第九章基因工程

三、载体和目的基因的重组
即将带有切口的载体与所获得的目 的基因连接起来，得到重新组合后的 分子。
（一）粘性末端连接法：当载体和目 的基因均用同一种限制酶进行切断时， 二者即可带有相同的粘性末端。如将 载体与目的基因混合在一起，二者即 可通过粘性末端进行互补粘合，再加 入连接酶，即可封闭其缺口，得到重 组体。 较少的情况下，对产生的平 端也可直接进行连接。
五、重组的筛选和鉴定
由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低， 因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛 选并作鉴定。可采用以下方法进行：
（一）根据重组体的表型进行筛选： 对于 带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入 灭活法进行筛选。如322中带有抗氨苄青霉 素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗 四环素基因后，就可引起该基因失活，细 菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。 在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而 在含四环素的培养基上不能生长的细菌即 为带重组体的细菌。
2．人工合成：
根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传 密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。 适应于编码小分子多肽的基因。
4．从基因文库中筛选： 将某一种基 因用适当的限制酶切断后，与载体 重组，再全部转化宿主细胞，得到 含全部基因组的种群，称为G文库 ( )。 将某种细胞的全部通过逆转合 成，然后转化宿主细胞，得到含全 部表达基因的种群，称为文库( )。 文库具有组织细胞特异性。
重组技术 重组技术又称为基因工程（ ）或分子克隆( )。
基因工程的操作过程主要由以下步骤组成： ①载体和目的基因的分离； ②载体和目的基因的切断； ③载体和目的基因的重组； ④重组的转化和扩增； ⑤重组的筛选和鉴定。
一、载体和目的基因的分离
为了进行基因重组，首先需要对载体和目 的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。
如果是用λ噬菌体作为载体的重组体，则需要 用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能 力的噬菌体，再通过转染()方式将重组噬菌 体导入大肠杆菌等宿主细胞。 重组导入宿主
细胞后，即可在适当的培养条件下进行培养 以扩增宿主细胞。对于质粒，还可通过在培 养基中加入氯霉素，抑制细菌蛋白质合成及 染色体的复制，以单独扩增细胞中的质粒。
二、载体和目的基因的切断
通常采用限制性核酸内切酶( )，简称 限制酶，分别对载体和目的基因进行 切断，以便于重组。限制酶目前已经 发现400多种，所识别的顺序往往为48个碱基对，且有回文结构。 由限制 酶切断后的末端可形成平端、3'-突出 粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。 形成粘性末端( )者较有利于载体和目 的基因的重组。
将重组好的这种质粒（几百个拷贝） 用特制的微量注射器注入小鼠受精卵 的雄性原细胞核（ ）中，再将这个 受精卵植入小鼠子宫中。
结果发育生成的小鼠中经杂交 证明许多小鼠中都含有大白鼠 的生长激素基因。而且成熟的 小鼠体重比对照大两倍，成为 “硕鼠”或“超级鼠”。这个 实验首次证明，外源基因在新 的启动子控制下可以整合到哺 乳类细胞核内，并在其中实现 有效地表达。转基因技术中有 关外源基因与染色体的定位重 组，表达调控等还有待深入研 究。
（二）根据标志互补进行筛选： 当宿主 细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷 时，可采用此方法筛选重组体。即在载 体分子中插入相应的缺陷基因，如宿主 细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则 说明该细胞中带有重组体。
（三）根据限制酶谱进行分析： 经过粗 筛后的含重组体的细菌，还需进行限制 酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行 扩增后分别提取其，用重组时所用的同 一限制酶进行酶切，再将其与不含目的 基因的载体一起进行电泳比较分析，如 发现出现目的基因片段的电泳带即证明 重组体中带有目的基因。
的322，该质粒分子大小为4.3，带有抗 四环素和抗氨苄青霉素基因，含Ⅰ，Ⅰ， Ⅲ等单一的限制酶切点。
3．病毒： 常用的为40，通过感染方式 将其送入哺乳动物细胞中进行增殖。目 前应用相对较少。
（二）目的基因：
目的基因的筛选和分离可采用以下方法进 行：
1．直接从染色体中分离：仅适用于原核 生物基因的分离，较少采用。
（二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接 法。当载体和目的基因无法采用同一种 限制酶进行切断，无法得到相同得粘性 末端时，可采用此方法。 此法首先使用 单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端 核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核 苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如 载体上添加一段，则可在目的基因上添 加一段，故二者即可通过碱基互补进行 粘合，再由连接酶连接。
转基因植物获得新的性状
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用噬 菌体 构建 重组 分子
用 质 粒 构 建 重 组 分 子
基因重组( )是指片段在细胞内、细胞间， 甚至在不同物种之间进行交换，交换后 的片段仍然具有复制和表达的功能。
基因工程( ）是指采用人工方法将不同 来源的进行重组，并将重组后的引入宿 主细胞中进行增殖或表达的过程。
（一）载体：基因工程中常用的载体()主 要包括质粒()、噬菌体()和病毒()三大类。 这些载体均需经人工构建，除去致病基因， 并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选 的标志基因、单一的限制酶切点等。
1．质粒： 是存在于天然细菌体内的一 种独立于细菌染色体之外的双链环状，
具有独立复制的能力，通常带有细菌的 抗药基因。 最早使用的质粒是人工构建
获得带目的基因的细菌后，可将其 不断进行增殖，从而得到大量的目的基 因片段用于分析研究。如在目的基因的 上游带有启动子顺序，则目的基因还可 转录表达合成蛋白质。
五、转基因技术
1982年等人首次将大白鼠的生长激素 基因放在质粒中小白鼠金属巯基蛋白 启动子之后。
这个启动子通常在染色体上，控制金 属巯基蛋白的转录。
（三）人工接头连接法： 将人工连接器 （即一段含有多种限制酶切点的片段） 连接到载体和目的基因上，即有可能使 用同一种限制酶对载体和目的基因进行 切断，得到可以互补的粘性末端。
四、重组的转化和扩增
重组需导入宿主细胞才能进行增殖或表 达。重组质粒可通过转化（）方式导入 宿主细胞，即将大肠杆菌用2处理，增加 细菌细胞壁的通透性，再与重组质粒短 暂温育，质粒即可导入宿主细胞。