感受态细胞制备的几种方法
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1. 感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(compete nee)。
作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一一种短暂的感受态以摄取外源DNA感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。
常用制备方法：细菌感受态少量制备法(CaCb法)、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2. 感受态细胞做得不好的原因一.菌液0D直偏大或偏小二.原始菌株不好三.试剂超纯程度不够四．操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度, 尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600 来控制.DH5 a菌株OD600为时细胞密度是5X 107/ml ）;2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2 处理的细胞, 在低温条件下, 一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24 小时达到最高, 之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4. 化合物及无机离子的影响：在Ca2啲基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；5. 所使用的器皿必须干净. 迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6. 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7. 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；4.为何要低温环境制备在制备过程中, 细胞膜通透性增大而变得脆弱, 低温能提高感受态细胞存活率. 所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20 C保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。
电转感受态细胞的制备
电转感受态细胞的制备电转感受态细胞 (Electroporated sensitized cells) 是指通过电穿孔技术将外源 DNA 或 RNA 导入细胞内的一种技术。
该技术广泛应用于基因治疗、疫苗研究、基因编辑等领域。
本文将介绍电转感受态细胞的制备方法、原理以及注意事项。
下面是本店铺为大家精心编写的5篇《电转感受态细胞的制备》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《电转感受态细胞的制备》篇1一、电转感受态细胞的制备方法电转感受态细胞的制备方法主要包括以下步骤:1. 细胞培养：将细胞接种到培养皿中，并在适当的条件下培养细胞，使细胞生长至对电穿孔敏感的阶段。
2. 制备电穿孔缓冲液：根据细胞类型和实验需要，选择适当的电穿孔缓冲液，将其制备好。
3. 处理细胞：将细胞与电穿孔缓冲液混合，并在一定条件下进行电穿孔处理。
4. 收集细胞：将处理后的细胞收集到离心管中，并进行离心。
5. 检测细胞：通过荧光显微镜或 Western blot 等方法，检测细胞内是否成功导入外源 DNA 或 RNA。
二、电转感受态细胞的原理电转感受态细胞的原理是利用高电压电流产生的电场，使细胞膜通透性增加，从而使外源 DNA 或 RNA 通过细胞膜进入细胞内。
电穿孔过程中，细胞膜上的脂质分子重新排列，形成一个暂时的孔道，外源 DNA 或 RNA 通过这个孔道进入细胞内。
三、注意事项在进行电转感受态细胞制备时，需要注意以下几点:1. 细胞选择：不同类型的细胞对电穿孔的敏感性不同，因此需要根据实验需要选择适当的细胞类型。
2. 电穿孔缓冲液：电穿孔缓冲液的组成和浓度对电转感受态细胞的制备非常重要，需要根据实验需要进行优化。
3. 处理条件：电穿孔处理的条件，如电压、电流、时间等，需要根据细胞类型和实验需要进行优化。
4. 检测方法：检测细胞内是否成功导入外源 DNA 或 RNA 的方法需要与实验目的相符，并进行严格的对照实验。
《电转感受态细胞的制备》篇2电转感受态细胞是一种常用于分子生物学和基因工程领域的实验技术，它可以将外源 DNA 或 RNA 转入细胞中，从而实现基因转移和表达。
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞的制备是一项非常重要的实验技术，可应用于许多研究领域，如分子生物学、农药毒理学、农业植物保护等。
一般来说，将培养细胞转化为感受态细胞，可以有三种方法：
1、皮下注射引起的感受态细胞制备。
由于它是一种经典的制备方法，大多数细胞都可以使用。
其核心步骤是将小量液体注入传感源头(如病毒、菌株、多糖、细菌等)皮下。
这种技术可以帮助人们制备特定种类的感受态细胞，并且可以控制病毒的感染率。
2、利用细胞克隆引起的感受态细胞制备。
这种方法涉及到使用不同种类的细菌或病毒及其克隆进行感染。
一旦细胞受感染，感受态细胞就会形成。
此外，通过诱变基因表达等方式，也可以制备出不同感受源的感受态细胞。
3、利用小分子引起的感受态细胞制备。
小分子技术中的最新研究主要集中在核酸抑制剂、蛋白质结合蛋白、信号转导调节剂等。
这些小分子可以直接结合到感受细胞的特定分子，从而影响其功能，抑制或促进感受细胞的形成。
以上是三种感受态细胞制备的方法，它们均可用于解析某一特定基因或基因产物在细胞功能中的作用。
此外，这些技术还可用于识别及检测特定感受源，并评价其对细胞株功能的影响程度。
另外，它们还可用于发现新型抗病毒剂，以提高植物抗病能力。
因此，感受态细胞的制备实验在诸多方面都具有重要的意义，值得继续探索。
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。
当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。
所以称这种现象为α-互补现象。
由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。
所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、准备工作1、缓冲液1×TSS的配制事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。
取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备1. CaCl2法1）从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时。
2）将培养物接种到200ml LB培养基中，37℃培养至OD约为0.3到0.5，然后置于冰浴中20分钟。
3）用预冷的30ml管收集菌体，4℃6000rpm 离心5分钟。
4）弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
5）用预冷的0.1M CaCl210ml重悬菌体，4℃6000rpm 离心5分钟；弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
6）重复步骤5）7）加入预冷的0.1MCaCl2 1ml/管，重悬菌体，置于4℃。
8）立即取100μl新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物。
9）转化结束后14小时左右观察转化平板，检测转化效率。
10）取出置于4℃的感受态细胞，加入等体积的－20℃预冷的0.1M CaCl2－甘油（由0.1MCaCl和甘油等体积混合后高压蒸汽灭菌而成），混匀后以150μl/管分装至－20℃预冷的无菌微量离心管中，立即置于－70℃保存。
2.细菌电转化感受态细胞的制备1）将新鲜的菌落或细菌菌种冻存物接种于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时，然后转接含400ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃振荡培养至OD600约为0.8，将细菌培养物置于冰浴20－60分钟。
2）用预冷的30ml离心管于4℃6000rpm离心5分钟。
收集菌体，弃上清。
3）用预冷的10％甘油（10％超纯甘油加90％去离子水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，4℃6000rpm离心5分钟，弃上清。
4）重复步骤3）两次，最后合并至1支30ml管中。
5）弃上清后，用1ml无菌、预冷的10％甘油轻轻重悬菌体，分装至无菌预冷的微量离心管中，每管20μl，保存于－70℃。
用该方法制备的细菌感受态细胞转化效率比CaCl2法高出100倍左右。
感受态细胞制备及各种感受态的特点
感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。
2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。
5。
注意:接种比例不得大于1:１0。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。
4、4℃５000g离心５分钟。
用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。
分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。
含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:称取0。
28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。
感受态细胞得特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。
感受态细胞得特征:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。
(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。
感受态细胞的制备
CaCl2法Ecoli DH5α感受态细胞的制备及转化试剂：LB液体培养基LB/Amp(100ug/ml) 固体培养皿/15%甘油。
灭菌0.1mol/l 氯化钙，去离子水，灭菌Ep管，灭菌0.1MCacl2步骤：1.取DH5α菌划线，过夜培养。
(划线方法：用100μL枪头在菌液中蘸一下，在平板上划S形，第二次从第一次一个角开始划，分一下，第三次从第二次划线一个角分一下，逐渐降低菌液浓度)。
2.用灭菌枪头挑圆形菌落于LB液体培养基中（试管中5ml），37℃，200rpm，振荡培养12h左右，直至对数生长期。
（小摇）3.将菌种接种在锥形瓶LB液体培养基中（1ml/100ml），37度200r/min,振荡培养2-3h,至OD600=0.4左右。
（可透过锥形瓶中菌液看报纸上的字，模糊可见即可）。
（大摇）4A.分装到2个50ml离心管中，4℃，3000g，离心10min（离心前，离心机4℃预冷），弃上清。
5A.加10ml 凉的0.1MCacl于离心管中，重悬细胞沉淀，冰上摇匀10min。
26A.4℃，3000g，离心10min,弃上清（从离心机取出时离心管尽量不要摇动）。
于离心管中，重悬细胞沉淀，冰上摇匀30min。
7A.加10ml 凉的0.1MCacl28A.4℃，3000g，离心10min,弃上清。
/15%甘油于50ml离心管中，轻9A.加入2ml（2ml/50ml初始菌液量）0.1MCacl2轻摇匀。
10A.分装，在每个灭过菌的Ep管中装50μL～200μL，-80℃保存。
4B. 在Ep管中加入1.5ml菌液（2管）冰上10分钟，0～4度4000r/min ,2min 弃上清。
5B. 加入0.1mol/l氯化钙0.6ml，缓和悬菌，冰上10 分钟，4000r/min 10min,弃上清。
6B.加入冰氯化钙0.2ml缓和悬菌，分四管，冰上待用（-20度保存）。
转化1. 具有抗生素抗性的质粒0.5～2μL放入100μL感受态细胞中，冰上30min.2. 42℃热激90s,不要摇动管，立即放在冰上，冰上1～2分钟。
感受态细胞制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
一、实验方法
1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于1mL LB 液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12-14h)；（或取用E.coli单菌菌液进行扩繁）
2、将该菌悬液以1:100转接于50ml LB液体培养基中，37℃，240-250rpm振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20 ～30min 测一次OD600 ，至OD600 为0.4-0.5时停止培养。
3、将菌液按1mL/管分装在1.5mL离心管，于冰浴中放置20min；
（由于冷冻离心机只可离心1.5mL离心管，所以提前分装）
4、4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液，加入等体积预冷的0.1MCaCl2溶液，小心重悬细胞，冰浴20-30分钟；
6、4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液，加入预冷的含有15%无菌甘油的0.1MCaCl2100μL（Ice-cold 100 mM CaCl2 + 15% sterile glycerol），即为感受态细胞悬液，液氮中速冻！冻存于-80℃。
二、实验材料与试剂
100 mM CaCl2 + 15% sterile glycerol混合液：
30%甘油：甘油与水以体积比3:7混合，高压蒸汽灭菌后备用；
LB液体培养基：1%胰蛋白胨+0.5%酵母浸出物+1%氯化钠，溶于超纯水，调PH至7.0，补超纯水至1L，高压蒸汽灭菌；
0.1 mol/ LCaCl2转化缓冲液：将1.11 g无水CaCl2溶于超纯水中,
加纯水定容至100 mL,用微孔滤膜(0.45μm孔径)过滤除菌备用
三、实验仪器
高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、冷冻离心机、微量加液器、微孔滤膜除菌器。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
3. 将菌液快速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4. 吸收1.5ml培养好菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5. 4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6. 弃去上清，加入1500 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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试验步骤
CaCl2感受态细胞制备试验步骤 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞试验步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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CaCl2感受态细胞制备试验步骤
1. 前夜接种受体菌（DH5 或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2 . 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上猛烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
热激法是利用冰凉CaCl2处理对数生长久细 胞, 能够诱导其产生短暂“感受态”, 易于摄取外源 DNA。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
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试验仪器
1 . 超净工作台 2 . 低温离心机 3 . 恒温摇床 4 . 恒温培养箱 5 . -70 ℃ 冰箱 6 . 制冰机 7 . 移液器 50ul 、200ul 、1000ul
悬浮；
7. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 8. 弃去上清，加入750 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
悬浮；
9. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 10. 加入20 l冰凉10%甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11. 马上使用或快速置于-70ºC超低温保留。
感受态细胞制备的方法
感受态细胞制备的方法
感受态细胞的制备方法有多种，其中一种常用的方法是通过转染的方式将特定的基因（例如感受器基因）导入目标细胞中，从而使得这些细胞能够表达特定的感受器或相关蛋白。
这种方法可以使用病毒载体、质粒转染等多种技术实现。
感受态细胞的制备主要有以下步骤：
1. 获取目标细胞：从人体组织或动物模型中获取需要制备感受态细胞的细胞。
2. 选择合适的载体：根据研究需要选择适合的载体，如病毒载体或质粒。
3. 构建转染载体：将目标基因插入到载体中，构建转染载体。
4. 转染目标细胞：将转染载体导入目标细胞中，使其表达特定的感受器或相关蛋白。
5. 筛选稳定表达细胞：通过特定的筛选方法，筛选出稳定表达目标基因的细胞。
6. 验证感受态细胞的功能：通过功能实验等方法验证感受态细胞的功能。
感受态细胞制备的方法可以提供研究人员一个有效的工具，用于研究特定感受器或相关蛋白在生物体内的功能和调控机制。
这些细胞可以用于药物筛选、疾病研究和基因治疗等领域，有助于深入了解感受机制，并为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和途径。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理
感受态细胞的制备原理是通过刺激细胞或组织，使其产生特定的感受态反应。
下面将介绍两种常见的制备感受态细胞的方法：
1. 免疫刺激法：免疫刺激是一种常见的制备感受态细胞的方法。
它通过注射外源性抗原或感兴趣的抗原到实验动物体内，刺激其免疫系统产生针对该抗原的免疫应答。
随后，从动物体内获得淋巴细胞或单个免疫细胞，并进行分离和培养。
在适当的刺激条件下，这些细胞会分化为感受态细胞，表达特定的受体和效应分子。
2. 细胞诱导法：细胞诱导法是一种将一种细胞类型转化为另一种感受态细胞的方法。
通过适当的生理或外部信号，诱导细胞发生转变，从而获得感受态细胞。
例如，通过改变细胞培养基的成分和配比，或添加特定的生长因子和信号分子，可以使一些细胞从一种特定状态转变为特定的感受态细胞。
而在实现这些方法时，需要注意实验条件的细节，确保刺激物的浓度和持续时间、培养基的组分和条件等都符合特定的要求。
此外，在实验过程中需要使用适当的实验技术和方法对细胞进行监测和鉴定，确保制备得到的是目标感受态细胞。
感受态细胞的制备及转化
感受态细胞的制备方法（BL21）1．菌种纯化。
①在LB平板上，用接种环挑取大肠杆菌BL21，在平板上分级划线，以能够出现单菌落为宜。
②将上述划线的平板倒置于恒温培养箱中37℃过夜培养。
2．菌体培养。
①取20 ml LB培养基至100 mL三角烧瓶中，塞上棉塞后高温高压灭菌，然后冷却至室温。
②在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到①中。
③ 37℃振荡（约120 rpm）培养。
④测定OD值，当OD值达到0.35～0.5时（培养约5小时）放置冰上停止培养（如果OD600值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率）。
3．感受态细胞的制备①取上述冰上菌液1 mL于1.5 mL ep管中（根据需要量确定Microtube数量）。
② 1,500×g（微型离心机约4,000 rpm）4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。
③在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution A，轻轻弹动ep使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。
④ 1,500×g 4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。
⑤在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution B，轻轻弹动ep管使沉淀悬浮，勿剧烈振荡。
⑥感受态细胞制作完成。
本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。
在-80℃保存时，可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后，不能再进行-80℃保存。
感受态细胞的DNA转化1．将-80℃保存的感受态细胞置于冰上融化10分钟。
2．向100 μl的感受态细胞中加入0.1 ng～10 ng（3 μl～10 μl，一般连接产物用10 μL，质粒用0.5 μL）的转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30分钟。
3．42℃水浴中放置45秒钟后，立即于冰中放置1～2分钟。
4．加入900 μL培养基。
5．37℃ 140-160 rpm振荡培养45 min。
6. 离心6000rpm，3min，弃上清，留约100 μL，混匀后涂平板。
感受态细胞制备-经验
感受态细胞的制备1．准备工作1、配制10％Glycerol 1L2、配制SOC培养基2L （no MgCl2）Tryptone 20g/LYeast extract 5g/LNaCl 0.5g/L混匀后加10ml 250mMKCl调pH值为7.0，将培养基分装至8个250ml的三角瓶中。
3、准备一饭盒0.5ml Ep管4、准备4个250ml离心管将1～4灭菌，1和3放入4℃冰箱预冷。
2．制备感受态细胞1、活化细胞将细胞从保藏菌中接出，在LA平板上划线，37℃培养12小时2、从平板上挑取单菌落，接入装有5ml SOC培养基的universal中，37℃摇床培养12小时（220rpm）3、按1：100的比例将菌液转接入4个250ml SOC培养基中。
37℃摇床培养（220rpm）4、当OD值达到0.7~0.8时，将菌液取出，用250ml的离心管离心，7000rpm，5min，4℃5、用去离子水清洗菌体。
在vortex上用残余的液体把沉淀打散，加入50ml～100ml的去离子水，在vortex上剧烈震荡，直至菌液均匀。
离心，条件同上。
6、重复步骤57、弃上清，用10％Glycerol清洗菌体，在vortex上用残余的液体把沉淀打散，加入50ml～100ml的10％Glycero，在vortex上剧烈震荡，直至菌液均匀。
离心，条件同上。
8、重复步骤7，2次9、测试。
取20μl菌液进行电转，要求无电火花，不是高电阻。
10、将菌液装入预冷的0.5ml Ep管中，每管20μl11、－70℃保存。
电转化：材料：。
感受态细胞的制备
一、电转化感受态细胞的制备1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。
（同时做培养基和枪头的空白对照）2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。
3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rp m，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。
4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm 离心10分钟。
5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm 离心10分钟。
6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。
7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。
8.弃上清，每个离心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1. 5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。
同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。
9. 次日观察转化子生长情况，并记录。
二、连接产物纯化1．将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂:10μl of ddH2O2μl of 3M NaAC（PH5.2）50μl of 无水乙醇轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上；2.4℃，top Speed 离心30分钟；3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；4.加入500μl70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；5.4℃，top Speed离心5分钟；6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味；7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用；三、电转化1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2.取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。
感受态细胞制备
感受态细胞制备感受态细胞是一种在生物学研究中经常使用的用来感知外部信号的细胞类型。
这种细胞通过表达一系列感受态受体来响应外界刺激，从而产生不同的生物学效应。
因此，在研究细胞信号传导、生长因子作用机制、药理学等方面，感受态细胞被广泛应用。
本文将介绍感受态细胞的制备方法及其相关应用。
感受态细胞制备的方法有很多，其中最常见的包括转染法和稳定转染法。
转染法是将外源性DNA片段通过离子凝胶、酸化凝聚物、脂质体、电渗法、基因枪等方式导入到细胞中，使其表达目的基因。
而稳定转染法则是在转染的基础上添加反义RNA或抗性基因，以提高细胞对外源DNA的稳定性和表达强度。
在转染前，需要量化选择适当的转染试剂和细胞培养试剂，并根据具体的研究要求选用合适的转染工具。
除了转染外，还有一种较为实用的方法是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术。
该技术可以精确的修改DNA序列，从而实现对细胞内基因的编辑和调控。
可以利用该技术直接构建感受态细胞或是对已有的细胞进行改造。
因此，该技术在制备感受态细胞中被广泛应用。
制备好的感受态细胞可以应用于多种研究领域。
其中，最常见的应用是通过感受态受体识别特定的分子信号。
在药理学中，感受态细胞经常被用来筛选新型药物，具有广泛的应用前景。
此外，通过对感受态细胞的研究，可以深入了解不同受体的结构、功能和信号传导途径，可以为开发治疗不同疾病的新药物提供基础。
总之，感受态细胞作为能够感应外界信号的特殊细胞类型，其在生物学研究中扮演着至关重要的角色。
制备和应用感受态细胞的方法及应用也在不断地发展和完善。
未来，随着人们对该领域的深入研究，感受态细胞的研究应用也将不断拓展。
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法
感受态细胞是一种特殊的细胞状态，可以用于研究细胞对外界刺激的感知和响应。
以下是一种常见的制备感受态细胞的方法：
1. 培养细胞：选择需要研究的感受态细胞类型，如神经元、免疫细胞等，在细胞培养基中培养细胞至合适的生长状态。
2. 刺激处理：给予细胞一定的外界刺激，如药物、光刺激、温度变化等。
刺激的剂量和时间可以根据具体研究目的进行调整。
3. 收集细胞：在刺激处理后，收集细胞，可以通过离心等方法使细胞沉积在培养皿底部或离心管中。
4. 提取RNA或蛋白质：利用相应的方法提取细胞中的RNA或蛋白质，用于后续分析。
5. 分析感受态：通过各种分析方法，如实时定量PCR、Western blot、流式细胞术等，检测特定的感受态标记物的表达水平或蛋白质修饰情况。
感受态细胞的制备方法可以根据具体研究目的和细胞类型的不同而有所差异，因此在实际操作过程中需要根据具体情况进行调整和优化。
（写作参考：）。
(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
所用的 CaCl2 等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于 ⑶、防止杂菌和杂 DNA 的污染
4 ℃。
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿， 如离心管， 移液枪头等最好是新的， 并经
高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、
DNA 酶或杂 DNA 所污染，
否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入。
OD600 控制。对
TG1 菌株， OD600 为 0 ． 5 时，细胞密度在 5×107 个 /ml 左右。（应注意 OD600 值与细
胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体
细胞一般应是限制 -修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并
且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 ⑵、试剂的质量
上摇动 10min, 弃去染色液 .
③ 加入约 50ml 的水 , 再加热至沸腾后保持沸腾状态
30-60s, 停止加热后在摇床上要
5-10min, 换水可完成脱色 .
④ 若要得到无背景的染色胶 ,可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜 .
镍柱。 用不同浓度的咪唑洗脱。 因为咪唑和组氨酸都带正电， 可在咪唑逐渐加大浓度的条件 下洗脱目的蛋白。 protocol 里有啊。
（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。） (1) 将菌液转入 50mL 离心管中，冰上放置 10min 。 (2) 在 4 ℃下， 4000r/min 离心 10min 。弃去上清，将管倒置 1min 以便培养液流尽。 (3) 用冰上预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液 10mL 轻轻悬浮细胞，冰上放置 30min 。 (4)0 ～ 4℃ 4000r/min 离心 10min ，弃去上清， 加入 2mL 预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液， 轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。 （注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制 备）
感受态制备
1、在制备过程中，细胞膜通透性增大而变得脆弱，低温能提高感受态细胞 存活率。所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡。 2、实验溶剂的温度、离心时的温度、缓冲液的温度都要保持低温。
器皿洁净：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip
头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被 其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
感受态细胞的制备及转化
小飞蝗
感受态细胞
所谓感受态，即指受体最易接受外源DNA片段并实现 其转化的一种生理状态。
转化
转化：细胞通过摄取外源遗传物质而发生遗传学改变的过程。 受体菌只有处在感受态时才能够摄取转化因子。
应用
重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞使 之无性繁殖或者高效表达外源基因，它是微生物遗传、分子 遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
8）沉淀缓悬于初始菌液体积1/12.5的TB溶液中，冰浴10min；
9）加入7% 终体积的DMSO，逐滴加入且边加边慢摇； 10）冰浴10min，以0.1mL/管分装于预冷的eppendorf管中；
11）液氮速冻，-80oC贮存，在半年内使用。
三、电击转化
电击法: 使用瞬时高压电（数千伏特）处理细胞悬液，微生 物细胞膜在高压电的作用下发生去极化，产生微孔，悬液中 溶解的核酸即可通过细胞膜上的孔洞进入细胞内部。 特点:做电击转化时，悬液中有近70%的细胞会因电击而死亡， 但转化效率很高。
二、超级感受态细胞的制备
感受态细胞制作
方法七：Inoue法制备超级感受态细胞越干净越好，越冷越好。
1、将洗干净的瓶子（500ml三角烧瓶）用Milli-Q水浸泡2-3小时，倒去烧瓶中的水并将烧瓶倒扣在吸水纸上2-3分钟。
用Milli-Q水配置250ml LB液体培养基。
高压灭菌。
2、准备两盒1.5ml EP管，每盒中放置两张吸水纸，共约两百个。
高压灭菌。
3、于早晨7-8点钟小摇菌种，挑取单菌落于5ml Milli-Q水配置且灭菌的LB液体培养基（无抗性）中，37℃培养12小时以上（OD600大于1.5）。
可以用一个新的50ml 进口离心管（costa，BD等品牌都可以）来摇细菌。
4、晚上10点钟左右，按1：100大摇细菌。
超静台内吸取2.5ml小摇细菌于高压灭菌的250ml SOB培养基（无抗性）中，18-22℃，200rpm摇过夜。
5、第二天上午测量细菌OD600值。
Top10, JM109等生长速度快的细菌约在上午9点左右OD600达到0.55左右，DH5α则要到下午4-6点钟（可以多摇几瓶细菌，梯度接菌，如1：50，1：100，1：200等）。
6、将OD600达到0.55的细菌置于冰上10min（OD600在0.4-0.8之间都可以，对结果影响不大）。
7、4℃，4000rpm（2500g），10min集菌（用新的50ml 进口离心管）。
8、超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上，大力向下击打，尽可能去掉剩余SOB(LB)。
9、每管倒入10ml 预冷的Inoue转化缓冲液，拧紧盖子。
在冰上来回滑动重悬细菌（重悬的时间与向下击打的力度和来回滑动的速度相关，这两者与感受态效率没有直接关系）。
10、超静台内向每管倒入约30ml 预冷的Inoue转化缓冲液，来回颠倒混匀，冰上10min。
11、4℃，4000rpm，10min集菌。
12、超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上（换一张吧，别用刚才那张），大力向下击打，尽可能去掉剩余缓冲液。
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大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法关于感受态细胞(Competent cells)常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化，是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。
当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。
所以称这种现象为α-互补现象。
由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。
所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法方法一：细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。
用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。
本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。
操作过程简述如下。
1．从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。
2．在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。
3．于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。
4．倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
5．以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上。
6．于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。
7．倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
8．每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。
9．用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。
10．将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管。
11．快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。
12．每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
13．将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。
14．将平板置于室温至液体被吸收。
15．倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。
方法二：CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。
与CaCl2法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCl2法，一般可达106-108cfu/μg，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。
准备工作：1．从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在LB平板上划线，37度过夜至长出单菌落。
挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5ml LB培养基中，37℃，250rpm，过夜培养。
2．次日从5ml LB培养物吸取200μl转入50ml LB培养基中（250ml 锥形瓶），37 ℃，250rpm培养2小时，此时OD600约0.4—0.5。
感受态细胞的制备：3．吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟，弃去上清。
4．加入100μl预冷的Solution A，悬浮菌体，冰浴30分钟。
5．此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。
细胞转化：6．在感受态细胞中加入100pg-10ngDNA，混匀，冰浴30分钟，然后42℃ 1分钟热击，再次冰浴2 分钟。
加入0.9ml LB 培养基，20μl Solution B，37℃，振荡培养1小时。
7．取适当菌液（100-200μl）涂布相应抗性的平板。
8．过夜培养约16个小时，数菌落数，计算转化率。
补充说明：1．所用器具一定要清洁；2．操作步骤2 中培养基的装量也是很重要的，建议装量不要高于此值：500ml 锥形瓶装100ml培养基，250ml锥形瓶装50ml培养基；3．在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2 ，效果会更好一些；4．为保证细胞处于对数生长期，培养后的菌体的OD值不要高于0.6；5．制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作；6．细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击，冰浴后直接加入新鲜LB，简化操作步骤，但转化效率低于热击方法，适用于对转化率要求不高的实验。
方法三：1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0.33、然后把培养物倒入1.5ml 离心管中，冰浴10min 。
4、在4℃下以4000rpm 离心5min ，去上清液5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl 2溶液中，置冰上30min6、然后再在4℃下以4000rpm 离心10min ，去上清液7、将菌体悬浮于0.1ml CaCl 2溶液中，冰浴放置4-12hr 备用。
方法四：（1）将1ml 过夜培养的细菌（如DH52、TG1、TM101）接种于100ml2×YT 培养于500ml烧瓶。
于37℃刷烈振荡，通常≥200rpm 培养的细菌密度约OD550=0.2～0.5(5×107cells/ml),需2～4h 。
（2）将培养物放于冰上致冷10min ，于4℃离心细菌培养物，10000rpm 离心10min 。
（3）弃除上清，将细菌悬浮于原始培养体积的一半（约50ml ）的50mMCaCl2和10mm Tris·HCl （pH8.0）无菌冷冻液体中。
（4）将细菌悬浮放在冰上约5min ，然后将悬浮物于4℃10000/rpm 离心10min 。
（5）弃上清，悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl 和10mMTris·HCl （pH8.0）无菌冷冻中。
此时的细胞是感受态细胞，即可用于转化。
200μl 分装于无菌的1.5ml 微量离心管中，贮存于-80℃冰箱中。
方法五：TSB 法（也是本人热衷的方法）1.药品制备1M Mg 2+ (1M MgSO 4 和 1M MgCl 2等体积混合)，用0.22um 滤膜超滤除菌。
TSB 液（30mL/ 80mL 菌液）（现配现用）：PEG3350 3gTryptone 0.3g Yeast extract 0.15g NaCl 0.3g2. 步骤：（1）活化菌株（2）挑单菌落培养于5mL 的液笨培养基中（3）取液体培养物50uL 于80mL 的液体培养基中进行扩大培养（4）370C 培养3－4小时，OD 600在0.4－0.6（5）离心，去上清（6）加入20mLTSB ，重悬（7）离心，去上清（8）加入10mLTSB ，再加入15－20%的甘油，分装保存注，整个操作过程均应在冰上进行。
所用药品均需灭菌。
转化程序（1）取出200μl 感受态细胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA 或连接反应混合物，DNA 量通常≤50mg。
用手指弹打试管10次，使之混匀，然后放在冰上40～45min 。
（2）将管放于42℃水浴中2min 。
（3）然后每管直接加入1.0ml2×YT 培养基，倒置混匀，并于37℃培养8～12h ，干浴或水浴，不需振摇。
此期间使细菌生长并开始表达抗菌素。
（4）每200μl 转化混合物分别于6个2×YT 琼脂培养板上补充相应抗生素，并含有X-gal （20mg/ml ）、IPTG （200mg/ml ）。
1210C, 15min 灭菌后，加入1MMg 2+600uL , 以及DMSO 3mL（5）铺板使细菌混合物干后，倒转平板放于30～37℃培养箱中18～22h。
克隆在此期间应该出现，否则转化不成功。
常用的大肠杆菌感受态细胞的制备方法除以上几种外，还有很多。
各种方法都各有其优缺点，我们在选择方法的时候应根据自己实验具体情况而定。
以期获得最高的转化效率。