黄瓜细菌性角斑病菌的分离与鉴定

Isolation and Identification of the Pathogen of Cucumber Angular Leaf Spot
ZH ANG Jiguang, CH EN L u, ZH A NG Guanqu, H U Xiaoping and WA NG Baot ong
( College of Plant Prot ection, N ort hw est A & F U n iversit y, S haanxi K ey Laborat ory of M olecular Bi ol ogy f or A gri cult ure, Y angling Shaanxi 712100, C hina)
发病率= 调查病叶数 / 调查总叶片数 ∀ 100% 病情指数 = [ # ( 病级叶 片数 ∀ 该级别值 ) / ( 调查总叶片数 ∀ 发病最高级别值 ) ] ∀ 100 1. 4 病原菌分离与革兰氏染色 按 Koch s 证病律要求安排试验。采用常规 组织分离方法, 从黄瓜标样中取得分离菌的纯培 养物 , 选取具有代表性的 CP001 菌株供测试用。 在黄瓜 4 叶期使用无菌水配制细胞悬浮液 , 采用 金刚砂摩擦法接种, 接种后保湿 24 h, 黄瓜植株 在( 24 ∃ 2) , 光周期为 16 h 条件下培育。待接 种植株发病后, 进行病原物再分离 , 并与接种菌相 比较。采用参考文献 [ 4] 的方法进行革兰氏染色。 1. 5 病菌 16S rDNA 的扩增、 克隆与测序 将分离到的 CP 001 菌株接种到 200 m L L B 、 130 r/ m in 摇培 16 h, 3 000
* 收稿日期 : 2010 03 18
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材料与方法
材料与试剂 试验所用黄瓜病株标样采自陕西杨凌。 T aq
po lymerase 、 EDT A 、 SDS 、 巯基乙醇等分子生物 学试剂及 pM D18 T Vect or 购自 T aKaRa 公司, MagEx t ract or DNA 纯化试 剂盒购 自 T OYOBO 公司。其他试剂购自国内各生物化学与生物技术 公司。引 物 EU 8F ( 5! A GAGT T T GAT CCT G GCT CAG 3!) 和 EU1389R ( 5! ACGGGCGGT GT GT ACAAG 3!) 由上海 Sang on 公司合成。黄
特点 Ch aract erist ics
病害级别 G rade 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 未发病 N o occurrence
少数针头大小水浸状斑点 Few needl e ti p and soak ing spot 病斑占叶片面积 3% ~ 8% , 没有失绿 Lesion area of l eaf is 3% - 8% , no discol orat ion 病斑占叶片面积 8% ~ 15% , 没有失绿 Lesion area of l eaf is 8% - 15%, no discol orat ion 病斑占叶片面积 15% ~ 25% , 呈黄褐色 Lesion area of leaf is 15% - 25% , t an l esion 病斑占叶片面积 25% ~ 50% , 穿孔 Lesion ar ea of l eaf is 25% - 50% , perf orat ion 病斑占叶片面积 50% ~ 75% , 穿孔有菌浓溢出 Lesion area of leaf is 50% - 75% , perf orat ion and bact eria overf low 病斑占叶片面积 75% ~ 87% , 穿孔有菌浓溢出 Lesion area of leaf is 75% - 87% , perf orat ion and bact eria overf low 病斑占叶片面积 87% ~ 95% , 穿孔有菌浓溢出 Lesion area of leaf is 87% - 95% , perf orat ion and bact eria over fl ow 病斑占叶片面积 100% L esion area of l eaf is 100%
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( pH 7. 0) 接入 500 L 菌液 ( OD600 = 0. 6) , 分别 于 10、 15、 22、 29 、 36 h, 用分光光度计 ( 上海光谱 721 型 ) 测定 600 nm 处的吸光值, 设不接菌培养液为对照。 在 pH 为 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 、 11 的 100 mL 液体 LB 培 养 液 中 接 入 500 L 菌 液 ( OD600 = 0. 6) , 于 28 120 r/ min 震荡培养 24 h, 用分光 光度计( 上海光谱 721 型) 测定 600 nm 处的吸光
序。 1. 6 序列分析 将菌 株 CP 001 的 16S rDNA 序 列 与 Gen Bank 中已登录的黄瓜角斑病菌及近缘种 的 16S rDNA 序列 进行比对 , 用 MEGA v ersion 4. 1 中 的 M CL ( M ax imum Com po sit e L ikeliho od) 法计 算进化距离, 用 N J( Neighbo r Joining) 法和 Bo ot st rap 法产生 1 000 个 聚类树 , 按照 多数 规则法 ( M ajor it y rule) 得到一个最% 逼真& 的聚类树。 1. 7 生理生化指标测定 参照 R. Buonaur io 的 方 法[ 6 7] 测定 糖 类发 酵、 乙酰甲基醇、 甲基红、 吲哚、 淀粉水解、 硝酸还 原、 明胶液化、 氧化酶、 硫化氢的产生等指标。 1. 8 温度及 pH 对病菌生长的影响 在盛有 100 m L L B 液体培养基的三角瓶中 , 120 r/ min 震 荡培养 24
修回日期 : 2010 04 06 基金项目 : 高等学校学科创新引智计划 ( B07049) ; 教育部新世纪优秀人才支持计划 ( N CET 07 0698) 资助。 第一作者 : 张吉光 , 男 , 硕士研究生 , 主要从事植物病理学研究。 E mail: jgzh ang2009@ h ot mail. com 通讯作者 : 胡小平。 E mail: xphu @ nw suaf. edu. cn
Abstract: Cucumber ang ular leaf spot is an import ant disease in cucum ber product ion in Shaanx i. T he incidence of cucumber caused by Pseudomonas syr i ngae w as over 50% . T hrough t issue plat ing and Koch s pust ule met hods, one pat hog en w as isolat ed f rom diseased cucumber plant in Yangling of Shaanx i pro vince. T he pathog en w as identif ied as Pseudomonas sy r inge str ain CP 001 based on mo r pholog ical char act erist ics, cult ur al physiolog ical and chemical charact erist ics, and t he sequence o f 16S ribo som al DNA. Bio logical characteristics of st rain CP001 had been preliminar ily st udied. Results show ed that opt im al pH w as 6- 8, and t em perature w as 22- 29 . Key words: Cucumber ang ular leaf spot; P seudom onas syr i ngae ; Pat ho gen ident ification; 16S rDNA 黄瓜细菌性角斑病是世界范围内黄瓜生产中 的重要病害之一, 主要危害叶片、 果实, 造成叶片 干枯 , 果实腐烂 , 严重时损失达 50% ~ 60% , 甚至 绝收。该病 近年 来在 欧洲 大发 生, 造 成严 重减 产 。黄瓜细菌性角斑病在中国东北、 内蒙古、 华 北及华东 普遍发生 , 是 保护地黄瓜的 重要病 害, 近年来中国黄瓜细菌性角斑病有逐渐加重的 趋势。20 世纪 50 年代 , 该病害在中国就有发生 记载 , 但后续研究报道较少。本文开展病原菌 生物学特性及分子鉴定方面的研究, 现将研究结 果报道如下。
2008- 2009 年分别在陕西杨凌、 咸阳、 西安、 宝鸡等地进行黄瓜细菌性角斑病调查 , 每地随机 选取 5 个温棚 , 在每个温棚中采用大五点取样法, 每个样点调查 50 株 ( 5 行 ∀ 10 株) , 按病害分级标 准详细记载发病情况 ( 表 1) , 计算发病率和病情 指数。
表 1 黄瓜细菌性角斑病 分级标准 Table 1 Grading standards of cucumber angular leaf spot
摘
要 : 黄瓜细菌性角斑病是黄瓜生产中的重要 病害之一 , 在陕 西的危害严 重 , 发 病率在 50% 以上。本 研究
采用常规组织分离法和柯 赫氏证病律从杨凌 地区黄瓜细菌性角 斑病标样中分离到 1 株病原菌 , 结合形态学、 生理 生化指标及 16S rDN A 序列分析 , 鉴定为丁香假单胞杆 菌 ( P seudo monas sy r inge str ain) CP 001。初 步确 定适合丁香假单胞杆菌 CP001 菌株生长的最佳 pH 为 6~ 8, 最适温 度为 22~ 29 关键词 : 黄瓜细菌性角斑病 ; 丁香假单胞杆菌 ; 病原菌鉴定 ; 16S rDN A 中图分类号 : S436. 421 文献标识码 : A 文章编号 : 1004 1389( 2010) 12 0183 05 。