去透明带方法的选择对小鼠早期胚胎体外培养的影响

ZP ） 是一层包绕在所有哺乳动 透明带（ zona pelluccida ， 物卵母细胞外围的非细胞的糖蛋白结构， 对卵子的发育、 受 精以及着床前胚胎发育起着关键性作用 。IVF（ in vitro fertilization， 体外受精） 、 体外人工核移植以及其他需要对早期胚 胎显微操作的研究都需要在着床前胚胎即透明带尚未消失 前进行， 所以透明带的存在成为上述研究的一种障碍， 因此 确定一种简单易行、 快速去除透明带且对胚胎损伤最小的方 法可以为上述研究打下良好的基础 。 现阶段去除透明带的方法主要为： 酸性台式液去透明带 0． 5% 链酶蛋白酶去透明带法 。 本研究观察了应用两种 法、 方法去透明带以后受精卵体外分裂的情况， 以单细胞受精卵 分裂为 2 － 细胞受精卵的卵裂率为观测指标， 探讨酸性台式 液去透明带法及 0． 5% 链酶蛋白酶去透明带法中哪种更适合 作为去除透明带的首选方法以及对小鼠早期胚胎体外培养 有何影响。 1 1． 1 材料与方法
第 20 卷第 2 期 2012 年 2 月
中国医学工程 China Medicaቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ Engineering
Vol． 20 No． 2 Feb， 2012
·临床研究·
去透明带方法的选择对小鼠早期胚胎 体外培养的影响
高 源， 秦书俭， 郑德宇， 刘建生， 马 刚
（ 辽宁医学院 人体解剖与组织胚胎教研室 ， 辽宁 锦州 121001 ）
0． 5% 链酶蛋白酶去透明 组： 分别为酸性台式液去透明带组 、 带组、 未去透明带组。 1． 2． 3． 1 台式液去透明带组 （ 在酸性台式液中添加 0． 5% PVP 的 以降低因去除透明带后受精卵产生的黏性） 将收集 用吸头的尖部上下 的单细胞受精卵部分移至酸性台式液中， 同时观察透明带的溶解情况 。 当透明带 反复轻柔吹打细胞， 立即将其转移到新的 FHM 液滴中反复洗涤以终止 溶解后， 酸性台式液的作用。 1． 2． 3． 2 链霉蛋白酶去透明带组 （ 在 0． 5% 链霉蛋白酶中 添加 0． 5% 的 PVP 以降低因去除透明带后受精卵产生的黏
摘要： 目的 探讨去透明带方法的选择对小鼠早期胚胎体外培养的影响 。方法 用孕马血清促性腺激素 （ PMSG） 与人绒毛促性腺激素（ hCG） 对小鼠进行超数排卵后， 取单细胞阶段受精卵， 将其分为酸性台式液去透 0． 5% 链霉蛋白酶去透明带组（ 链霉蛋白酶组） 以及未去透明带组。 体外培养， 明带组（ 台式液组） 、 分别观察三 组单细胞受精卵分裂为 2 － 细胞受精卵的卵裂率。 结果 台式液组、 链霉蛋白酶组与未去透明带组的第一次 66． 7% 、 66． 1% ， 卵裂率分别为 65． 1% 、 三组之间比较差异无统计学意义（ 0． 950 ＞ P ＞ 0． 900 ） 。 结论 在体外 用酸性台式液去透明带与 0． 5% 链霉蛋白酶去透明带后受精卵均能进行正常分裂， 此两种处理方 培养条件下， 法对受精卵早期发育均没有影响 。 关键词： 透明带； 小鼠早期胚胎； 卵裂率 中图分类号： R329． 1 文献标识码： B
收稿日期： 2011 － 11 － 22
采用 SPSS17． 0 统计软件， 各组间率的比
P ＜ 0． 05 为有统计学意义。 较采用 X 检验，
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（ 用 HEPES 缓冲的 KSOM ） 操作液购自 Millipore 公司， 人绒 毛促性腺激素（ hCG ） 、 透明质酸酶、 矿物油、 链酶蛋白酶、 酸 性台式液均购自美国 Sigma 公司。 1． 2 方法 1． 2． 1 实验动物的超数排卵 因注射 PMSG 之后的内源 LH 释放时间受光照周期的调控， 实验用鼠应适应本鼠舍光 照周期后进行超排。 下午 13 时对小鼠超数排卵： 经腹腔注 48h 后， 射 PMSG 10IU / 只， 经腹腔注射 hCG 10IU / 只。 注射 hCG 后， 按雌雄鼠 2 ： 1 合笼， 次日上午 8 时检查雌鼠， 通过检 查是否有阴道栓以确定受精母鼠 。 1． 2． 2 获取单细胞受精卵 确定受精母鼠的当天上午， 将 受精母鼠快速并人道的利用颈椎脱臼法处死， 在无菌条件 下， 打开小鼠腹腔， 用小剪刀取出输卵管以及部分靠近输卵
实验动物及主要试剂 清洁级昆明小鼠（ 4 ～ 6 周龄， 体重 25 ～ 30g） 购自辽宁医学院实验动物中心， 孕马血清促性 FHM 腺激素（ PMSG ） 购自杭州动物制药厂，KSOM 培养液、
性） 将收集的单细胞受精卵部分移至 0． 5% 链霉蛋白酶中， 用吸头的尖部上下反复轻柔吹打， 同时观察透明带溶解情 况。当透明带溶解后， 立即将其转移到新的 FHM 液滴中反 复洗涤以终止链霉蛋白酶的作用 。 1． 2． 3． 3 未去透明带组 另移取受精卵数枚置于新的 KSOM 液滴中作为对照。 1． 2． 4 受精卵的培养 1． 2． 4． 1 B 两组细胞在去透明带后立即移至平衡好的 将 A、 KSOM 培养液中， 5% CO2 表面覆盖一层矿物油， 放入 37℃ 、 的培养箱中过夜。 1． 2． 4． 2 将 C 组细胞直接移至平衡好的 KSOM 培养液中， 5% CO2 的培养箱中过夜。 表面覆盖一层矿物油， 放入 37℃ 、 次日上午， 观察各组受精卵的发育情况， 统计各组中单 2 － 细胞受精卵个数并以此计算卵裂率 。 细胞受精卵、 1． 3 统计学分析
管的子宫， 置于 FHM 培养液中。解剖显微镜下观察， 找到膨 大的输卵管壶腹部， 用针头撕破壶腹部， 即有被卵丘细胞包 围的合子团流出。将合子移至透明质酸酶溶液（ 用 FHM 稀 在解剖镜下观察， 见卵丘细胞脱掉立即 释到 0． 3mg / mL） 中， 将受精卵转移到含新鲜 FHM 操作液中， 洗 3 － 5 次， 以去除 卵丘细胞以及杂质。 镜下观察受精卵形 残留的透明质酸酶、 态： 有 2 个极体、 雄原核以及部分生成雌原核的为单细胞受 精卵。 1． 2． 3 实验分组以及培养 B、 C三 根据实验设计分为 A、