植物同工酶凝胶电泳实验
实验五 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验五聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、目的同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
研究表明，植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验要掌握电泳技术的原理、方法、装置、凝胶配制等知识，熟悉主要的操作过程，同时对同工酶有一个感性的认识。
二、原理1．电泳带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
近几十年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。
用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。
2．影响电泳的主要因素若将带净电荷q的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力F引可用数学式表示如下：F引＝E·q（1）式中E为电场强度，单位为“v/cm”，表示电场中单位距离上的电位差。
如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。
但在溶液中，由于电场的牵引力F引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F阻相对抗。
故上述现象不会发生。
根据Stokes公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及所在介质的粘度：F阻＝6πrηv (2)式中F阻是球形粒子所受的阻力，r是球形粒子的半径，η是溶液的粘度，v是粒子移动的速度。
植物过氧化物酶同工酶组丙烯酰胺凝胶圆盆电泳
华南农业大学实验报告专业班次 11农学一班组别201130010110题目植物过氧化物酶同工酶组丙烯酰胺凝胶圆盆电泳姓名梁志雄日期【实验原理】过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶，植物体内许多的生理代谢涡阳与过氧化物酶及其同工酶的种类有关，本实验用加有蔗糖的缓冲溶液作为缓冲剂，提取甘蔗叶片中的过氧化物酶同工酶，锁甲的蔗糖是为了增加样品液的相对密度，使点样时能让样品平铺于凝胶表面，有防止其扩散的作用，利用过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化为蓝色或棕色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有过氧化氢及联苯胺的溶液中染色，有色部位即为过氧化物酶在凝胶中存在的位置，从而得到过氧化物酶同工酶酶。
【实验仪器和用品】1、实验仪器圆盆电泳槽、直流稳压电泳仪、离心机、恒温水浴锅、脱色摇床、研钵、电子天平2、实验用品烧杯、吸管、试管、试管架、玻璃棒、滴管、微量注射器、长针头注射器、培养皿、洗耳球、蒸馏水瓶、移液枪、大漏斗、滤纸、试剂瓶、烧杯、量筒、离心管、标签纸、PH试纸。
【实验材料和实验试剂】1、实验材料甘蔗叶片2、实验试剂样品提取缓冲液、0.5%（m/V）溴酚蓝、凝胶储备液A、凝胶储备液B、凝胶储备液C、电极缓冲液、POD 同工酶染色储存液。
【实验步骤】1 .凝胶柱的制备将凝胶贮备液 A 、 B 及水按 1 ： 2 ： 1 的比例混合于烧杯中，另量取 4 份的 C 液于另一烧杯中、即A液3ml、B液6ml、C液12ml，。
当准备好带有玻珠乳胶管封底的玻璃管后，可把两烧杯中的溶液混合，轻搅均匀，用长滴管沿玻管壁小心加到玻管中。
胶液应灌到离管口约 3mm 处。
用手指轻弹管壁，将管中胶液可能混有的气泡赶出，然后用滴管在胶液面上小心注入一层 3mm 蒸馏水，以防胶凝结时表面形成弯月面并隔绝空气。
当见到水层与胶液交界处有一清晰界面时，表明胶已聚合。
2 .样品的制备称取 0.5g 甘蔗叶片，加入 2 ~5毫升提取缓冲液，于研钵中研磨成浆状。
同工酶检测方法
同工酶检测方法
同工酶检测方法是一种用于确定酶活性和酶的存在性的常用实验技术。
同工酶是指具有相似化学结构但在酶活性和功能上有差异的酶。
通过检测同工酶的存在和活性，我们可以了解酶的功能差异和其在生物体内的重要作用。
同工酶检测方法主要包括以下几种：
1. 凝胶电泳法：这是最常用的同工酶检测方法之一。
通过将样品中的酶进行凝胶电泳分离，然后在凝胶上加入适当的底物和染色剂，可以观察到酶的活性带和相应的颜色变化。
根据活性带的位置和颜色变化，可以确定酶的存在和活性差异。
2. 免疫学方法：同工酶也可以通过免疫学方法进行检测。
这种方法利用特异性抗体与酶结合，形成免疫复合物，然后通过染色或荧光标记的抗体检测酶的存在和活性。
这种方法具有高灵敏度和高特异性，适用于复杂样品的检测。
3. 分子生物学方法：随着分子生物学技术的发展，同工酶的检测也可以通过PCR、测序和基因表达等方法进行。
这些方法可以直接检测目标酶基因的序列差异或转录水平的变化，从而确定不同同工酶的存在和表达差异。
除了以上常用的方法外，还有一些新兴的技术被应用于同工酶的检测，例如质谱分析、表面等离子共振和生物传感器等。
这些方法具有高灵敏度和高通量的特点，可以快速、准确地检测同工酶的存在和活性。
总之，同工酶检测方法在生物学研究和临床诊断中起着重要的作用。
不同的方法可以根据研究目的和样品类型选择使用，从而更好地了解同工酶的功能和生物学意义。
同工酶凝胶电泳
*表的行数根据情况可以调整。
@写出检测同工酶的原理。
一级带
带型绘制方法 二级带 三级带 四级带 一级带
二级带
三级带 四级带
同台两组共用一电泳槽。 注入两玻璃夹缝中，胶面上加1cm蒸馏水（自 然凝胶后倾出）。
本次实验涉及： 酯酶（Est）: 催化酯类化合物水解的酶系. 催化乳酸脱氢反应的酶.
乳酸脱氢酶(LDH):
过氧化物酶（PO）：催化过氧化物水解 应用： 1) 遗传育种 2）基因定位 ……
同工酶分析的过程
材料的采集 低温研磨、酶提取 凝胶制备 酶的保存
专一底物和特殊染料染色进行分析。
为节省时间，先做：架好胶板
电泳原理介绍 教师分头指导操作
配制分离胶（7.5%）（两组的量）：
双蒸水/mL 1.5mol/LTris· HCl（pH8.8）/mL Acr/Bis（30%）/mL TEMED/μL 10%Aps/μL 总体积/mL
9 mL 5 mL 5 mL 20 μL 100 μL 20 mL
染色约20分钟。
PO染液[第3桌配，60mL]
联苯胺 冰乙酸
1.0 g 9.0 mL
溶，可研磨
水
A液
36 mL
5.4 mL 0.6mL
A液
30% H2O2 水 54mL
混合成为染色液
染色5~10分钟，水洗停止反应。
五、方法步骤（合理分工、协调时间）
1. 提取酶液
每份材料（普通果蝇40只、大果蝇10只、或其他材料0.2g）
活性电泳
催化底物水解，染料复合显色酶谱的记录与分析带的位置，酶分子量差异、带的颜色深浅(反映酶的活性)
LDH染色原理
乳酸 LDH 丙酮酸 NADH NAD+ NBT(黄) PMS（氢递体） NBTH(蓝紫)
用凝胶电泳法研究小麦叶片衰老期间的内肽酶同工酶
用凝胶电泳法研究小麦叶片衰老期间的内肽酶同工酶芮琪,徐朗莱3(南京农业大学理学院,江苏南京210095)摘要:采用S DS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS PAGE )和梯度凝胶电泳方法,研究了小麦旗叶暗诱导衰老过程中内肽酶同工酶的变化。
发现用S DS PAGE 法几乎检测不到新的内肽酶同工酶;用梯度凝胶电泳法则能检测到6种新的同工酶,而且在第一叶自然衰老过程中也能检测到。
表明在这两种衰老过程中内肽酶酶谱变化基本相似。
关键词:内肽酶;小麦叶片;暗诱导衰老;自然衰老;梯度凝胶电泳中图分类号:Q556+19 文献标识码:A 文章编号:10002030(2002)03008504The endopeptidase isozymes in wheat leaf duringsenescence by electrophoresisRUI Qi ,X U Lang 2lai 3(C ollege of Science ,Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China )Abstract :The changes of endopeptidase (EP )in wheat (Triticum aestivum L.cv.Y angmai 158)leaves were studied during dark 2in 2duced senescence by electrophoresis.S ix emerging EP is ozymes were detected by gradient 2PAGE ,which were als o detected during natural senescence.And the patterns of EP is ozymes were similar in these tw o kinds of senescence.But no emerging EP was detected by S DS ΟPAGE.K ey w ords :endopeptidase ;wheat leaf ;dark 2induced senescence ;natural senescence ;gradient gel electrophoresis衰老是叶片的一个重要发育阶段,蛋白质的丧失是叶片衰老的主要特征之一[1]。
实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳
（三）电泳 1.安装电泳槽： 向电泳槽下槽加入 适量甘氨酸－Tris电 泳缓冲液。去掉玻 璃管下端的封口膜， 将玻璃管固定在电 泳槽上，阴极在上， 阳极在下。
2.点样： 取样品50μL，蔗糖 －溴酚篮50μL, 混匀， 加入玻璃管中。加缓 冲液至浸没过玻璃管 上端口及电泳槽上盖 的电极。排除玻璃管 下端口的气泡，连接 好电泳仪。
为了提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率, 通常采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，即在 分离胶上面加一层浓缩胶，因浓缩胶和分离 胶中的离子成分、pH、凝胶浓度不同，电泳 开始后，由于浓缩效应,较厚的样品层可以被 浓缩的很薄，使电泳具有良好的分辨率。
过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。 它能催化H2O2将联苯氨氧化成蓝色或棕褐 色产物。因此，将经过电泳后的凝胶置于 H2O2-联苯胺溶液中染色，出现蓝色或褐色 的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在 的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工 酶的酶谱。
4.制备大孔胶（浓缩胶） 取2个小烧杯，按照B:D:E:F等于
1:1.5:1:4的比例，分别取B液、D液和E液置 于一小烧杯中，混匀；F液置另一小烧杯中， 抽气。将2个小烧杯内的液体轻轻混匀加至小 孔胶上面1cm高度，仔细地向表面加一层水。 25～35℃聚合20～30min，聚合后的大孔胶 呈乳白色。仔细吸去表面的水。
（四）染色：
临用时配制染色液：（10 ml ）
联苯胺母液
0.5 ml
H2O
9.3 ml
3% H2O2
0.2 ml
将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过
胶条）。约10min后用自来水冲洗。
（五）记录并计算：
观察、记录酶谱，并 计算各同工酶的相对 迁移率。
【要点提示】
1. 分离胶聚合时间应控制在30～60min，聚合过 快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或TEMED过 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或 TEMED用量不足或已失效。
香菇同工酶电泳流程
香菇同工酶电泳流程一、准备工作。
咱要做香菇同工酶电泳呀，那准备工作可不能马虎呢。
就像出门要带齐东西一样，这里需要好多材料和仪器呢。
首先得有香菇的样本，这是主角。
然后就是电泳设备，像电泳仪、电泳槽这些，它们就像是舞台，让咱们的同工酶在上面表演呢。
还有凝胶的相关材料，什么琼脂糖或者聚丙烯酰胺呀，这是用来给同工酶打造跑道的。
再有就是一些缓冲液，就像是给这个小世界调节酸碱度的魔法药水。
另外，别忘了微量移液器这些小工具，它们可是精确的小助手，帮助我们取合适量的样本和试剂呢。
二、样本处理。
有了材料，就该对香菇样本下手啦。
把香菇取来，咱不能整个就丢进去呀。
要把它弄成合适的小碎块或者提取出细胞里的东西来。
这就好比是从一个大包裹里把我们想要的宝贝挑出来一样。
可以用一些特殊的方法，像是研磨或者用特殊的溶液浸泡，让里面的同工酶乖乖地出来。
这个过程得小心点儿，要是太粗暴了，可能会把同工酶给弄伤了，那就不好玩了。
处理好的样本呢，要放在合适的容器里保存好，就像把小宝贝放在小盒子里一样，等着下一步的操作。
三、凝胶制备。
接下来就是做凝胶啦。
如果是琼脂糖凝胶呢，就把琼脂糖粉末取出来，按照一定的比例和缓冲液混合。
这个比例可不能乱调，就像做菜放盐一样，多了少了都不行。
然后把它们放在微波炉或者热水浴里加热，让琼脂糖完全溶解，这时候就像做糖稀一样，看着它慢慢变成透明的液体，还挺好玩的呢。
要是聚丙烯酰胺凝胶呢，过程就稍微复杂点儿，要把各种成分按照顺序和比例混合好，而且这个东西还有点小脾气，混合的时候要快，不然它可能就开始凝固了，那就前功尽弃啦。
做好的凝胶液呢，要小心地倒入电泳槽里，等它凝固，这就像是给同工酶建好了跑道，就等着它们上场啦。
四、加样。
凝胶好了，就该把我们处理好的香菇样本加进去啦。
用微量移液器吸取合适量的样本，这个量真的要很精确哦，就像给小朋友喂药一样，多一点少一点都可能影响结果呢。
把样本加到凝胶的小孔里，就像把小种子种到小坑里一样。
实验六：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶实验报告
班级：植物142 姓名：刘国强学号：1401080229实验六：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工一、研究背景及目的同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
它们是DNA 编码的遗传信息表达的结果。
研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼叶叶片和根部的过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有的操作过程二、实验原理本实验采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，分离小麦幼叶叶片和根部的过氧化物酶同工酶。
利用过氧化物酶在分解过氧化氢的过程中产生自由氧基，从而将联大茴香胺连接到过氧化物酶分子上，使之呈现棕褐色，将电泳后的凝胶置于含有过氧化氢的联大茴香胺染色液中浸泡，有过氧化酶同工酶蛋白的部位便可以观察到褐色的谱带。
通过这些谱带的数量、位置等获得相关信息。
三、仪器试剂1．实验材料小麦幼苗2．仪器:垂直板电泳槽(型号：DYY-III28A型电泳槽厂家：北京市六一仪器厂) 电泳仪（型号：DYY-III2稳压稳流电泳仪厂家：北京市六一仪器厂）主要器具：移液器、微量进样器、培养皿一套（直径15cm）、小烧杯3.试剂（1）分离胶缓冲液(pH8.9 Tris-HCl缓冲液)：称取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。
同工酶实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 理解同工酶的概念及其在生物体中的生物学意义；2. 掌握同工酶电泳技术的基本原理和方法；3. 通过同工酶电泳实验，观察和分析同工酶在样品中的分布情况。
二、实验原理同工酶是指具有相同催化功能，但氨基酸序列和分子结构不同的酶。
同工酶电泳技术是一种分离和鉴定同工酶的方法，其原理是利用同工酶在电场中的迁移速率差异，将其分离。
三、实验材料1. 实验样品：植物叶片、动物组织等；2. 电泳试剂：琼脂糖、溴酚蓝、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等；3. 电泳仪器：电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统等；4. 其他：移液器、吸管、剪刀、镊子等。
四、实验方法1. 样品制备：将实验样品研磨，加入适量提取液（如Tris-HCl缓冲液），在冰浴中匀浆，离心取上清液；2. 电泳凝胶制备：按照电泳试剂的配方，制备琼脂糖凝胶；3. 电泳样品制备：将提取液加入适量的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，混合均匀后，加入适量的样品，制成样品胶；4. 电泳：将制备好的样品胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，进行电泳；5. 成像与分析：电泳结束后，取出凝胶，用凝胶成像系统拍照，分析同工酶的分布情况。
五、实验结果1. 通过电泳实验，观察到样品中存在多种同工酶；2. 不同样品的同工酶分布情况存在差异，说明同工酶在生物体中具有特异性；3. 同工酶的迁移速率与酶的分子量有关，分子量较小的酶迁移速率较快。
六、实验结论1. 同工酶在生物体中具有重要作用，其生物学意义包括催化、调控、信号传递等；2. 同工酶电泳技术是一种有效的分离和鉴定同工酶的方法；3. 本实验成功分离和鉴定了样品中的同工酶，为后续研究提供了基础。
七、实验讨论1. 实验过程中，样品制备和电泳操作应注意无菌操作，以避免污染；2. 电泳条件的选择对同工酶的分离效果有较大影响，应根据实验目的和样品特点进行优化；3. 同工酶的研究有助于揭示生物体的遗传、变异和进化规律。
八、实验总结本实验通过同工酶电泳技术，成功分离和鉴定了样品中的同工酶，验证了同工酶在生物体中的生物学意义。
植物过氧化物酶同工酶测
植物过氧化物酶同工酶测定
（园盘式凝胶电泳法）
一、原理
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)和交联 剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合而 成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶 浓度和交联度加以调节。凝胶电泳兼有电荷效 应和分子筛效应。被分离物质由于所载电荷数 量、分子大小和形状的差异，在电泳时会产生 Desig不ned b同y XK的Wan泳g 动速率而相互分离。
（四）点样 Designed（by X五K W）an电g 泳
5
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（六）剥胶 电泳完毕，将电泳槽取出，倒去缓冲液，取下凝胶
管，放入培养皿中。用一个带有长针头的注射器，吸满 水，将针头沿管壁插入，同时慢慢地将注射器中的水推 出，并不断转动凝胶管，将凝胶管挤脱出来。 （七）染色
1
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶， 植物体内许多生理代谢过程受其同工酶的种 类及活性的调节。同工酶具有不同的迁移速 度。
将电泳后的凝胶置于含有H2O2及联苯胺 的溶液中染色，利用过氧化物酶催化H2O2分 解并把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原 理，出现的蓝色或棕褐色条带即为过氧化物 酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带 Designe即d by构XK W成ang过氧化物酶同工酶酶谱。
4.四甲基乙二胺(TEMED)。 5.电极缓冲液：Tris6.0g，Gly（甘氨酸） 28.8g，用水定容至1000mL(pH8.3)，用前稀释 10倍。 6. 3% H2O2。 7. 联苯胺染色母液：联苯胺1g + 冰醋酸 18mL+ H2O 2mL溶解后贮于棕色瓶中。 8.同工酶染色液：配后立即使用。取0.5mL 联苯胺母液 Designed by XK Wang + 9.3mL H2O +0.2mL 3% H2O2。
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验指导
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳【目的】1．掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作过程。
2．了解聚丙烯酰胺圆盘电泳的实际应用，利用此法分离植物过氧化物同工酶。
【概述】1．聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支承物的一种电泳技术。
其凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构。
凝胶网孔的大小可通过改变单体浓度和交联剂浓度的比例加以调节，常用的所谓标准凝胶是指含丙烯酰胺7%～7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能达到满意的结果。
聚丙烯酰凝胶电泳过程中除了一种电泳所具有的电荷效应外，还具有“分子筛”效应；不连续的凝胶电泳过程中具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
不连续凝胶电泳体系的不连续性体现在：（1）凝胶由上、下两层组成，两层胶孔孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH 值不同。
如常用的碱性系统中，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl 缓冲液，分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这种不连续的系统中有三种物理效应起作用，使样品分离效果好、分辨率高。
这三种效应是电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
① 电荷效应 由于各种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而在一定电场作用下迁移率不同。
承载有并效电荷多的，泳动的快，反之则慢。
CH 2CH C=O NH 3CH 2=CH C=O NH CH 2NH C=O CH 2+CH 2CH C=O NH 3CH 2CH C=O NH 3C=O NH CH 2NH C=O CH 2CH 2CH [[]]nn 催化剂② 分子筛效应 因为聚丙烯酰胺具有网孔结构，所以直径大，形状不规则的分子，电泳时通过凝胶受到的阻力大，移动较慢；分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力小移动较快。
酯酶同工酶电泳技术
酯酶同工酶电泳酯酶是催化酯类化合物水解的酶系，目前已发现的酯酶至少有20种。
植物酯酶同工酶的分离技术多采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，主要操作步骤介绍如下。
一、试剂按表1配制贮液和工作溶液---表1 贮液和工作溶液配制用量注：贮液放在冰箱中一般可保存1～2月，3号贮液只能保存1周。
Acr=丙烯酰胺，Bis=甲叉双丙烯酰胺，TEMED=四甲基乙二胺，Tris=三羟甲基氨基乙烷。
二、制胶1、由于电泳槽的构造因厂家不同而有所差异，可按电泳槽所附说明书组装好胶板。
2、按上表配制好分离胶工作液，快速混匀，立即用带长针头的注射器吸取一定量的胶液，沿着玻璃板壁加入胶板间，至板顶3cm即可；然后沿着玻璃板壁缓慢加入3～5mm蒸馏水层。
刚加水时看出有界面，后逐渐消失；等到再看到界面时表明凝胶已经聚合（一般约30分钟）；再静置30分钟使聚合完全。
3、用注射器吸去分离胶上的水层，用滤纸条吸去残留的水液。
按上表配制好浓缩胶工作液，快速混匀，立即用带长针头的注射器吸取一定量的胶液，沿着玻璃板壁加入胶板间以冲洗分离胶的顶部。
迅速吸出，立即灌注浓缩胶，当灌至凹型玻璃口3mm处停灌，立即插入样品梳，使凝胶液面高出玻璃1～2mm。
然后在距日光灯管10cm处照射进行光聚合。
当看到浓缩胶显乳白色（一般6～7分钟），表明聚合开始。
继续半小时，使聚合完全。
三、电泳1、样品提取取烟苗0.2克，加0.5毫升提取缓冲液（含0.075M Tris-HCl，pH7.5，0.01M KCl，0.01M MgCl，0.001EDTA，5%蔗糖，0.1%巯基乙醇，5%PVP-2聚乙烯基吡咯烷酮），冰块上研磨成匀浆，低温下12000rpm离心15分钟，取上清液置于冰箱中备用。
提取缓冲液种类较多，这里介绍的提取缓冲液本实验室曾采用过，可据需要参看其他提取方法。
2、点样拔出样品梳，吸取样品槽中的水分。
用微量移液器加入适量样品液（一般50微升左右）。
用移液器缓慢加入电极缓冲液，以覆盖样品。
植物过氧化物酶提取及电泳
菜心的花和叶的过氧化物酶的提取、活性测定及同工酶的凝胶电泳分析广州大学生命科学学院洪韬文生物工程1121114200044摘要：本实验分两部分，1：过氧化物酶的提取，:用考马斯亮蓝试剂进行酶液蛋白质浓度的测定，根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量；2：:通过过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法），测出的OD值计算出酶活性数值，接着对同工酶的凝胶电泳分析，使它在胶柱上呈现同工酶谱，得出最终实验结果，通过数据记录和拍照记录最终结果。
关键字：过氧化物酶蛋白质OD值同工酶凝胶电泳前言：本实验是在完成基础生物化学实验以后，学生综合运用已经学过的生物化学实验理论和已经掌握的生物化学实验技术进行的一项综合性设计性实验，也是对学生实验动手能力的一次较全面的检验。
POD是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子需与血红素结合才构成全酶。
参与植物POD血红素的合成部位可能象动物一样是在线粒体上。
POD 是一种氧化还原酶，它是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，POD广泛存在于植物体内，是一种活性较高的一种酶，它与植物的呼吸，光合作用以及生长起着很大的作用。
材料和方法：材料：菜叶，菜花方法：1.植物POD的提取分别称取菜心的花和叶各1~2克，然后剪碎，分别放入研钵，向研钵中加入少许石英砂和3ml KH2PO4，快速研磨，后分别加入离心管中进行离心，离心条件为8500rpm，时间为15分钟。
离心完毕后取上清液，并定容至10ml（刻度试管），***此液即为POD提取液，取5ml冷冻保存，作为电泳的POD样品。
2.蛋白浓度的测定—考马斯亮蓝法标准曲线的制定制作标准曲线回归方程：Y(含量)=aX(OD595值) + b，得出相关系数R2。
3.样品蛋白浓度的测定根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量。
4.过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法）备好酶液，将分光光度计调到470nm，取光径1厘米的比色杯2只，向对照杯加反应混合液2.0 ml，KH2PO4 0.5ml，校零点。
植物同工酶凝胶电泳实验
植物同工酶凝胶电泳实验一、实验目的和意义同功酶专指受遗传体系决定的酶的不同分子形式。
从作用上看，分子形式不同的酶能做一样的工作，即催化同样的生化反应，所以把同功酶改称为同工酶。
由于蛋白质分子的结构归根结底是由基因的DNA分子结构决定的，因此，同工酶就成为鉴定生物基因型是否有差别的可靠指标，在遗传育种，生长发育，物种起源，生理卫生等领域的研究中成为一种重要的工具；此外，同工酶还与植物抗性有一定联系，可用来鉴定抗性的强弱。
本实验的实验目的主要是让学生掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物同工酶的原理及方法、步骤。
提高学生的实际操作及动手能力。
培养学生对实验结果的分析能力。
二、实验原理带电粒子在电场中向带有相反电荷的电极移动，叫做电泳。
在一定的pH条件下，每一种分子都具有一定的电荷、大小与形状，在相同的电场经一定时间的电泳，便会集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。
不同组分的蛋白质（包括同工酶）分子组成、结构、大小、形状均有所不同，在溶液中所带的电荷多寡不同，在电场中的运动速度也不同。
因此经过电泳便会分成不同的区带。
然后用适当的染料着色，这样就可以在凝胶上展现出蛋白质或同工酶的谱带。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法。
它是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶。
当Acr 和Bis遇到自由基时，便能聚合。
Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。
三、材料新旧小麦种子、锦带花上下枝叶片四、实验器材与试剂1.器材：电泳仪一套（稳压电源，垂直电泳槽和凹槽玻璃）；台式高速离心机；烧杯；微量进样器；注射器；皮头滴管；刻度吸；培养皿（染色用）。
2.试剂：丙烯酰胺（Arc）；甲叉丙烯酰胺（Bis）；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵（AP）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；甘氨酸（Gly）；琼脂粉；溴酚蓝；甘油；联苯胺；醋酸；α-醋酸萘酯；β-醋酸萘酯；牢蓝RR盐；冰醋酸。
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验八聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４掌握过氧化物酶的活性的测定。
二实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N－甲叉双丙烯酰胺Bis）在加速剂（N,N,N',N'－四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺(NH4)4S2O8 简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMDA）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：①AP-TEMED 属化学聚合作用②核黄素－TEMED 属光聚合作用２凝胶孔径的可调性及其相关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比：a:b<10 脆硬乳白交联度：a:b>100糊状易断②凝胶浓度与孔径的关系T（Acr和Bis总浓度）增加孔径减小移动颗粒穿过网孔阻力增加③凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加阻力增加移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。
实验三_植物叶片过氧化物同工酶的PAGE分析
光聚合：使用核黄素作催化剂，聚合反应需光照， 适用于制备
浓缩胶(大孔胶)。 应控制AP和TEMED的用量，使凝胶在40min-1hr之间聚合完全 为宜。
2.2.2 凝胶孔径的可调性及其有关性质
(1)凝胶性能与总浓度及交联度的关系： T%（Acr和Bis总浓度）= (a+b)/m× 100 C% (交联剂百分比) = b/(a+b) × 100 其中，a= Acr克数，b= Bis克数，m=缓冲液体积（ml） 欲制备完全透明而又有弹性的凝胶， 应控制a/b=30左右。 经验公式: C = 6.5 － 0.3 T
(5) Tris-Gly电极缓冲液 pH8.3
注意：Acr和Bis是对中枢神经系统有毒的试剂，操作时应避免直接接触和吸 入它的粉末。
(6)
40% 蔗糖溶液(W/V)。
(7) TEMED(浓度≥98%)
(8) 0.14% 过硫酸胺（AP）： 4℃贮存仅能用一周，最好当天配制。
(9) 0.1%溴酚蓝指示剂
这类酶存在于生物的同一属、种、变种，或同一个体的不同组织、 细胞中，因而，可以通过对它们的分析，并以其多态性作为遗传 标记，研究种质资源的亲缘关系、重要性状的同工酶表现等。例 如，人们用脂酶同工酶酶谱的特异性，鉴定了近缘野生莴苣 （Lactuca serrila）与莴苣栽培种（L. sativa）的亲缘关系，以及 南瓜属三个主要栽培种的亲缘关系。但是，同工酶在同一物种、 同一个体的不同生长发育时期，其表现是不一样的，有一些同工 酶的重现性较差，应用中也应当注意。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
(10) 联苯胺染色母液：联苯胺1g + 冰醋酸18ml + H2O 2ml溶解储于棕色
瓶中。 注意：（1）联苯胺的毒性很强，其固体和蒸气都能通过皮肤迅速进 入体内，引起恶心、呕吐，损害肝和肾脏。联苯胺及它的盐都是致癌 物质。 （2）联苯胺染色液要当天配制。
实验十二 药用植物过氧化物酶同工酶分析及活性比较
实验十二药用植物过氧化物酶同工酶分析及活性比较一、实验原理蛋白质和酶都是生物体遗传物质——染色体结构基因 DNA 的初级或次级产物，可以看做是结构基因的一种外部标记物。
不同种乃至不同变种的生物不但外部形态有变异，由于结构基因的差别，其表达产物酶和蛋白质也必然存在着一定的差别。
所以同工酶分析作为一种遗传分析手段已广泛应用于品种资源调查、杂交子代测定、种子纯度鉴定等农林业各个领域，在指导生产方面发挥了很大的作用。
此外，同工酶分析对研究不同产地、不同种属生物间的亲源关系和开发利用药植物资源方面也有积极的意义。
本实验采用聚丙烯酸胺凝胶电泳分析比较过氧化物同工酶，并用愈创木酚法测定其活性。
二、实验器材和试剂1 、电泳所用试剂同“常规聚丙烯酸胺凝胶电泳”。
2 、测活试剂：愈创木酚、联苯胺、冰乙酸、乙酸钠、硫酸锰、过氧化氢。
三、实验方法1 、样品液制备：取材料茎部 1g 加两倍冷纯净水，在冰箱预先冷却的研钵中充分研成匀浆，然后离心（ 3 500r/min ， 20min ），加等体积甘油和少许溴酚蓝指示剂即可。
2 、凝胶制备（按“常规聚丙烯酸胺凝胶电泳”），加样量 40μl/ 孔，电压 180V ，电泳时间 2.5~3h 。
3 、染色： 0.5g 联苯胺溶于 250ml 10 ％冰乙酸，配成联苯胺母液。
1.5g 愈创木酚溶于 250ml 10% 冰乙酸，配成母液。
染色液为 100ml 0.2mol/L 乙酸钠溶液， 10ml 5mmol/L 硫酸锰溶液， 25ml 联苯胺母液， 40ml 愈创木酚母液， 25ml 0.12 ％过氧化氢溶液（临用前配制）。
凝胶洗出后转移至染色液中，37 ℃恒温下放置 30min ，显色后，置 7 ％乙酸中保存，绘图或照相。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
高级植物生理实验报告2014 年12 月28 日
植物同工酶凝胶电泳实验
一、实验目的和意义
同功酶专指受遗传体系决定的酶的不同分子形式。
从作用上看，分子形式不同的酶能做一样的工作，即催化同样的生化反应，所以把同功酶改称为同工酶。
由于蛋白质分子的结构归根结底是由基因的DNA分子结构决定的，因此，同工酶就成为鉴定生物基因型是否有差别的可靠指标，在遗传育种，生长发育，物种起源，生理卫生等领域的研究中成为一种重要的工具；此外，同工酶还与植物抗性有一定联系，可用来鉴定抗性的强弱。
本实验的实验目的主要是让学生掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物同工酶的原理及方法、步骤。
提高学生的实际操作及动手能力。
培养学生对实验结果的分析能力。
二、实验原理
带电粒子在电场中向带有相反电荷的电极移动，叫做电泳。
在一定的pH条件下，每一种分子都具有一定的电荷、大小与形状，在相同的电场经一定时间的电泳，便会集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。
不同组分的蛋白质（包括同工酶）分子组成、结构、大小、形状均有所不同，在溶液中所带的电荷多寡不同，在电场中的运动速度也不同。
因此经过电泳便会分成不同的区带。
然后用适当的染料着色，这样就可以在凝胶上展现出蛋白质或同工酶的谱带。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法。
它是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶。
当Acr和Bis遇到自由基时，便能聚合。
Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。
三、材料
不同品种的燕麦
四、实验器材与试剂
1.器材：电泳仪一套（稳压电源，垂直电泳槽和凹槽玻璃）；台式高速离心机；烧杯；微量进样器；注射器；皮头滴管；刻度吸；培养皿（染色用）。
2.试剂：丙烯酰胺（Arc）；甲叉丙烯酰胺（Bis）；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵（AP）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；甘氨酸（Gly）；琼脂粉；溴酚蓝；甘油；联苯胺；醋酸；α-醋酸萘酯；β-醋酸萘酯；牢蓝RR盐；冰醋酸。
3.试剂的配制：见表1
五、实验步骤
1．样品的提取
称取1g不同处理的材料，加入少量提样缓冲液，置冰浴研磨成匀浆后定容至5ml，8000rpm离心6min，取上清液贮于冰箱备用。
2．凝胶制备：
（1）取电泳玻板，用去污剂洗净，蒸馏水冲洗，直立干燥。
洗净的玻板内面要避免手指触摸以防沾污。
将玻板安装到电泳槽上。
用电极缓冲液配制1.5%琼脂胶，沸水浴加热至琼脂完全溶化后，用皮头滴管沿板上部灌入两侧的封胶空隙，注意不要产生气泡。
20分钟后凝固。
（2）按照表1中的A液：B液：水：C液=1：2：1：4的比例配置凝胶，混匀后用一细玻棒引流，缓缓注入胶室中，注胶过程防止气泡产生。
胶液加到与凹槽相平时停止，插入预先选择好的样品梳，注意不要带入气泡。
（本实验为A液：B液：水：C液=2.5：5：2.5：10）3.点样及电泳：
（1）向上下槽注入电极缓冲液，取下样品梳（不要拉断样槽隔墙）。
将少许提取液与溴酚蓝指示剂混合。
用微量进样器针头插入样槽下部慢慢进样。
每槽点样30μl。
（2）上槽接负极，下槽接正级，接通电源，电流调至15~20mA，电压为200V，电泳至溴酚蓝标志到达凝胶前沿1 cm处，将电流、电压调至零后断电。
（3）电泳结束后，取下玻板，将两块玻板置自来水龙头下，借助水流，用解剖刀柄轻轻从板侧缝间撬开玻板（注意切忌从凹槽处撬），将胶放入染色液中。
4.染色：
（1）过氧化物酶染色联苯胺贮存液16ml（2g联苯胺溶于18ml文火加热的冰醋酸中，再加水72ml），0.6%过氧化氢16ml，水48ml。
将胶板浸入此液中，待出现兰色条带后，弃去
染色液用水洗涤保存。
（2）酯酶同工酶显色称取30mg α-醋酸萘酯，30mgβ-醋酸萘酯，50mg坚牢蓝RR（或坚牢蓝B），先用约4ml丙酮溶解，再用0.1mol/L pH6.5的磷酸缓冲液稀释到60ml，将胶板浸入此液中，室温下显色约20min，可看到桃红色的磷酸酯酶同工酶区带。
弃去染色液，用蒸馏水漂洗，再用7%HAC固定。
5.结果保存：
将脱过色的凝胶按照颜色深浅绘成的谱带图作为实验报告的凭证。
表1 试剂配方
２染色液的配制
A液：称取0.4g联苯胺，加入３ml冰醋酸，溶解后加入１７ml蒸馏水随用随配
B液：4% NH4Cl
C液：5% EDTA(PH6.0)
D液：0.3% H2O2
按A：B：C：D＝1：1：1：８比例配制
实验结果与分析：
从图2中可以清晰的看到经过染色后分为明显的A、B两区，A区有四条带，B区有三条带，带与溴酚蓝指示剂呈现的蓝色条带的距离为9cm，算出A区的迁移率分别为0.11,0.056，0.078,0.056.B区的迁移率分别为0.033,0.044,0.056.大燕1号与白燕7号品种间有明显的差异，大燕1号出现3条带，白燕7号有2条带。
图1
图2。