第九章基因工程
遗传学 第九章 基因工程和基因组学 PPT课件
2018/9/29
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如pUC18质粒具有以下特点：
①. 分子量小，可接受较大外源片段； ②. 拷贝数多，500个／细胞； ③. 克隆位点的酶切位点多，克隆方便； ④. 具有用于检测重组质粒的选择标记 （如α–互补的显色表型）。
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㈡、λ噬菌体（温和型）： 基因组全长为49kb。 噬菌体DNA中间约2/3的序列为中间基因簇，两端为DNA左、 右臂。 中间基因簇可被外源DNA替代而不影响侵染细菌能力。 能接受15-23kb外源DNA片段， 作为cDNA或核DNA克隆载体。 优点： * 不易引起生物危害，有助于“目的”基因进入细胞并增殖； * 携带大片段外源DNA分子，占总量25%时仍不失活。
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美国批准上市的基因工程产品有：人类胰岛素、人 类生长因子、白介酸、干扰素、牛型生长激素、疫 苗等，并不断有新的品种进入临床应用。 在农业上也有很多应用，如1985年开始转基因作物 品种培育，在高梁、水稻、烟草、玉米、棉花等作 物上都获得成功。
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迄今，已设计和构建了一系列以原核启动子代替真核启动子的质粒表 达载体，如大肠杆菌乳糖操纵子、色氨酸启动子德Trp启动子以及λ噬菌 体PI启动子等分别构建的启动子。
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穿梭载体：又称双功能载体，具有克隆载体和表达载体两种作用，能在 两种不同的生物体内复制和往来穿梭。即能在在原核生物细胞中扩增， 又能在真核生物细胞中复制和表达。主要用于在原核细胞和在真核细胞 之间进行基因转移。通常是将载体和待克隆的真核生物DNA 片段现在细 菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。 这类载体必须即具有细菌的复制原点或质粒的复制原点，又含有真 核生物体的复制原点，如SV40复制原点或酵母的自主复制系列 （autonomously reolicoting sequence ,ARS),此外这类载体还应具有 可资利用的酶切位点和合适的筛选指标，这样的载体即可往来穿梭于原 核细胞和在真核细胞之间进行基因转移。穿梭载体不仅可把目的基因引 入真核细胞，而且还可以从真核细胞染色体上回收基因或DNA片段。
基因工程 电子版
作者：吴乃虎出版社：高等教育出版社第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程的关系二、基因工程的诞生与发展第二节基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础二、DNA的结构和功能三、基因操作技术的发展促进基因工程的诞生和发展四、基因工程的内容第三节基因的结构——基因操作的理论基础一、基因的结构组成对基因操作的影响二、基因克隆的通用策略第一篇基因操作原理第二章分子克隆工具酶第一节限制性内切酶一、限制与修饰二、限制酶识别的序列三、限制酶产生的末端四、DNA末端长度对限制酶切割的影响五、位点偏爱六、酶切反应条件七、星星活性八、单链DNA的切割九、酶切位点的引入十、影响酶活性的因素十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性第二节甲基化酶一、甲基化酶的种类二、依赖于甲基化的限制系统三、甲基化对限制酶切的影响第三节DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶二、KIenow DNA聚合酶三、T4噬菌体DNA聚合酶四、T7噬菌体DNA聚合酶五、耐热DNA聚合酶六、反转录酶七、末端转移酶第四节其他分子克隆工具酶一、依赖于DNA的RNA聚合酶二、连接酶三、T4多核苷酸激酶四、碱性磷酸酶五、核酸酶六、核酸酶抑制剂七、琼脂糖酶八、DNA结合蛋白九、其他酶第三章分子克隆载体第一节质粒载体一、质粒的基本特性二、标记基因三、质粒载体的种类第二节λ噬菌体载体一、λ噬菌体的分子生物学二、λ噬菌体载体的选择标记……第四章人工染色体载体第五章表达载体第六章基因操作中大分子的分离和分析第七章基因芯片技术第八章PCR技术及其应用第九章DNA序列分析第十章DNA诱变第十一章DNA文库的构建和目的基因的筛选第十二章基因组研究技术第二篇基因工程应用第十三章植物基因工程第十四章动物基因工程第十五章酵母基因工程第十六章细菌基因工程第十七章病毒基因工程第十八章医药基因工程第十九章基因工程产品的安全及其管理第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程的关系基因操作（gene manipulation）：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。
基因工程ppt课件高三
03
基因工程在医学领域的应用
基因治疗
基因治疗是指通过改变人类基因来治疗遗传性疾病和获得性病变的方法 。
基因治疗可以分为直接基因治疗和间接基因治疗。直接基因治疗是将正 常的基因导入病变细胞，以取代异常基因；间接基因治疗则是通过调节
病变细胞的基因表达来达到治疗目的。
基因治疗在遗传性疾病、肿瘤、感染性疾病等领域具有广泛的应用前景 ，例如囊性纤维化、镰状细胞贫血、癌症等疾病的基因治疗研究已经取 得了一定的成果。
基因工程的发展历程
自20世纪80年代以来，基因工程技术不断发展 和完善，已经广泛应用于农业、工业、医学等领 域。
基因工程的未来发展
随着基因编辑技术的发展和应用，基因工程将在 未来发挥更加重要的作用，有望解决许多人类面 临的重大问题。
基因工程的应用领域
农业领域
基因工程在农业上的应用主要包 括抗虫、抗病、抗除草剂等转基 因作物的培育，以及提高农作物
合成生物学
通过设计和构建人工基因组和细胞系统，实现生物体的定制化，为工 业生产、环境保护等领域提供新的解决方案。
基因工程面临的挑战与问题
安全问题
基因工程操作可能引发不可预测的后果，如基因突变、生态失衡等，需要建立严格的安 全评估和监管机制。
伦理问题
基因工程涉及到人类和动物的遗传信息，可能引发隐私、公平和尊严等方面的伦理问题 ，需要制定相应的伦理准则和法规。
开展基因工程伦理
教育
在学校、社区、企事业单位等各 个层面开展基因工程伦理教育， 引导人们正确看待基因工程技术 的利与弊，树立正确的科技伦理 观念。
05
未来展望与挑战
基因工程的未来发展趋势
基因治疗
利用基因工程技术治疗遗传性疾病和癌症等严重疾病，提高患者的 生活质量和生存率。
高中生物课件-基因工程
3.用转基因的动物生产药物
乳腺生物反应器
3.用转基因的动物生产药物
将 药用蛋白基因 与 乳腺蛋白基因的启动子 等调控组件重 组在一起，通过 显微注射等 方法，导入哺乳动物的 受精卵 中，将 受精卵 送入母体，使其发育成转基因动物。转基因动 物进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁生产所需要的药品，称为 乳腺生物反应器或乳房生物反应器。
工 抗逆转基 调节渗透压的基因（盐碱，干旱）
因植物
抗冻蛋白基因（耐寒）
抗除草剂基因
利用转基 将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因 因改良植 导入植物或改变必需氨基酸合成途径中 物的品质 某种关键酶的活性
二、动物基因工程前景广阔
1.提高动物生长速度：将外源生长激素基因导入动物体内 2.改善畜产品品质：将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组内，降低
细菌细胞内没有内质网、高 尔基体等细胞器，产生的药 物蛋白可能没有活性
受体细胞 动物的受精卵
微生物细胞
导入目的基 显微注射法 因的方式
不需严格灭菌，温度 生产条件 等外界条件对其影响
不大
药物提取 从动物乳汁中提取
Ca+处理法（感受态 细胞法）
需严格灭菌，严格控制工程 菌所需的温度、pH、营养物 质浓度等外界条件
如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等
2、改良农作物的品质 3、利用植物生产药物
抗虫转基 因植物
Bt毒蛋白基因 蛋白酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂基因
植物凝集素基因
程植
病毒外壳蛋白基因
的 物 抗病毒基 抗病转基因 因
病毒的复制酶基因
植物
几丁质酶基因
成果 基因 (病原微生物）抗真菌基因 抗毒素合成基因基因组和部分基因组(cDNA)比较
基因工程课件
EcoR I 5’-GAATTC-3’ EcoR V 5’-GATATC-3’
3’-CTTAAG-5’
3’-CTATAG-5’
Pst I 5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC-5’
产生平齐末端
产生粘性末端
（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。
2. DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：
dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
基因工程中必须使用甲基化酶 失活突变的菌株。
3. 温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。 大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。
酶 Apa I Bcl I Mae II Taq I
Tris-HCl：
维持pH；
二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；
牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；
五、限制性内切酶对DNA的消化
1. 内切酶与识别序列的结合模式
1986年J.A. McClarin等通过X射线 晶体衍射发现II类限制酶是以同型 二聚体的形式与靶序列结合。
GAATTC CTTAAG
最适温度oC 酶
30
Apy I
50
BstE II
50
Mae III
65
最适温度oC 酶
30
Ban I
60
Mae I
55
Sma I
最适温度oC 50 45 25
4. 缓冲液(Buffer) 是影响限制酶活性的重要因素。
商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。 （1）缓冲液的化学组成
MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度；
基因工程原理练习题及其答案
基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。
平末端：DNA片段的末端是平齐的。
《基因工程》课件
人类基因编辑
基因工程在人类胚胎编辑方面的应用引发了关于人类尊严和生命 伦理的争议。
基因歧视
基因信息可能被用于歧视某些人群，如保险、就业等方面的不公平 对待。
生物种族灭绝
基因工程可能导致某些物种灭绝或生态失衡，违背了生态伦理原则 。
基因工程的法规与监管
国际法规
国际社会制定了一系列关于基因工程的法规 和伦理准则，如联合国《生物多样性公约》 等。
国家法规
各国政府根据国情制定了相应的基因工程法规和监 管措施，以确保安全和伦理问题得到有效监管。
行业自律
相关行业组织和研究机构也制定了自律规范 ，要求研究人员遵守伦理准则和法律法规。
05
未来展望与挑战
基因工程的未来发展趋势
基因治疗
利用基因工程技术修复或替换病变基因，治疗遗传性疾病和癌症 等严重疾病。
2000年代至今
基因治疗、基因编辑等技术的 出现和应用，为人类疾病治疗 和生物产业的发展带来了新的
机遇和挑战。
基因工程的应用领域
农业
培育抗虫、抗病、抗逆等性状的转基 因作物，提高农业生产效率和粮食安 全。
医学
用于基因治疗、药物研发、疾病诊断 和治疗等领域，为人类健康事业提供 有力支持。
工业
利用基因工程生产各种酶、蛋白质和 有机酸等生物制品，促进工业生产技 术的发展。
基因表达调控应用
通过对基因表达的调控，可以实 现对生物体的遗传特性和表型特 征的精细调控，为生物工程和医 学研究提供重要的理论基础和技 术手段。
基因敲除与编辑
01 02
基因敲除与编辑定义
基因敲除是指通过同源重组技术将外源致死基因或特定基因敲除或灭活 的遗传工程技术；基因编辑则是指通过修改生物体的基因组，实现对特 定基因进行敲除、插入或突变的遗传工程技术。
大学《基因工程学》教学大纲
《基因工程学》课程教学大纲（Genetic Engineering）一、课程说明课程编码：02200200课程总学时（理论总学时/实践总学时）：48（48/0）周学时（理论学时/实践学时）：4（4/0）学分：31．课程性质：专业必修课。
2．适用专业与学时分配：适用生物技术专业。
教学内容与学时分配3．课程教学目的与要求：本课程的授课对象是生物技术专业的本科生。
课程简介：《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程。
其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。
基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。
它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
课程目标：设置本课程是为了让生物技术专业的学生理解和掌握基因工程的技术原理，通过本课程学习，掌握基因操作的工具酶，基因克隆常用载体，目的基因的分离与合成，重组体的构建，重组体向宿主细胞的导入，重组体克隆的筛选与鉴定以及克隆基因的表达，同时了解基因工程在生物学领域中的应用与发展前景。
对学生达到毕业要求贡献如下：1）了解基因工程学的历史、发展和前沿知识。
2）掌握基因工程学的基础理论、基本知识和基本技能；教学要求：学完基因工程学后，学生将具备以下能力：1）具有良好的自学能力；2）综合运用所掌握的基因工程学理论知识和技能、从事生物科学及其相关领域科学研究的能力。
4．本门课程与其它课程关系：先修课程为生物化学、微生物学、分子生物学、细胞学等，具备基础理论知识及实验能力是基因工程学课程的基础。
基因工程的基本内容优秀课件
特点：特异性。
即一种限制性内切酶只能识别一种特定 的脱氧核苷酸序列，并且能在特定的切点上 切割DNA分子。
基因工程的基本内容优秀课件
（二）基因操作的工具
• 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶） 大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别
2）用同一种限制酶切断目的基因，使其 产生相同的黏性末端。
3）将切下的目的基因片段插入质粒的切 口处，再加入适量DNA连接酶，形成 了一个重组DNA分子（重组质粒）
目的基因与运载体的结合过程，实际 上是不同来源的基因重组的过程。
基因工程的基本内容优秀课件
• 步骤二：目的基因与运载体结合
基因工程的基本内容优秀课件
1）反转录法：
目的基因的mRNA
以目的基因转录成的信 使RNA为模板，反转录 成互补的单链DNA，然 后在酶的作用下合成双 链DNA，从而获得所需 的基因。
反转录
单链DNA(cDNA)
合成
双链DNA (即目的基因)
基因工程的基本内容优秀课件
3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
根据已知蛋白质的氨 蛋白质的氨基酸序列
基因工程的基本内容优秀课件
（二）基因操作的工具
• 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？ 关键步骤一的工具：基因的剪刀——限制性内切酶 关键步骤二的工具：基因的针线——DNA连接酶 关键步骤三的工具：基因的运载工具——运载体
基因工程的基本内容优秀课件
（二）基因操作的工具
• 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）
2）植物细胞： 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管
基因工程课件
05
基因工程的伦理与法规问题
伦理问题
人类基因组编辑
尽管有可能治愈某些遗传疾病，但人类基 因组的编辑可能会带来不可逆转的后果，
对人类基因库产生长远影响。
A 基因歧视
基因工程可能导致基于基因信息的 歧视，特别是在就业、保险、教育
等领域。
B
C
D
生物安全与生物武器
基因工程可能产生具有高度传染性和杀伤 力的生物武器，对人类安全构成威胁。
法规执行困难
由于基因工程技术的复杂性和专 业性，法规的执行可能面临挑战 ，例如如何界定和处罚违规行为 。
跨国公司的监管
跨国公司在不同国家开展业务时 可能面临复杂的法律和监管环境 ，这可能对公司的运营和投资决 策产生影响。
06
未来展望与挑战
技术创新与发展趋势
基因编辑技术的优化
随着基因编辑技术的发展，未来有望实现更为精确和高效 的基因编辑，为基因治疗、生物育种等领域提供更多可能 性。
基因隔离
基因工程可能会加剧社会不平等，导致基 因“精英”与大多数人的隔离。
法规问题
缺乏全球统一的法规 目前尚无全球统一的基因工程法 规，各国对基因工程的监管存在 差异，这可能导致不公平竞争和 市场混乱。
公众参与和透明度 公众对基因工程的了解和参与程 度可能影响法规的制定和执行， 同时保证透明度也有助于维护公 众信任。
DNA上的特定位点并与之结 合，从而调节转录的效率和
时间。
表观遗传学
表观遗传学研究的是在不改 变DNA序列的情况下，通过 调节基因表达来实现遗传性 状的改变。这包括DNA甲基 化、组蛋白修饰和微RNA等 机制。
基因克隆与鉴定
克隆化
基因克隆是将目的基因插入到载体中并导入 到宿主细胞中，使目的基因在宿主细胞中复 制、扩增和表达的过程。
基因工程精选全文完整版
– 可直接表达不含任何原核序列的外源 蛋白（原核表达载体）
– 以融合蛋白的形式进行表达（原核基 因融合表达载体）
表达载体
真核表达载体含有：
– 原核基因序列 – 真核转录单位
真核表达载体：有两类
– 不带病毒复制子 – 带病毒复制子
质粒（plasmid）
存在于细菌等细胞质中 双链环状DNA分子 大约 1-200 Kb 具有自主复制和转录能力 不能独立存活 在子细胞中保持恒定的拷贝数 并表达其遗传信息
质粒（plasmid）
在细胞内的复制分两种类型
严密控制型
松弛控制型
(stringent control) (relaxed control)
基因工程操作流程
基因重组示意图
基因工程上游技术基本过程
选择载体 获得目的基因 目的基因与载体的重组 重组载体的转化 重组子的筛选与鉴定
载体（vector）
质粒（plasmid） 噬菌体（phage） 病毒（virus）
载体的条件
分子小（ 10 Kb） 有限制酶酶切位点 可自主复制 有足够的copy数 带筛选的标志
法将允许克隆人体器官
法国总理若斯潘（2000年9月28日） 表示：
– 法国政府将允许对人体器官克隆技术 进行用于医疗目的的研究
基因工程技术
上游技术（upstream）
– 重组子的构建 – 工程菌的构建及高效表达
下游技术（downstream）
– 工程菌大规模发酵最佳参数的确定 – 新型生物反应器的研制 – 高效分离介质及装置的开发 – 分离纯化的优化控制 – 生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造 – 超滤、反渗透技术的应用
遗传学名词解释(答案)
名词解释第一章绪论遗传学：是研究生物遗传和变异的科学，是生物学中一门十分重要的理论科学，直接探索生命起源和进化的机理。
同时它又是一门紧密联系生产实际的基础科学，是指导植物、动物和微生物育种工作的理论基础；并与医学和人民保健等方面有着密切的关系。
遗传：是指亲代与子代相似的现象。
如种瓜得瓜、种豆得豆。
变异：是指亲代与子代之间、子代个体之间存在着不同程度差异的现象。
如高秆植物品种可能产生矮杆植株，一卵双生的兄弟也不可能完全一样。
第二章遗传的细胞学基础染色质：是指染色体在细胞分裂的间期所表现的形态，呈纤细的丝状结构，含有许多基因的自主复制核酸分子。
染色体：在细胞分裂时期，在细胞核中容易被碱性染料染色、具有一定数目和形态结构的的杆状体。
（染色体：指任何一种基因或遗传信息的特定线性序列的连锁结构。
）染色单体：由染色体复制后并彼此靠在一起，由一个着丝点连接在一起的姐妹染色单体。
姐妹染色单体：二价体中的同一各染色体的两个染色单体，互称姐妹染色单体，它们是间期同一染色体复制所得。
非姐妹染色单体：单体二价体的不同染色体之间的染色单体互称非姐妹染色单体，它们是同源染色体这些间期各自复制所得。
联会：减数分裂中，同源染色体的配对过程。
同源染色体：大小，形态和结构相同，功能相似的一对染色体。
非同源染色体：形态和结构不同的各对染色体互称为非同源染色体。
有丝分裂：包含两个紧密相连的过程：核分裂和质分裂。
即细胞分裂为二，各含有一个核。
分裂过程包括四个时期：前期、中期、后期、末期。
在分裂过程中经过染色体有规律的和准确的分裂，而且在分裂中有纺锤丝的出现，故称有丝分裂。
减数分裂：又称成熟分裂，是在性母细胞成熟时，配子形成过程中所发生的一种特殊的有丝分裂。
它使体细胞染色体数目减半。
它含两次分裂，第一次是减数的，第二次是等数的。
双受精：授粉后，一个精核（n）与卵细胞（n）受精结合为合子（2n），将来发育成胚。
同时另一精核（n）与两个极核（n＋n）受精结合为胚乳核（3n），将来发育成胚乳。
基因工程课件
节能减排：利用 基因工程技术， 培育出能够高效 利用能源、减少 废气排放的微生 物，促进节能减 排。
保护生物多样性： 通过基因工程手 段，保护濒危物 种，维护生物多 样性，促进生态 系统的稳定和可 持续发展。
04
基因工程的安全性与伦 理问题
基因工程的安全性问题
基因治疗中可能出现的免疫 排斥反应
基因编辑技术可能带来的脱 靶效应
生物仿制药的研发与市场前景
农业改良
提高农作物的产量和品质 培育抗病、抗虫、抗旱等新品种 实现精准农业和智能化农业 促进农业可持续发展
生态环保
减少农药使用： 通过基因工程培 育抗病、抗虫的 农作物，减少农 药的使用，降低 对环境和人体的 危害。
治理污染：通过 基因工程技术， 将污染物降解的 酶基因导入微生 物中，实现对污 染物的生物降解 和治理。
基因工程是一种基于分子遗传学的技术 通过改变生物体的遗传物质来实现对生物性状的改良 基因工程的基本操作步骤包括基因克隆、基因表达和基因编辑 基因工程在医学、农业、工业等领域有着广泛的应用
基因工程的发展历程
基因工程的起源
基因工程的发展阶段
基因工程的应用领域
基因工程的前景展望
基因工程的应用领域
疾病治疗
基因治疗：通 过改变或修复 基因来治疗疾
病的方法
基因药物：利 用基因工程技 术生产能够治 疗疾病的蛋白
质药物
基因检测：通 过检测基因变 异来预测疾病 风险和指导治
疗
基因疫苗：利 用基因工程技 术生产的疫苗
来预防疾病
生物制药
基因工程在生物制药中的应用
重组蛋白药物的生产
基因治疗和细胞治疗的发展
违反法规的后果 与处罚措施
05
第九章 基因克隆载体
接合型质粒（传递性质粒） 非接合型质粒
严密型质粒（stringent plasmid)
严密型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒，复制与 宿主菌密切相关，宿主菌内只有1-2个质粒拷贝存在，当宿主 菌蛋白合成停止时，质粒的DNA复制也就随之停止
松弛型质粒 (relaxed plasmid)
第九章 基因克隆载体
第一节
概述
1、载体
要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中， 需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫
载体（Vector）。
（1）质粒 （2）噬菌体 （3）质粒-噬菌体杂合载体 （4）人工染色体载体
2、载体的性质
1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达的能 力。
pJDB 219
选用哪种类型的真菌质粒？
转化频率 YEps：103—105 YIps：1-10 转化子的稳定性 YEps：不稳定 YIps：稳定
第三节 噬菌体载体
噬菌体的研究历史，是同 分子生物学、分子遗传学的创 立和发展过程密切相关的。DNA 复制机理的阐明、转录的终止 作用、连接酶和解旋酶的发现 、位点特异的重组作用、SOS修 复机制等，均是以噬菌体为材 料取得的重要研究成果。依据 噬菌体的复制和生活周期等特 点，已经构建了许多料。
•7
三、质粒在基因工程中的应用优点 ①体积小，便于DNA的分离和操作； ②呈环状，使其化学分离过程中能保持性能稳定； ③有不受核基因组控制的独立复制起始点； ④拷贝数多，使外源DNA 可很快扩增； ⑤存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克
隆的检出和选择（如E.coli 的pBR322质粒）。
四、质粒的分离与鉴定 分离：细胞的裂解、蛋白质和RNA去除以及质粒 DNA与染色体DNA分离。 鉴定：电镜、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳及密 度梯度离心法。
基因工程基础知识复习归纳
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体〔供体〕的基因与载体在体外进展拼接重组，然后转入另一种生物体〔受体/宿主〕内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的开展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆〔Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程〞、“DNA重组〞为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因〔供体〕：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子〔克隆载体、表达载体〕。
宿主〔受体〕：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞〔组织、器官或个体〕。
4.基因工程的根本步骤〔切、接、转、增、检〔大肠杆菌是中心角色〕〔1〕目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，别离出带有目的基因的DNA片断。
〔2〕重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记〔抗菌素抗性〕的载体分子上。
〔3〕重组体的转化：将重组体〔载体〕转入适当的受体细胞中。
〔4〕克隆鉴定：摘要转化成功的细胞克隆〔含有目的基因〕。
〔5〕目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
湖南农大《基因工程》复习资料
，其主要来源途径有：化学合成，酶促合成 cDNA ，制备的基
因组 DNA 及
技术扩增等。
α-互补进行转化子的蓝白筛选，在培养体系中加入
作为基因表达的诱导物，加入
作为显色底物。
pBR322 质粒上具有 Ampr 基因和 Tetr 基因。若某外源基因插入 Ampr 基因内，重组质粒具有
抗
生素抗性表型；某外源基因插入 Tetr 基因内，重组质粒具有
传给下一代。
克隆 (名词，Clones)：从同一个亲代细胞形成的一组细胞。
克隆（动词，Cloning）：形成大量子细胞的无性繁殖过程，这些子细胞和亲代细胞完全相同，这个过程称
为克隆。
基因：是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的 DNA 片段。
2.填空题
基因工程的三大要素为 供体
、 受体
和载体 。
基因工程是
结构要素：分别是端粒，
和
。
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λ噬菌体 DNA 可以自然形成环状，其原因是在λ噬菌体的线性分子的两端各有一个长度为
个碱基
的天然粘性末端，这种粘性末端可以自然成环，成环后的粘性末端就叫做
。
Cosmid 的复制子来源于
，cos 序列来源于
简述 PCR 技术的主要应用领域。
Muller 的 PCR 反应同大肠杆菌体内的 DNA 复制有哪些不同?
说明双脱氧末端终止法测定 DNA 一级结构的原理与方法。
琼脂糖凝胶电泳能检测 DNA 分子的哪些特性，其基本原理与影响因素是什么?
说明下列物质在核酸提取纯化中的作用，并说明从生物材料中分离 DNA 和 RNA 的简要方法。
接、转、筛、表。（1）从复杂的生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的 DNA 片段。（简称“分”）
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重组技术 重组技术又称为基因工程（ ）或分子克隆( )。
基因工程的操作过程主要由以下步骤组成： ①载体和目的基因的分离； ②载体和目的基因的切断； ③载体和目的基因的重组； ④重组的转化和扩增； ⑤重组的筛选和鉴定。
一、载体和目的基因的分离
为了进行基因重组，首先需要对载体和目 的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。
三、载体和目的基因的重组
即将带有切口的载体与所获得的目 的基因连接起来，得到重新组合后的 分子。
（一）粘性末端连接法：当载体和目 的基因均用同一种限制酶进行切断时， 二者即可带有相同的粘性末端。如将 载体与目的基因混合在一起，二者即 可通过粘性末端进行互补粘合，再加 入连接酶，即可封闭其缺口，得到重 组体。 较少的情况下，对产生的平 端也可直接进行连接。
2．人工合成：
根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传 密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。 适应于断后，与载体 重组，再全部转化宿成，然后转化宿主细胞，得到含全 部表达基因的种群，称为( )。 具有组织细胞特异性。
二、载体和目的基因的切断
通常采用限制性核酸内切酶( )，简称 限制酶，分别对载体和目的基因进行 切断，以便于重组。限制酶目前已经 发现400多种，所识别的顺序往往为48个碱基对，且有回文结构。 由限制 酶切断后的末端可形成平端、3'-突出 粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。 形成粘性末端( )者较有利于载体和目 的基因的重组。
转基因植物获得新的性状
得
把
到 巨 大 型
大 鼠 生
的
长
转
因
基
子
因
转
小
入
鼠
小
。
鼠
用噬 菌体 构建 重组 分子
用 质 粒 构 建 重 组 分 子
基因重组( )是指片段在细胞内、细胞间， 甚至在不同物种之间进行交换，交换后 的片段仍然具有复制和表达的功能。
基因工程( ）是指采用人工方法将不同 来源的进行重组，并将重组后的引入宿 主细胞中进行增殖或表达的过程。
获得带目的基因的细菌后，可将其 不断进行增殖，从而得到大量的目的基 因片段用于分析研究。如在目的基因的 上游带有启动子顺序，则目的基因还可 转录表达合成蛋白质。
五、转基因技术
1982年等人首次将大白鼠的生长激素 基因放在质粒中小白鼠金属巯基蛋白 启动子之后。
这个启动子通常在染色体上，控制金 属巯基蛋白的转录。
（二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接 法。当载体和目的基因无法采用同一种 限制酶进行切断，无法得到相同得粘性 末端时，可采用此方法。 此法首先使用 单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端 核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核 苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如 载体上添加一段，则可在目的基因上添 加一段，故二者即可通过碱基互补进行 粘合，再由连接酶连接。
的322，该质粒分子大小为4.3，带有抗 四环素和抗氨苄青霉素基因，含Ⅰ，Ⅰ， Ⅲ等单一的限制酶切点。
3．病毒： 常用的为40，通过感染方式 将其送入哺乳动物细胞中进行增殖。目 前应用相对较少。
（二）目的基因：
目的基因的筛选和分离可采用以下方法进 行：
1．直接从染色体中分离：仅适用于原核 生物基因的分离，较少采用。
（一）载体：基因工程中常用的载体()主 要包括质粒()、噬菌体()和病毒()三大类。 这些载体均需经人工构建，除去致病基因， 并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选 的标志基因、单一的限制酶切点等。
1．质粒： 是存在于天然细菌体内的一 种独立于细菌染色体之外的双链环状，
具有独立复制的能力，通常带有细菌的 抗药基因。 最早使用的质粒是人工构建
（三）人工接头连接法： 将人工连接器 （即一段含有多种限制酶切点的片段） 连接到载体和目的基因上，即有可能使 用同一种限制酶对载体和目的基因进行 切断，得到可以互补的粘性末端。
四、重组的转化和扩增
重组需导入宿主细胞才能进行增殖或表 达。重组质粒可通过转化（）方式导入 宿主细胞，即将大肠杆菌用2处理，增加 细菌细胞壁的通透性，再与重组质粒短 暂温育，质粒即可导入宿主细胞。
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五、重组的筛选和鉴定
由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低， 因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛 选并作鉴定。可采用以下方法进行：
（一）根据重组体的表型进行筛选： 对于 带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入 灭活法进行筛选。如322中带有抗氨苄青霉 素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗 四环素基因后，就可引起该基因失活，细 菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。 在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而 在含四环素的培养基上不能生长的细菌即 为带重组体的细菌。
如果是用λ噬菌体作为载体的重组体，则需要 用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能 力的噬菌体，再通过转染()方式将重组噬菌 体导入大肠杆菌等宿主细胞。 重组导入宿主
细胞后，即可在适当的培养条件下进行培养 以扩增宿主细胞。对于质粒，还可通过在培 养基中加入氯霉素，抑制细菌蛋白质合成及 染色体的复制，以单独扩增细胞中的质粒。
（二）根据标志互补进行筛选： 当宿主 细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷 时，可采用此方法筛选重组体。即在载 体分子中插入相应的缺陷基因，如宿主 细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则 说明该细胞中带有重组体。
（三）根据限制酶谱进行分析： 经过粗 筛后的含重组体的细菌，还需进行限制 酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行 扩增后分别提取其，用重组时所用的同 一限制酶进行酶切，再将其与不含目的 基因的载体一起进行电泳比较分析，如 发现出现目的基因片段的电泳带即证明 重组体中带有目的基因。
将重组好的这种质粒（几百个拷贝） 用特制的微量注射器注入小鼠受精卵 的雄性原细胞核（ ）中，再将这个 受精卵植入小鼠子宫中。
结果发育生成的小鼠中经杂交 证明许多小鼠中都含有大白鼠 的生长激素基因。而且成熟的 小鼠体重比对照大两倍，成为 “硕鼠”或“超级鼠”。这个 实验首次证明，外源基因在新 的启动子控制下可以整合到哺 乳类细胞核内，并在其中实现 有效地表达。转基因技术中有 关外源基因与染色体的定位重 组，表达调控等还有待深入研 究。