酶工程4-4离心分离

图4-1 3 种梯度形式示意图 (a) 线性梯度; (b) 凸形梯度; (c) 凹形梯度。
配制时, 将稀溶液置于贮液室 B, 浓溶液置于混合室A , 两室 的液面必须在同一水平。 操作时, 首先开动搅拌器, 然后 同时打开阀门a 和b, 流出的梯 度液经过导管小心地收集在离 心管中。 也可以将浓溶液置于B, 稀溶液置于A 室, 但此时梯度 液的导液管必须直插到离心管 的管底, 让后来流入的浓度较 高的混合液将先流入的浓度较 低的混合液顶浮起来, 形成由 管口到管底逐步升高的密度梯 度。
•高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表
示，如：65000g。 两者可换算或查测算图。
计 算 近 似 的 列 线 图
RCF
2. 沉降系数:（sedimentation constant）
指单位离心力下颗粒的沉降速度
（sedimentation velocity）,用S表示。
由于许多生物大分子的S值很小，所以定 义10
图4-2 梯度混合器示意图 A-混合室; B- 贮液室; C-电磁搅拌器; ○-阀门。
离心操作


离心前：将样品小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液
的表面；
离心：不同大小不同形状、具有一定沉降系数差异的颗粒
在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带；
收集：通过虹吸、穿刺或切割离心管的方法将不同区带中
特点
介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。 适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。
注意事项
采用铯盐作为离心介质时, 它们对铝合金的转子有很强的 腐蚀作用, 要防止铯盐溶液溅到转子上, 使用后要将转子仔细清 洗和干燥, 有条件的最好采用钛合金转子。
等密度梯度离心示意图 （a）离心前； （b）离心后
第四节 离心分离
（一）基本原理
1. 离心力
Fc = m ac ＝ m r ω2 ＝ m r （2 n/60）2
n为离心机每分钟转数 （r/min ）；
Fc通常以相对离心力RCF（relative
centrifugal force）表示，即离心力F的大小相
当于地球引力（Fg , 重力常数g）的多少倍。
小 结
•等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的静
力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待 分离物的密度范围。
•差速离心是一种动力学方法，关键在于选择适合
于各分离物的离心力。
•密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关键
在于制备优质的密度梯度溶液。
（五）应用
根据不同离心目的，离心可分为
•制备性离心：


密度梯度混合器


密度梯度一般采用密度梯度混合器进行制备。
制备得到的密度度可以分为：
当贮液室与混合室的截面积相等时, 形成线性梯度;
1）线性梯度（常用）：
2）凸形梯度：
当贮液室的截面积大于混合室的截面积时, 形成凸形梯度;
3）凹形梯度： 而当贮液室的截面积小于混合室的截面积时, 则形成凹形 梯度。
分离纯化和制备
•分析性离心：
测分子量、沉降系数、密度、纯度
r1, r2 —— 分别为旋转轴中心到样品液液面和离心管底的距离(cm )
令 K = (lnr2 - lnr1)/ω2 = St
• K为转子的效率因子，与转子的半径和转速有关。 • 厂家在转子出厂时给出了最大转速时的K 值。 • 根据公式ω12K1 = ω22K2 计算出其他转速时的K 值。 选定离心机和转子后, r1 、r2 已确定；对某一具体的颗粒，其沉降系 数S 也是定值；故ω2t 为一常数。 离心时对颗粒的沉降起决定作用的是转子的转速ω和沉降时间t。
2. 温度
离心温度一般控制在4℃左右, 对于某些耐热性较 好的酶, 也可以在室温条件下进行离心分离。但是在超 速离心和高速离心时, 由于转子高速旋转会发热而引起 温度升高, 必须采用冷冻系统, 使温度维持在一定范围 内。
3. pH值
离心介质的pH 值必须是处于酶稳定的pH 值范围 内, 必要时可以采用缓冲溶液。过高或过低的p H 值可 能引起酶的变性失活, 还可能引起转子和离心机其他部 件腐蚀。
颗粒的密度。 •适宜分离密度相近而大小不同的固相 物质。
密度梯度离心示意图
（a）离心前
（b）离心后
Density gradient ultracentrifugation
蔗糖梯度
刺破管底分部收集
3. 等密度梯度离心
又称沉降平衡离心 （sedimentation
equilibrium centrifugation）。

角式及外摆式：外摆式一般为低速，

角式由低速到超速均有。
角式离心机和离心头（转子）

角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作 注意稳、盖、旋紧。
离心管
材质：玻璃，塑 料 强度：和离心速 度相配 大小：和转子配 套 高速超速管要加 盖

离心机操作

平衡、定温、定速、定时。
（四）常用离心方法
2）壁效应严重。 3）沉降的颗粒受到挤压。
差速离心分离示意图
（a）离心前的悬浮液 （b）～（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况
2．密度梯度离心
（density gradient centrifugation） 样品在密度梯度介质中进行离心，使沉 降系数比较接近的组分得以分离的一种区带 分离方法。
常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。
高速离 1~2.5 104 1104 沉淀、细胞、细胞器的分离; ~1105 g 冷冻（防止温度升高）, 心机 离心管的精确平衡 5105 g DNA,RNA,蛋白质,细胞器,病毒分离; 超速离 (2.5 ~ 12)104 心机 冷冻＋真空系统（减少空气阻力和
摩擦）， 离心管的精确平衡
离心的形式
等密度梯度离心——离心时间是指颗粒完全达到等密度点的 平衡时间, 称为平衡时间。


沉降时间
沉降时间：指颗粒从样品液面完全沉降到离心管底所需 的时间。它决定于颗粒的沉降速度和沉降距离。
T —— 沉降时间(s) S —— 颗粒的沉降系数(s) ω—— 转子角速度(rad/s)
t = (lnr2 - lnr1) / Sω2
的颗粒分开收集, 得到所需的物质。
注意事项： 在密度梯度离心过程中, 区带的位置和宽度随离心时 间的不同而改变。若离心时间过长由于颗粒的扩散作用, 会使区带越来越宽。为此, 适当增大离心力、缩短离心时 间, 可以减少由于扩散而导致的区带扩宽现象。
密度梯度离心特点：
•区带内的液相介质密度小于样品物质
（三）离心机的种类
按离心机转速的不同，分为： 常速（低速）离心 高速离心 超速离心
差速离心 密度梯度离心 等密梯度离心
离心机的种类
最大转速 (r/min) 低速离 8000 心机 名称 最大 RCF 104 g 注意事项 细胞、细胞碎片、培养基残渣等固 形物的分离; 常温，注意样品热变性和离心管平 衡
13 s
为一个沉降单位，1S = 11013 s。
常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚 细胞器的大小，如16S RNA，蛋白质的沉降系 数一般在1 ~ 200之间。
（二）离心条件



1. 离心时间
（依据离心方法的不同而有所差别）
常速离心、高速离心和差速离心——离心时间是指颗粒从离 心管中样品液的液面完全沉降到离心管底的时间, 称为沉降 时间或澄清时间; 密度梯度离心——离心时间是指形成界限分明的区带的时间, 称为区带形成时间;
根据颗粒的密度不同而进行分离。
离心时，在离心介质的密度梯度范围内，
不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂
浮，一直移动到与它们各自的浮力密度恰好
相等的位置(等密度点)，形成区带。
离心介质
常用铯盐, 如氯化铯( CsCl)、溴化铯( CsBr) 、硫酸铯 ( Cs2 S O4) 等。有时也用三碘苯的衍生物作为离心介质。
沉降速度离心和沉降平衡离心的特点
密度梯度离心 梯度介质 通常用蔗糖 最大的梯度密度<最小密度 的沉降样品 等密度梯度离心 通常用CsCl 最大的梯度密度>密度最大 的沉降样品
离心条件 在最前的沉降物质达到管底 使各组分沉降到其平衡的 前停止，短时间，低速度 密度区，长时间，高速度 分离依据 密度相近，但沉降系数不同 沉降系数相近，但密度不 同
一般用g（或数字g）表示。
RCF= Fc / Fg = m r (2 n/60)2 /mg= 1.12 10-5 n2 r 即：
离心力的大小与转速的平方( n2 ) 以及旋转半 径(r) 成正比。 其中，旋转半径用r平均代替
r平均=1/2（r大+r小）cm
通常：
•低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。
差速离心法
沉降速度法 密度梯度离心 沉降平衡法 等密度梯度离心
1．差速离心 （differential
centrifugation）
采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速
度不同的颗粒分批分离的方法。
特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。
优点：操作简单 。
缺点：1）分离效果较差， 不能一次得到纯颗粒。
梯度介质

定义：为了使沉降系数比较接近的颗粒得以分 离, 必须配制好适宜的密度梯度系统。密度梯 度系统是在溶剂中加入一定的溶质制成的。这 种溶质称为梯度介质。
性质：应具有足够大的溶解度, 以形成所需的 密度梯度范围; 不会与样品中的组分发生反应; 也不会引起样品中组分的凝集、变性或失活。 成分：有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密 度梯度系统, 其适用范围是: 蔗糖浓度5 % ～ 60 % , 密度范围1.02～1.30 g/cm2 。