双歧杆菌的分离培养及鉴定

厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。

双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH

8.0~8.5不生长。其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。

双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌都不会干扰厌氧条件。

目前，双歧杆菌鉴定的方法有很多种。近年来兴起的一种新的RAPD等分子生物学技术对双歧杆菌进行基因指纹图谱的构建，分析不同双歧杆菌种间存在的同源性和多态性；RAPD 技术也可用于双歧杆菌菌种鉴定及分型。一般来讲，我们都应用适合鉴定所有厌氧菌的方法，主要包括双歧杆菌特定酶的检测、乙酸、乳酸等有机酸的测定、糖发酵试验和其他相关指标等。

实验用具

高纯氮气厌氧管注射器培养箱冰块水浴锅镊子记号笔 MRS培养基细菌生化微量鉴定管酒精棉球瓷盘振荡器铜柱除氧系统定量加样器

恒温水浴载玻片显微镜恒温培养箱超声波破碎仪滤纸层析缸酒精灯封口膜厌氧罐等。

实验方法与步骤

1铜柱系统除氧

铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40～400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等都含有微量O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。

2预还原培养基及稀释液的制备

制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。

3分离

（1）编号

取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。

（2）稀释

在无菌条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。依此进行10倍系列稀释，至10-7，制成不同样品稀释液。通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管计数。

（3）滚管分离

1）滚管

将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0

.1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。

2）分离

生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。37℃培养。培养24h或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。