免疫组化操作步骤65820
免疫组化实验的详细步骤
免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。
准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。
免疫组化操作流程
免疫组化操作流程免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或组织中是否存在其中一种抗原或蛋白质，并进一步定位其在细胞或组织中的分布情况。
下面是免疫组化的一般操作流程：1.样本制备：a.细胞培养：对于体外培养的细胞，将其定植在培养皿中，使其附着在载玻片上。
b.组织切片：将组织固定、石蜡包埋后，用切片机将其切割成小片。
2.抗原修复：a.细胞：用4%的甲醛或冰醋酸将细胞固定，然后用PBS（磷酸缓冲盐溶液）进行洗涤。
b. 组织：将石蜡包埋的组织切片用xylene去除石蜡，并通过一系列浓度递减的酒精进行洗涤。
3.抗体选择和制备：a.选择合适的一抗体与待检测的目标蛋白或抗原有特异性结合。
b.对于小分子抗原，可以直接用抗体进行染色。
对于较大的蛋白质抗原，需要通过特殊方法将抗体标记。
4.抗体染色：a.细胞：将细胞孵育在含有一抗体的PBS中，并进行特定时间的孵育，然后通过洗涤去除未结合的抗体。
b.组织：将抗体加到待检的组织切片上，经过适当的孵育时间，然后通过洗涤去除未结合的抗体。
5.反应显色：a.一抗染色：根据抗体的结合情况，选择适合的检测方法，如发光、颜色显现等。
b.二抗染色：对于无法直接检测的一抗染色结果，需要加入二抗，二抗可以与一抗特定的Fc部分结合，形成复合物。
二抗通常被标记为酶，可以与底物反应产生颜色或发光。
6.显微镜观察：a.细胞：将染好的细胞载玻片通常先底片固定，然后在显微镜下观察并拍照。
b.组织：将染好的组织切片在载玻片上，然后将其加入显微镜下观察，并通过摄影或记录图像。
7.数据分析和结果解读：a.根据具体的研究目的，对显微镜下观察到的结果进行统计和分析。
b.根据染色的结果和显微镜下观察到的细胞或组织分布情况，对目标蛋白或抗原的表达进行解读。
总结：免疫组化是一种重要的实验方法，可用于检测和定位细胞或组织中的目标蛋白或抗原。
操作流程包括样本制备、抗原修复、抗体选择和制备、抗体染色、反应显色、显微镜观察、数据分析和结果解读。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种非常神奇的实验技术，它可以帮助我们更好地了解细胞的结构和功能。
那么，免疫组化的完整步骤及各步原理究竟是什么呢？别着急，让我来给大家一一道来。
我们要了解一下什么是免疫组化。
简单来说，免疫组化就是利用特定的抗体去寻找目标蛋白，然后通过化学染色的方式将这些蛋白标记出来，这样我们就可以更加清晰地看到它们在细胞中的分布情况了。
那么，免疫组化的第一步是什么呢？没错，就是要准备好实验所需的材料和设备。
这包括：抗体、抗原、酶标板、洗涤缓冲液、PBS缓冲液、DAB染色剂等等。
当然啦，这些材料和设备都是非常珍贵的，所以我们在使用的时候一定要小心谨慎哦！接下来，我们就要开始进行免疫组化实验了。
我们需要将抗原加入到酶标板中，然后用洗涤缓冲液将其充分稀释。
接着，我们就可以将待检测的细胞涂布到酶标板上了。
这里需要注意的是，涂布的时候一定要均匀涂抹，否则就可能会影响后续的实验结果哦！涂布好细胞之后，我们就需要让它们休息一会儿了。
这个过程叫做“孵育”。
在孵育的过程中，抗体会自己找到抗原并与之结合。
这个过程通常需要几个小时的时间，具体时间取决于所使用的抗体和抗原的性质。
孵育完毕之后，我们就可以进行下一步操作了——洗涤。
洗涤的目的是去除未结合的抗原和未被抗体识别的细胞残留物。
这个过程通常需要用到PBS缓冲液或洗涤缓冲液，并且要反复洗几次才能彻底清除所有的残留物。
洗完之后，我们就可以进行染色了。
这个过程叫做“DAB染色”。
DAB染色剂可以与抗体结合产生紫色的颜色反应，从而使我们能够清晰地看到被标记出来的目标蛋白。
染色的时间通常也只需要几分钟左右就可以了。
我们还需要进行一个叫做“复染”的操作。
复染的目的是让细胞核也被染上颜色，这样我们就可以看到细胞的整体结构了。
复染通常需要用到碱性染料，比如伊红染料。
不过复染的时间也要控制好哦，过度染色可能会影响到后续的实验结果。
好了，以上就是免疫组化的完整步骤及各步原理了。
免疫组化的操作流程
免疫组化的操作流程免疫组化是一种在细胞或组织中检测特定抗原或抗体的方法。
免疫组化广泛应用于医学诊断、生命科学研究和药物研发等领域。
下面是免疫组化的操作流程。
1.样本处理：首先，需要准备待检测的样本。
样本可以是组织片、细胞悬液或液体样本（如血清或尿液）。
对于组织样本，通常需要固定、切片和脱水等处理步骤，以保持细胞和组织的结构和形态。
2.抗原修复：组织样本中的抗原通常会在固定处理过程中被破坏或失活。
为了恢复抗原的免疫反应性，需要进行抗原修复步骤。
常用的抗原修复方法包括加热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复。
3.抗原检测：制备好的样本可以用于检测抗原。
抗原检测通常通过选择与目标抗原特异性结合的一组试剂，如特异性抗体或亲和素。
这些试剂将与待检测样本发生特异性结合，从而形成特定的抗原-抗体结合物。
4.一次抗体结合：首先，将样本与一次抗体结合。
一次抗体是与目标抗原结合的特异性抗体。
待检测样本与一次抗体一起孵育，使其与目标抗原发生特异性结合。
5.洗涤：为了去除未结合的一次抗体和其他非特异性结合物，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以用缓冲液溶液进行多次重复，以确保样本的纯净性。
6.二次抗体结合：接下来，需要将与检测物发生特异性结合的二次抗体与样本反应。
二次抗体是与一次抗体特异性结合的抗体。
这些二次抗体通常与标记物结合，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
7.洗涤：与一次抗体结合后，需要再次进行洗涤步骤，以去除未结合的二次抗体和其他非特异性结合物。
8.标记物探测：二次抗体中的标记物将通过检测技术进行可视化。
最常用的检测技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），其中酶标记物与底物反应产生可见的颜色变化。
其他常用的标记物包括荧光染料、生物素-链霉亲和素等。
9.观察和分析：最后，需要使用光学显微镜或显微镜等工具观察标记物，并进行结果分析。
可以根据标记物的位置、数量和强度等进行定量和定性的分析。
总之，免疫组化操作流程包括样本处理、抗原修复、抗原检测、一次抗体结合、洗涤、二次抗体结合、洗涤、标记物探测和观察分析等步骤。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤以下是免疫组化法的标准实验操作步骤：1.样本准备：a.获取待检样本，例如组织切片或细胞悬液。
b.将样本固定，常用的固定剂包括福尔马林、乙醇和乙酸等。
c.进行脱水和石蜡包埋，以便于后续切片。
2.制备切片：a.用切片机将固定的样本切成薄片，通常为4-6微米。
b.将切片平均分配在载玻片上。
3.制备蜡块：a.将切片放入烘箱中进行去蜡，以去除切片上的石蜡。
b.用乙醇对切片进行脱水然后重新水化。
c.将切片放入热稳定耐热塑料材料中，通常为硝酸纤维素薄膜等。
4.抗原恢复：a.使用高温高压（如压力锅或蒸汽炉）进行抗原恢复，以改善抗体与抗原的结合效率。
b.根据实验需要选择适当的抗原恢复缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS）、EDTA缓冲液或三氯醋酸缓冲液等。
c.将切片放入抗原恢复缓冲液中进行恢复处理。
5.抗体处理：a. 选择适当的一抗（primary antibody），根据目标蛋白质的性质选择单克隆或多克隆抗体。
b.将一抗稀释至适当浓度，根据抗原的强度调整抗体浓度。
c.将一抗加入样本上共孵育，使抗体与目标蛋白质发生特异性结合。
d.对于一些抗体，可以使用辅助试剂如牛血清蛋白、牛血清、胶原蛋白等增强结合效果。
6.清洗：a.用PBS或其他合适的缓冲液冲洗切片，以去除未结合的一抗。
b.重复冲洗步骤多次，以充分去除未结合的抗体。
7.检测标记：a.选择适当的检测标记，如酶（如辣根过氧化物酶，HRP）、荧光染料或金标记等。
b.将标记物加入到一抗与抗原结合的位置上，以形成可视的标记。
8.染色：a.若使用酶标记物，则使用特定底物进行染色，产生颜色反应。
b.若使用荧光标记物，则观察荧光信号。
9.显微镜观察：a.使用适当的显微镜观察切片，记录和分析结果。
b.对于荧光标记，可以使用特定的荧光染色剂如DAPI进行细胞核染色。
10.结果分析：a.根据实验设计和目的，对结果进行定性或定量分析。
b.可以使用图像分析软件进行影像处理和数据分析。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化染色实验操作流程实验目的：观察标记物在细胞中的表达及分布。
一、病例资料和实验分组标本：经10% 福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4µm厚切片编号备用。
二、试剂及免疫组化方法2.1 实验试剂：xx两步法免疫组画试剂盒和DAB显色试剂盒进行组化染色。
抗体1,抗体2。
二甲苯、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甲醇、30% H2O2、羊血清、Triton液、中性树脂等。
2.2 仪器(1)10µl、100µl、200µl、1000µl可调微量加样枪（2）4℃冰箱(3)光学显微镜(4)恒温水浴锅(5)恒温烤箱(6)电热蒸馏水器(7)LEICA显微镜及VISITRON照相系统(8)其他：量筒、电炉、高压锅、染缸、湿盒、脱蜡架、冲洗球、免疫组化笔等。
2.3 主要试剂的配置（1）0.01M PBS(PH7.4)缓冲液NaCl9.0 g磷酸氢二钠 2.901 g磷酸二氢钠0.296 g加入1000ml容量瓶，加ddH2O至1000ml定容。
充分混合（2）0.01mol/L柠檬酸盐溶液（PH 6.0）A液：0.1M柠檬酸溶液(4℃保存)29.01g柠檬酸1000mlddH2OB液：0.1M柠檬酸钠溶液(4℃保存)29.41g柠檬酸钠1000mlddH2O缓冲液现用现配（1000ml 0.01 mol/L）A液（18ml）+B液(82ml)900mldH2O充分混合，调整PH 6.0，充分混合，调整PH 6.0（3）3% H2O230% H2O2：甲醇=1：9(4)0.1%Triton的配制Triton原液0.1 ml0.01PBS液99.9ml4℃保存备用。
（5）5%羊血清的配制（1ml）羊血清50µl0.1%Triton 950µl4℃保存。
2.4 免疫组化方法(1)石蜡切片60℃烤箱烤片30min.(2)石蜡切片常规脱蜡二甲苯Ι15min -- 二甲苯Ⅱ15min -- 无水乙醇Ι15min -- 无水乙醇Ⅱ5min -- 无水乙醇Ⅲ5min -- 95%乙醇5min -- 90%乙醇5min -- 80%乙醇5min -- 70%乙醇5min -- 蒸馏水冲洗3min，浸泡待用（浸泡在什么溶液中？）。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。
下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。
1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。
2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。
对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。
3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。
对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。
4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。
5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。
6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。
7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。
8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。
9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。
10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。
11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。
12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。
需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。
免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或者组织中特定的分子，如蛋白质、核酸和糖等。
下面是免疫组化的详细步骤：1.样本准备：a.细胞或组织准备：首先需要获取细胞或组织样本，可以通过培养细胞或直接取得组织切片。
b.保存和处理：细胞或组织样本需要保存在合适的液体中，如福尔马林或液氮，以保证样本的完整性和保存时间。
c.切片：对于组织样本，需要将其切割成薄片，常用的方法是冰冻切片或石蜡包埋切片。
2.抗原的暴露：a.反应原位：对于固定的细胞或组织样本，可以直接进行免疫组化实验。
b.透化处理：对于未固定的细胞或组织样本，需要进行透化处理，以使抗体能够穿透细胞膜或组织间隙。
3.抗原检测步骤：a.抗原恢复：有时，抗原可能会受到固定或透化处理的损伤，需要进行抗原恢复步骤。
常见的方法有热处理、酶消化和抗体消除等。
b.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要对样本进行阻断处理，可以使用一些蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼胶。
4.抗体标记检测：a.一抗：选择特异对应抗原的一抗（原抗体），将其加入到样本中，与样本中的特定抗原结合。
b.二抗：将含有特异对一抗的二抗（辅助抗体）标记的溶液加入到样本中，与一抗结合。
二抗通常会与荧光染料、酶或金颗粒等标记结合。
5.洗涤：a.用缓冲液洗涤样本，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。
6.反应可视化：a.荧光标记：对于荧光染料标记的样本，可以通过荧光显微镜观察到标记物的信号。
b.酶标记：对于酶标记的样本，需要使用合适的基质使酶产生染色反应，并通过显微镜观察到染色的结果。
7.整理和分析：a.包装：用透明性的封片将样本封装，以便保存并观察。
b.分析：使用显微镜分析样本的结果，例如观察染色的细胞或组织的形态、信号定位等。
免疫组化详细步骤
免疫组化步骤取组织、固定、制片(脱水、透明、浸蜡、包埋）、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体一、取组织二、固定三、制片1、脱水透明的酒精梯度和时间70％酒精20min 80%酒精1h90%酒精1h 95％酒精Ⅰ2h95％酒精Ⅱ2h 无水乙醇Ⅰ15min无水乙醇Ⅱ15min 无水乙醇Ⅲ15min二甲苯酒精1：1 15min 二甲苯Ⅰ25min二甲苯Ⅱ25min 二甲苯Ⅲ15min2、浸蜡:石蜡融化后，在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h3、包埋四、切片烤片用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时五、脱蜡至水六、抗原修复配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸，在高压锅内放入自来水煮沸(不盖锅盖），将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中，盖上锅盖，待其压力达到最大时维持三分钟七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却八、将玻片放置于塑料板上，滴加3％的过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶，10min过后PBS冲洗2次×3分钟九、除去PBS（甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数），4℃过夜十、PBS冲洗3次×2分钟，除去PBS液,每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min十一、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加酶标抗兔聚合物，室温孵育10min十二、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加新配制的DAB（二氨基联苯胺)，室温孵育2～10分钟，显微镜观察十三、苏木精复染:苏木精复染5min，水洗3min，0。
1%HCl浸提两次,水洗3min，反蓝液数秒，水洗十四、脱水透明：70％酒精3min、80％酒精3min、90％酒精3min、无水乙醇3min、二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min十五、封片。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化技术是一种常用的细胞和组织学研究方法，广泛应用于病理学、生物学、药理学等领域。
下面将详细介绍免疫组化操作规程及操作流程。
一、实验前准备1.准备实验所需的试剂和试验设备，包括抗体、缓冲液、加标物、显色剂等。
2.检查免疫组化试剂的有效期，确保试剂的质量。
二、标本处理1.收集组织标本，如活检样本或动物组织。
2.快速处理标本，迅速取出，并选择适当的处理方法，如固定、包埋等。
3.处理过程中要避免标本的冻融、干燥等。
三、抗原回复1.对于经过固定的组织标本，使用抗原回复方法来恢复组织标本中的抗原活性。
2.选择适当的抗原回复方法，如热处理、酶解等。
四、非特异性结合阻断1.使用非特异性抗血清或蛋白质来阻断非特异性结合位点。
2.使非特异结合抗体活性降低，减少假阳性结果。
五、抗体处理2.优化抗体浓度，确保抗体与标本中的抗原结合。
3.对于特定抗体，可以进行荧光标记或酶标记等。
六、免疫组织染色1.用适当的缓冲液稀释抗体，并将其应用于组织标本上。
2.根据实验需求选择适当的孵育时间和温度。
3.利用显色剂或荧光显像剂对标本进行染色。
七、显微镜观察与分析1.将染色后的标本放置在显微镜下观察，并选择适当的增强荧光信号方法。
2.结合相关的正对照和负对照进行结果分析，确定一些蛋白质在组织中的表达情况。
3.分析结果并记录数据。
八、结果分析与报告1.根据观察结果，分析样本中目标抗原的表达情况。
2.比较不同样本之间的差异，得出结论并撰写实验报告。
九、实验后处理1.清洗使用过的实验工具和材料，避免交叉污染。
2.妥善处理废弃物和化学品，根据实验室内相应的安全操作规范进行处理。
免疫组化操作程序
免疫组化操作程序免疫组化操作程序是一种用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达及定位的方法。
它是一种广泛应用于生物医学研究和诊断中的技术，可以帮助我们了解细胞和组织中的分子机制并在疾病诊断中起到重要的作用。
本文将详细介绍免疫组化操作程序的步骤和注意事项。
一、实验前准备：1.样本准备：收集并固定适当的组织样本，使用适当的方法固定样本，如福尔马林或酒精。
2.抗体选择：根据所需研究的蛋白质，选择合适的一抗和二抗。
同时，选择用于检测的标记物，如酶、荧光物质等。
3.条件优化：根据本实验的具体情况，优化实验条件，包括温度、时间和浓度等。
二、免疫组织染色步骤：1.切片制备：将固定的组织样本切片，厚度约为4-6微米。
2.抗原修复：根据实验需求，选择适当的方法进行抗原修复，如高温加热、酶解或酸解等。
3.阻断非特异性结合：将组织切片加入阻断液，如10%牛血清蛋白（BSA）或5%牛血清中所含的非离子阻断剂。
封闭其非特异性结合位点。
4.一抗孵育：将选择的一抗溶液滴于组织切片上，孵育在适当的温度和时间下，让一抗与目标蛋白结合。
5.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的一抗。
6.二抗孵育：将选择的针对一抗的二抗溶液滴于切片上，孵育在适当的温度和时间下，让二抗结合到一抗上。
7.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的二抗。
8.标记物检测：根据选择的标记物，使用适当的方法检测其在切片上的存在，如化学染色、荧光显微镜等。
9.涂覆封片：将固定和染色好的切片放置在玻璃片上，并用适当的封片溶液覆盖切片。
三、实验注意事项：1.样本处理：合适的样本处理和固定方法对实验结果至关重要。
选择适当的固定剂并注意固定时间。
2.抗原修复：不同的抗原修复方法适用于不同的蛋白质，需要根据实验要求选择适当的方法。
3.阻断非特异性结合：添加适当的非特异性结合阻断剂能够减少非特异性结合。
4.孵育温度和时间：根据抗体和样本的特性选择适当的孵育温度和时间，以提高特异性和灵敏度。
免疫组化基本原理及操作流程
免疫组化基本原理及操作流程免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的方法，用于检测和定位特定的抗原或抗体在细胞或组织中的存在和分布。
免疫组化的基本原理是利用抗原与抗体之间的高度特异性结合来实现抗原的检测和定位。
免疫组化的基本操作流程如下：第一步：标本处理标本可以是细胞培养物、组织切片、血液等。
在进行免疫组化前，首先需要对标本进行适当的处理，以使得抗原能够得到良好的保存和定位。
处理方法包括固定、脱水、包埋等。
固定是将标本用适当的化学物质处理，使其固定在载玻片上，并保持其原有的形态和结构。
第二步：抗原检测与定位在标本处理完成后，可以开始进行抗原的检测和定位。
这一步需要使用特异性的抗体来与目标抗原结合。
抗体通常通过动物免疫技术获得，即将纯化的抗原注射到动物体内，激发其产生特异性的抗体。
抗体经过收集和纯化后，将其与抗原所在的标本接触，通过抗原与抗体的特异性结合来检测和定位抗原的存在和分布。
第三步：抗体检测抗体检测是免疫组化中至关重要的一步。
通常使用标记抗体来检测抗原的存在和定位。
标记抗体是一种与特定抗体共价结合的物质，它可以通过荧光染料、辣根过氧化物酶、生物素等标记物来实现抗原的检测和定位。
标记抗体通过特异性结合抗原，使得抗原能够在显微镜下观察到，并确定其存在的位置。
第四步：显色与观察在完成抗体检测后，需要进行显色以使抗原能够在显微镜下观察到。
显色方法包括使用荧光显色、暗场显色、免疫酶染色等。
其中，免疫酶染色是最常用的方法，它通过在抗体中添加酶标记物，如辣根过氧化物酶（HRP），再加入适当的显色底物，使其生成可见的色素沉淀。
经过显色后，使用显微镜观察标本，可见到抗原的存在和定位。
第五步：结果分析与解读在观察到显色结果后，需要对结果进行分析和解读。
根据显色的程度和分布情况，可以判断抗原的阳性与阴性。
阳性表示抗原在样品中存在，而阴性则表示抗原在样品中不存在。
结果的解读需要结合临床和实验的背景知识进行综合分析。
免疫组化
免疫组化操作步骤一免疫组化（ LP 法）操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。
如需抗原修复，可在此步后进行2. 缓冲液洗 3min/2 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色, 将切片放在Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。
4. 缓冲液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。
如果一抗的稀释液中含有 5 －10% 正常羊血清，这一步可以省略。
）6. 缓冲液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液37 ℃孵育 1 － 2 小时。
（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 5min/2 次。
9 ．滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。
10 ．缓冲液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。
（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。
）12 ．缓冲液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。
（具体时间由染色深浅决定。
）14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。
二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。
（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)是一种利用抗体与组织中的抗原特异性结合的技术。
它是一种重要的研究方法，可以用于检测和定位组织中的特定蛋白质和其他生化分子。
以下是免疫组织化学实验的一般操作步骤：1.样本处理：a.固定：将待检测的组织样本进行固定处理，以保持其形态结构并保留组织内的抗原。
b.切片：将固定的组织样本切成非常薄的切片（通常为3-5微米厚），并将其放置在载玻片上。
2.抗原解蓝（抗原恢复）：a.对于不同类型的组织样本，选择适当的抗原解蓝方法。
b.抗原解蓝可以通过加热、酶解或其他方法来恢复组织样本中的抗原。
3.阻断非特异性结合：a. 使用一种非特异性的蛋白质来阻断载玻片上未特异性结合的位点，例如牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)或小鼠免疫球蛋白(Mouse IgG)。
b.加入适当浓度的阻断剂，并孵育片玻片上的切片，以阻断非特异性结合位点。
4.主抗体孵育：a.加入含有特定抗原的主抗体溶液，其可以与组织样本中特定的抗原结合。
b.孵育片玻片上的切片，使主抗体与待检测的抗原结合。
5.洗涤：a.用缓冲液或PBS等洗涤溶液洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的主抗体。
6.二抗孵育：b.孵育片玻片上的切片，使辅助抗体与主抗体结合。
7.洗涤：a.再次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的辅助抗体。
8.信号放大：a.可根据需要，使用染色剂或底物来增强或显色识别待检测抗原的结合位置。
b.例如，使用荧光染料或酶底物，通过显微镜观察或光镜观察，可使抗原可视化。
9.洗涤：a.最后一次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的染色剂或底物。
10.封片：a.加入适当的封片剂，如富含丙酮的溶液，将载玻片上的切片封装起来，以保护切片和保存染色结果。
免疫组织化学是一种复杂的实验技术，需要仔细的操作和精确的控制条件才能得到准确的结果。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化（immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用抗体-抗原反应来检测组织中特定蛋白质表达的方法。
它广泛应用于医学研究和临床诊断中，常用于检测肿瘤标志物、免疫细胞浸润和病毒感染等。
I.免疫组化操作规程1.样本处理a.组织固定：将组织标本进行固定，一般使用10%中性缓冲福尔马林进行固定，固定时间一般为24-48小时。
b.去脂化：对于脂肪较多的组织，需要将其进行去脂处理，可使用二甲苯或其他去脂剂进行处理，处理时间一般为20-30分钟。
2.抗原恢复a.热诱导抗原恢复：将固定的组织样本放入蒸汽气锅中，用缓冲液浸泡标本，加热至高压下，进行抗原恢复处理。
具体温度和时间根据样本类型和抗体要求而定。
b.酶诱导抗原恢复：对于抗原蛋白固定后被交联、无法热诱导恢复的样本，可使用酶解剂（如胰蛋白酶）进行抗原恢复。
3.阻断非特异结合a.使用非特异结合阻断剂：在进行免疫染色之前，需要将非特异结合位点进行阻断，可使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼凝胶蛋白（FSG）等，在阻断液中孵育样本。
4.抗体反应a.一抗孵育：将目标抗体（一抗）稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为1-2小时。
b.二抗孵育：选择免疫印迹试剂盒中对应一抗的二抗，将其稀释后，滴加于待检样本上，进行孵育，一般时间为30-60分钟。
5.染色和显色a.底物酶标：使用底物和酶的复合物，进行染色和显色反应。
常用的底物有DAB（二氨基苯），TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等，反应时间一般为5-10分钟。
b.荧光染色：若使用荧光标记的二抗，需进行相应波长的激发光照射，观察荧光信号。
6.降解和清理a.用超纯水洗涤：使用超纯水进行标本洗涤，彻底清除底物和底物残留物。
b.孵育升级脱位溶液：将样本浸泡在脱位溶液中，使特异结合的抗体与抗原分离。
c.用盖玻片封装：涂上透明胶和玻片，使其固定在盖玻片上，并封住。
免疫组化步骤和注意事项
免疫组化步骤和注意事项免疫组化是一种重要的实验技术，用于鉴定细胞、组织或生物样本中特定抗原的分布和表达情况。
它可以通过对特定抗原与抗体的特异性结合来检测目标分子的存在和定位。
下面将介绍免疫组化的步骤和注意事项。
免疫组化的主要步骤包括抗原脱蜡、抗体反应、显色和染色。
1. 抗原脱蜡：免疫组化的第一步是将组织样本或细胞脱脂、脱蜡和重水化，以去除蜡质，并使抗体更容易与目标抗原反应。
2. 抗体反应：将脱蜡的组织样本或细胞块通过抗原修复处理，以恢复抗原的免疫反应性。
然后，将免疫抗体与待检测的抗原反应，形成免疫复合物。
免疫抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以与组织或细胞中的特定抗原高度特异性地结合。
3. 显色：免疫复合物形成后，可以使用标记有酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记的二抗来检测免疫复合物。
在酶法中，可添加草酰胺基苯酸（DAB）或硫代硝基羟基苯并啶（NBT/BCIP）等底物以产生可见的色素沉积。
在荧光法中，免疫复合物被激光器或荧光灯激发后，会发出特定颜色的荧光信号。
4. 染色：完成显色后，可以通过核染色（如用伊红、伊红和伊蓝）来观察细胞核的形态特征，以配合免疫标记物的定位。
虽然免疫组化是一种有价值的技术，但在实施过程中也需要注意一些问题：1. 选择合适的抗体：在进行免疫组化实验时，选择特异性高、效价好的一抗抗体非常重要。
一抗抗体的选择应基于抗原的特异性和病变的病理生理特性。
2. 优化抗体浓度：免疫组化实验中，抗体浓度的选择是关键因素。
过高的抗体浓度会导致非特异性的染色，而过低的浓度则无法检测到目标抗原。
3. 优化抗原修复处理：抗原修复处理对于免疫组化的成功非常重要。
选择合适的抗原修复方法可以增强组织或细胞中的抗原的免疫反应性。
4. 阴性对照和阳性对照：为了验证实验的可靠性，每次免疫组化实验都应包括阴性对照和阳性对照。
阴性对照不包含待检测的抗原，而阳性对照则确保抗体和显色试剂的正常工作。
5. 切片质量：免疫组化实验的结果直接受到切片质量的影响。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤免疫组化操作步骤一免疫组化（法）操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。
如需抗原修复，可在此步后进行2. 缓冲液洗 32 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在中孵育 10-15 分钟。
4. 缓冲液洗 52 次。
5. 滴加V ，在室温下孵育5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。
如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。
）6. 缓冲液洗 52 次。
7. 滴加一抗工作液37 ℃孵育 1 － 2 小时。
（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 52 次。
9 ．滴加 ( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。
10 ．缓冲液洗 52 次。
11 ．滴加 ( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。
（注：对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。
）12 ．缓冲液洗 52 次。
13 ．向 1 ( 或 ) 中滴加 1-2 滴（或） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。
（具体时间由染色深浅决定。
）14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。
二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。
（ 2 ）、 3 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（ 3 ）、蒸馏水冲洗，浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。
滴加一抗工作液，37 ℃孵育 1-2 小时或4 ℃过夜。
（ 5 ）、冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 6 ）、滴加适量生物素标记二抗工作液，37 ℃孵育 10-30 分钟。
（ 7 ）、冲洗， 5 分钟 x3 次。
（8 ）、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育 10-30 分钟。
免疫组化基本操作流程
免疫组化基本操作流程免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平、定位以及相互作用。
以下是免疫组化基本的操作流程：1.组织固定首先，需要对待检测的组织进行固定。
最常用的方法是将组织置于10%的缓冲福尔马林溶液中，通常时间为24-48小时。
这个步骤的目的是保持组织的形态结构和维持蛋白质的空间位置。
2.制作切片将固定的组织切成5-10微米厚度的切片。
通常使用旋转切片机或者冰冻切片技术来进行切片。
切片后将其放置在载玻片上，通常是带有阳离子的载玻片，如聚胺脂涂层载玻片。
3.抗原恢复固定的组织样本通常会导致部分蛋白质的变性，从而减少抗体的结合能力。
为了恢复这些变性蛋白质的免疫原性，可以进行抗原恢复步骤。
这个步骤通常涉及将切片加热到一定温度，使用酶处理或者盐溶液处理。
常用的抗原恢复方法包括热蒸汽煮沸法、酶消化法等。
4.阻断非特异结合在进行抗体结合之前，需要对样本进行非特异结合的阻断。
这个步骤的目的是防止抗体发生非特异性的结合，从而降低假阳性结果的产生。
通常使用牛血清蛋白（BSA）、奶粉或者干酪蛋白等蛋白质来进行非特异结合的阻断。
5.抗体染色接下来，将切片与目标蛋白质特异性的一抗体一起孵育。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体使用什么抗体取决于试验的目的。
抗体与样本中的特定蛋白质结合后，形成抗原-抗体复合物。
6.检测与显色为了检测抗原-抗体复合物的形成，需要进行二次抗体结合。
二抗与一抗结合，并且经常标记有荧光素或着色剂，用以可视化抗原-抗体复合物。
常用的二抗有荧光标记物（如荧光素、荧光染料等）或酵素标记物（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）。
7.盖片封装在检测和显色后，将玻片放在显微镜下进行观察和分析。
可以使用透明封装剂将玻片封装，以保护样本不受污染和光照损伤。
总结：免疫组化是一种重要的实验技术，被广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
它通过特异性抗体的结合能力来检测目标蛋白质的存在、定位和相互作用。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于病理学和生物医学研究中，用于检测和定量分析组织或细胞中特定抗原的方法。
它通过将标记有特定抗体的染色剂与细胞或组织中的相应抗原结合，从而实现对抗原的定位和可视化。
以下是免疫组化操作的详细步骤：准备组织样本：1.选择需要研究的组织样本，可以是固定的组织块、冰冻切片或细胞涂片。
2.如果是固定的组织块，使用福尔马林等适当的固定剂进行固定，并进行脱水和包埋。
3.如果是冰冻切片，将组织冷冻在液氮中，使用微型切片机切割薄片。
4.如果是细胞涂片，将细胞均匀涂布在载玻片上。
脱脂和再脱水：1. 对于固定的组织块和细胞涂片，使用低渗透性石蜡溶液（如xylene）进行脱脂，一般需要多次处理。
2.使用梯度酒精浓度（例如100%，90%，80%和70%）进行再脱水处理，每个浓度的浸泡时间一般为5-10分钟。
抗原修复：1.固定的组织块可使用热诱导抗原修复（如加热高压反应釜中）或酶诱导抗原修复（如2%的蛋白酶）进行抗原修复。
2.冰冻切片和细胞涂片不需要抗原修复。
阻断非特异性结合位点：1.使用一种非特异性抗体，如牛血清蛋白、小鼠和兔血清、杂交小鼠兔血清混合物等，进行阻断非特异性结合位点，减少假阳性反应。
一抗和二抗处理：1.加入特异性一抗，该抗体将结合目标抗原。
一抗的浓度根据实验要求和文献建议进行选择。
2.在室温下，对样本进行适当时间的孵育，以便一抗与抗原结合。
4.加入标记有荧光素或酶素的二抗，如荧光素-同种同型抗体或酶标记的抗小鼠或抗兔免疫球蛋白。
5.孵育样本适当时间，以便二抗与一抗结合。
洗涤：1.使用缓冲液对样本进行洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。
2.洗涤的时间和次数根据实验要求和抗体的特性进行调整。
可视化和显色：1.对于荧光标记的二抗，使用荧光显微镜观察并拍摄图像。
2.对于酶标记的二抗，使用适当的显色物质，如DAB（3,3'-二氨基苯啶）或VIP（维泊酶）等，进行显色反应。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
免疫组化操作步骤
第一节免疫组化操作步骤及抗原修复(供参考)
第二节免疫组化抗原热修复的技术要点(供参考)
(一)、仪器设备
1、18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉、
2、水浴锅
(二)、试剂
1、PBS缓冲液(pH7、2―7、4)
2.0、01mol/L柠檬酸钠缓冲液(CB,pH6、0,1000ml)
3、3%甲醇―H2O2溶液:用30%H2O2与80%甲醇溶液配制
4、风裱剂:a、甘油与0、5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9、0–9、5)等量混合b 油与TBS(PBS)配制
5.TBS/PBS pH9、0–9、5,适用于荧光纤维镜标本;pH7、0-7、4适合光学纤维标本
(三)、操作流程
1、脱蜡与水化:脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟
b 无水乙醇中浸泡五分钟
c 95%乙醇中浸泡五分钟
d 75%乙醇中浸泡五分钟
2、抗原修复:用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片:
抗原修复(免疫组化石蜡切片)
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片需要抗原修复
福尔马林固定的组织有可能破坏了原来组织的抗原结构,蛋白多肽发生交联,导致部分抗原表位封闭,结合位点减少,所以需要抗原修复,以暴露原来的抗原表位,达到充分显露抗原,以不出现明显脱片现象为佳。
抗原修复的几种常用方法(供参考)
1、微波炉加热:在微波炉里加热0、01枸橼酸钠缓冲液(pH6、0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5-10分钟,反复1-2次。
根据玻片情况可参考采用微波加热“3-5-3法”3分钟温火沸腾后静止5分钟,再温火沸腾3分钟即可。
适用的抗原:来源于人、大鼠、小鼠的组织标本;来源于其她动物种属的组织标本:
2、沸热修复: 电炉或水浴锅加热0、01M枸橼酸钠缓冲液(pH6、0)至95℃左右,放入组织芯片加热10-15分钟。
3、高压热修复:在沸水中加入EDTA(pH8、0)或0、01m枸橼酸钠缓冲溶液(pH6、0)、盖上不锈钢锅盖,但不能锁定。
将玻片置于金属染色架上,缓慢加压,使玻片在缓冲液中浸泡五分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。
10分钟后除去热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。
此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
(骨及软骨组织的标本最好选择较温与的微波加热修复)
4、酶消化方法:
常用0、1%胰蛋白酶与0、4%胃蛋白酶液。
胰蛋白酶使用前预热37℃,消化时间约为5-30分钟。
适用于被固定遮蔽的抗原:
包括Collagen、GFAP、Complement、Cytokeratin、c-erB-2、LCA、LN、等
石蜡切片免疫组化染色步骤
1、三步法(以SP试剂盒为例)
●石蜡切片脱蜡至水。
●蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,如果采用抗原修复,可在此步后进行。
●3%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2分钟×3次。
●5~10%正常山羊血清封闭,室温孵育10分钟。
倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
●PBS冲洗,2分钟×3次。
●滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。
●PBS冲洗,2分钟×3次。
●滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。
●PBS冲洗,2分钟×3次。
●显色剂显色(DAB或AEC)。
●自来水充分冲洗,复染,脱水透明、封片。
●如果必要,可选用avdin封闭内源性生物素。
2、SABC法
(1) 脱蜡、水化
(2)PBS洗2次各5分钟
(3)用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2,室温封闭5-10分钟,用蒸馏水洗3次
(4)抗原修复
(5) PBS洗5分钟
(6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体
(7)滴加Ι抗50ul,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
(8)PBS洗3次各2分钟
(9)滴加生物素化Ⅱ抗,20℃-37℃20分钟
(10)PBS洗3次各2分钟
(11)滴加试剂SABC 20℃-30℃20分钟
(12) PBS洗4次各5分钟
(13) DAB显色:试剂盒或自配显色剂显色
(14)脱水、透明、封片、镜检。
冰冻切片的免疫组化染色步骤
●速冻组织
●冰冻切片4~8μm,冰冻切片后如不染色,必须吹干,储存低温冰箱内,或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。
●室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟。
也可根据需要选择其她的固定方式。
●PBS冲洗,5分钟×3次。
●用3%过氧化氢孵育5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。
●PBS冲洗,5分钟×3次。
●下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤(滴加一抗开始)。
第二节免疫组化抗原热修复的技术要点(供参考)
1、抗原热修复温度与时间的关系
我们日常工作中所使用的组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间的亚甲基发生桥连,具体过程如下:
第一步基本反应福尔马林与氢反应形成新的化合物
第二步基本反应福尔马林与氢反应形成新的亚甲基桥
上述反应的结果导致许多抗原决定簇被封闭,而加热可以水解该桥连使抗原被激活。
影响抗原热修复的两个最关键的因素就是温度与时间,有人将这两种因素对抗原修复的影响总结为下面的公式:
抗原热修复的有效性=加热温度(T) ×加热时间(t)
也就就是说当我们修复时的温度越低则需要修复的时间就越长;反过来当修复温度增高时修复的时间可以适当地缩短,才能使抗原决定簇完全暴露,这种反比的关系从MBI单克隆抗体的实验结果表1中也可以清楚地瞧出。
时间与温度对染色的影响
时间(分钟)
100℃80℃60℃
5×2 + + + ――
5×6 + + + + + + + ―
5×10 ― + + + + +
10小时―― + +
如果修复强度不够,免疫组织化学染色所显示的只能就是修复后暴露的部分抗原决定簇,而不就是组织所含的全部抗原。
这样的染色结果可能会非常弱,或出现假阴性,即使就是阳性结果,充其量只能起到定性的作用,不能适应今后对免疫组化进行定量的需要。
这就给我们诊断中定量指标的应用带来困难,例如用来测定耐药的指标。
2、组织固定时间与所需的抗原热修复的关系
大量的实验表明,固定时间越长的标本,它所形成的桥连就越紧密,抗原就越难以被激活,所需要的修复强度也就越强。
有意思的就是随着固定时间的延长,组织中蛋白对温度的耐受也相应增高(如图1所示),这可能就就是我们对固定时间长的标本加大修复强度的理论基础。
固定时间与变性的关系
这就提醒我们在做回顾性的研究时一定要注意所使用的修复条件,它与新鲜标本的修复条件一定就是有所区别的,同等条件下一定要加长修复的时间或提高修复所使用的温度,才可能得到比较满意的结果。
3、不同PH值抗原修复液对染色结果的影响
抗原热修复中所使用的修复液PH值也会对染色结果产生相当大的影响。
PH值对染色结果的影响大概可以分为以下四种情况。
A―稳定型,PH值对染色结果影响不大,如PCNA、AE1、EMA、CD20等。
B―V型,高PH值与低PH值染色较好,而PH值4-5染色结果较差,如ER、Ki-67等。
C―上升型,随着PH值的增加,染色结果逐渐增强,如HMB45等。
D―下降型,随着PH值的增加染色结果逐渐减弱,当然这种类型的抗体只就是个别的现象,如MOC31。
一个有趣的现象值得注意,即在高PH值都有较好的染色结果,所以目前比较推崇的抗原修复液为高PH值得修复液,如1mMEDTA, PH8、0或PH9、0等。
但就是由于传统习惯,绝大多数医院与实验室都在使用PH6、0的枸橼酸缓冲液。
综合以上各种抗体的染色状况,考虑到临床工作的实际情况,许多国外免疫组化专家建议,在常规的免疫组化工作中,全部选用高PH值得修复液来代替目前广为使用的PH6、0枸橼酸缓冲液。
为此,本公司已经推出PH8、0与PH9、0的新型抗原修复液。
经验证,绝大多数的抗体使用PH9、0得修复液效果都要优于PH6、0的枸橼酸,尤其就是核阳性的抗体。
所以,在常规的免疫组化工作中,使用高PH值的抗原修复液就是今后的必然趋势。
4、抗原热修复的手段
微波炉修复与高压锅修复的比较
温度压力 v时间受热
微波炉 100℃ 1P 15~20分钟不均匀
高压锅120℃ 1、2P 喷气2分钟均匀
目前抗原热修复所采用的方法主要有微波炉修复与高压锅修复两种,从表中可以瞧出,由于高压锅修复具
有温度均一、节省时间、效果稳定等特点,已经越来越受到人们的青睐。