抑制肿瘤基因的表达，在生物医学中有广阔的应用前景。在光学生物传感器中，荧光成为主流的检测手段。

Ju等介绍一种基于量子点和氧化石墨烯（GO）的荧光共振能量转移的快速、灵敏和选择性地检测多组分miRNA的检测方案。该方案利用GO的距离相关的荧光猝灭能力，并结合等温链替代聚合酶反应，提高检测方法的灵敏度。当目标miRNA不存在时，由于引物（P）和探针分子P2或P3形成双链的Tm低导致其稳定性低，将不能引发等温链荇代聚合酶反应。由于GO具有强焚光猝灭作用，且单链DNA与GO存在强相互作用，所以使标E有荧光染料的单链DNA P2、P3表现出很弱的背景荧光。当存在特异性目标序列（T1）时，对应的探针DNA P1识别T1后，由于临位碱基堆积和形成稳定的双螺旋结构，使P1和P的Tm升高几度，这样就可以引发等温链替代聚合酶反应。当四种核苷酸（dNTPs）和DNA聚合酶存在时，等温链替代聚合酶反应将会产生大量的DNA-miRNA杂交双链。由于DNA-miRNA杂交双链和GO的作用力较弱，所以将会观察到P1的强荧光发射。高信噪比和基于等温链替代聚合酶反应的目标放大使本方案具有高灵敏度，而GO的超大比表面积可以同时猝灭标记有不同染料的多种DNA探针的荧光，使本方案可以作为同一溶液中的不同目标miRNA的分析。

1.4 电化学方法检测miRNA

电化学方法简单灵敏，可对核苷酸的杂交反应进行实时检测，故电化学方法在检测miRNA方向具有广泛的应用。Zhang等人构建了寡核苷酸包裹银纳米簇（AgNCs）作为有效的电化学信标，构建了一种对miRNA检测的简单、灵敏、选择性的无标记电化学生物传感器。设计的功能性寡核苷酸片段通过杂交结合目标片段，原位合成AgNCs，它对H2O2表现了高效的催化活性。随后修饰在金电极表曲的带有目标片段识别序列的分子信标与目标片段杂交后，

将含有寡核苷酸包裹的AgNCs引入电极表面。AgNCs对H2O2的高效催化能力构成/灵敏、无标记的电化学miRNA生物传感器，而信标固有的选择件赋予生物传感器良好的特异件。1.5 SERS对核酸肿瘤标志物的检测

表面增强拉曼散射（SERS）近年来在生物和化学传感方面的应爪较为活跃。相比于荧光分析、电化学分析和酶联免疫分析，SERS具有以下优势：有效避免光致褪色、背景低、有效增强分子的拉曼强度，灵敏度髙。因此SERS有望实现对核酸肿瘤标志物的高灵敏度高选择性的检测。Driskell等人构建了一个通过SERS实现对miRNA检测的生物传感器。它应用SERS光谱实现了对miRNA近乎实时的检测（10 s），而且具有非常好的选择性，这项技术可以用于实时检测肿瘤患者不同时期miRNA的表达情况，为目标基因分析和临床生物医药应用提供了潜在的平台。

1.6 SPR检测技术

表面等离子体共振（SPR）通过检测表面等离子体的变化对界面上物质的变化进行检测，SPR传感技术是一项新兴的生物化学检测技术，与传统的生化分析方法相比，SPR传感技术具有无需标记、实时检测、无损伤检测等优点。

Zhang等人以生物素化硫醇DNA分子信标为探针，链霉亲和素功能化金纳米棒为增强表面等离子体共振的信号标记物，设计一种简便灵敏的生物传感器用于miRNA的检测，在最适条件下，该方法的检测极限（LOD）降至0.045pM。

2 功能化纳米探针在细胞分析中的应用

利用纳米材料的较小体积和可控性，可以在纳米尺度和分子水平上实现细胞以及细胞内生命活动的研究，目前已被用于细胞内生物分子的检测，肿瘤细胞成像和治疗等领域。细胞内的生物分子与细胞的正常代谢密切相关，近年来国内外研宄者们对于细胞内金属离子、重要的蛋白酶以及核酸分子进行了一系列的研究工作。Lu课题组发展了一种新型的基于DNA 酶的金属离子传感器，将UO22+特异性的DNA酶链与AuNPs联，DNA酶链上分别修饰荧光基团Cy3和猝灭基团。在没有目标物存在时，荧光染料被粹灭剂和AuNPs同时猝灭；当UO22+存在时，DNA酶切断荧光标记的底物从而释放出Cy3，Cy3的荧光恢复。该方法能实现对细胞里的UO22+成像和检测。

细胞表面或者细胞内有很多蛋白酶与肿瘤细胞的持续分裂或者凋亡密切相关，因此蛋白酶的检测对癌症的早期发现、监测和治疗有重大意义。Ju课题组设计了一种带缺口的分子信标功能化的AuNPs探针，用于原位检测细胞内的端粒酶活性。端粒酶是－种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，是一种逆“转录酶”，在大部分肿瘤细胞中髙表达。该探针以