感受态细胞制备的几种方法

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

关于感受态细胞(Competent cells)

常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化，是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

方法一：

细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。

用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。操作过程简述如下。

1．从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml

新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。

2．在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。

3．于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。

4．倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

5．以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上。

6．于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。

7．倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

8．每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。

9．用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。

10．将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管。

11．快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。

12．每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

13．将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。

14．将平板置于室温至液体被吸收。

15．倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。

方法二：

CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。与CaCl2法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCl2法，一般可达106-108cfu/μg，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。

准备工作：

1．从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在LB平板上划线，37度过夜至长

出单菌落。挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5ml LB培养基中，37℃，250rpm，

过夜培养。

2．次日从5ml LB培养物吸取200μl转入50ml LB培养基中（250ml 锥形瓶），37 ℃，250rpm培养2小时，此时OD600约0.4—0.5。

感受态细胞的制备：

3．吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟，弃去上清。

4．加入100μl预冷的Solution A，悬浮菌体，冰浴30分钟。

5．此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。

细胞转化：

6．在感受态细胞中加入100pg-10ngDNA，混匀，冰浴30分钟，然后42℃ 1分钟热

击，再次冰浴2 分钟。加入0.9ml LB 培养基，20μl Solution B，37℃，振荡

培养1小时。

7．取适当菌液（100-200μl）涂布相应抗性的平板。

8．过夜培养约16个小时，数菌落数，计算转化率。

补充说明：

1．所用器具一定要清洁；

2．操作步骤2 中培养基的装量也是很重要的，建议装量不要高于此值：500ml 锥形瓶装100ml培养基，250ml锥形瓶装50ml培养基；

3．在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2 ，效果会更好一些；

4．为保证细胞处于对数生长期，培养后的菌体的OD值不要高于0.6；

5．制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作；

6．细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击，冰浴后直接加入新鲜LB，简化操作

步骤，但转化效率低于热击方法，适用于对转化率要求不高的实验。

方法三：

1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜

2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0.3